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－SOS－如何解释这个头疼的免疫组化染色结果？
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这个帖子发布于10年零363天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
请问各位大虾，我的目的蛋白主要存在于胰腺腺泡细胞核内（如果胰腺腺泡细胞里有的话），但免疫组化染色结果是：1.所有腺泡细胞核内无半点棕色；2.活的腺泡细胞浆呈蓝色，坏死或即将坏死的（从核的变化粗略地判断）腺泡细胞浆呈均匀的棕色；3.使得一个个蓝色细胞和一个个棕色细胞分界十分清楚；4.纤维结蒂组织呈均匀的棕色；关键是前人已证实我的目的蛋白在细胞坏死时会释放到胞外。请问如何解释上述结果？？？？有人说上述均匀的棕色是阳性，有人说不是。先行谢过了！！！！！
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用DAB染色的话，阳性信号应该是棕色的呀，你能确信的一抗是好的吗？定位不准往往是一抗的原因
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均匀的棕色也算吗？
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我觉得你的不应该是算是信号，应该是非特异性着色，因为坏死的组织往往有比较深的背景。再说你的间质质之中也有背景。
请教:免疫组化最后的染色结果如何量化?急!
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免疫组化最后的染色结果如何量化?急!
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●免疫组化的概念
是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂&(荧光素、酶、金属离子、同位素)&显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。&
●免疫组化的分类
免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。
●免疫组化实验所用的组织和细胞标本
实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
●免疫组化实验所用的抗体
免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。&
●免疫组化常用的染色方法
根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素—抗生物素染色法最常用。&
●免疫组化操作步骤
一&免疫组化（&LP&法）操作步骤&：&
1．&切片常规脱蜡至水。如需抗原修复，可在此步后进行&
2.&缓冲液洗&3min/2&次。&
3.&为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色&,&将切片放在&Hydrogen&Peroxide&Block&中孵育&10-15&分钟。&
4.&缓冲液洗&5min/2&次。&
5.&滴加&Ultra&V&Block&，&在室温下孵育&5&分钟以封闭非特异性的背景染色。&
（注：孵育不要超过&10&分钟，否则会导致特异性染色降低。如果一抗的稀释液中含有&5&－&10%&正常羊血清，这一步可以省略。）&
6.&缓冲液洗&5min/2&次。&
7.&滴加一抗工作液&37&℃孵育&1&－&2&小时。（具体孵育时间和温度由试验者最终决定）&
8.&缓冲液洗&5min/2&次。&
9&．&滴加&Primary&Antibody&Enhancer(&增强子&)&,&在室温下孵育&20&分钟。&
10&．缓冲液洗&5min/2&次。&
11&．滴加&HRP&Polymer(&酶标二抗&)&，在室温下孵育&30&分钟。&
（注：&HRP&Polymer&对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。）&
12&．缓冲液洗&5min/2&次。&
13&．向&1ml&DAB&Plus&Substrate&(&或&AEC&Plus&Substrate)&中滴加&1-2&滴&DAB&Plus&Chromogen&（或&AEC&Plus&Chromogen&）&,&混匀后滴加到切片上，孵育&3&－&15&分钟。（具体时间由染色深浅决定。）&
14&．自来水充分冲洗&,&复染，脱水&,&透明&,&封片。&
二．免疫组化&(&三步法&)&操作步骤&：&
（&1&）、石蜡切片脱蜡至水。&
（&2&）、&3%H&2&O&2&室温孵育&5-10&分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。&
（&3&）、蒸馏水冲洗，&PBS&浸泡&5&分钟&x2&（如需抗原修复，可在此步后进行）。&
（&4&）、&5-10%&正常山羊血清（&PBS&稀释）封闭，室温孵育&10&分钟，倾去血清，勿洗。滴加&一抗&工作液，&37&℃&孵育&1-2&小时或&4&℃&过夜。&
（&5&）、&PBS&冲洗，&5&分钟&x3&次。&
（&6&）、滴加适量&生物素标记二抗&工作液，&37&℃&孵育&10-30&分钟。&
（&7&）、&PBS&冲洗，&5&分钟&x3&次。&
（&8&）、滴加适量的&辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素&工作液，&37&℃&孵育&10-30&分钟。&
（&9&）、&PBS&冲洗，&5&分钟&x3&次。&
（&10&）、显色剂显色&3-15&分钟（&DAB&或&NBT/BCIP&）&
（&11&）、自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。&
三.&冰冻切片免疫组化染色步骤：&
冰冻切片&4-8um&，室温放置&30&分钟后，入&4&℃丙酮固定&10分钟，PBS洗，5分钟x3，用过氧化氢孵育5-10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
●免疫组化实验结果的判定和分析
从实验结果而言，免疫组化技术服务主要涉及抗体实验结果的描述与分析，图片的确定与选取，相关数据的提供，上述工作是免疫组化工作的重点内容，只有严格的实验设计，标准的实验操作，专业化的结果分析才能更好的满足客户的要求，这点对于形式为腹水，上清，培养液之类的抗体显得更为重要。关于上述服务内容应该在实验开始前由双方明确，一般而言，客户方实验前应提出需要什么样的结果与分析，例如是简要还是详细的描述实验结果，需要实验数据否，图片的数量与规格等。如果为双盲试验或有第三方参与，则事先申明。&
●免疫组化在临床工作的意义
近年来，随着免疫组织化学技术的发展和各种特异性抗体的出现，使许多疑难肿瘤得到了明确诊断。在常规肿瘤病理诊断中，5%-10%的病例单靠H.E.染色难以作出明确的形态学诊断。尤其是免疫组化在肿瘤诊断和鉴别诊断中的实用价值受到了普遍的认可，其在低分化或未分化肿瘤的鉴别诊断时，准确率可达50%-75%。&
免疫组织化学的临床应用主要包括以下几方面：
(1)恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断；&
(2)确定转移性恶性肿瘤的原发部位；
(3)对某类肿瘤进行进一步的病理分型；
（4）软组织肿瘤的治疗一般需根据正确的组织学分类，因其种类多、组织形态相像，有时难以区分其组织来源，应用多种标志进行免疫组化研究对软组织肿瘤的诊断是不可缺少的；
（5）发现微小转移灶，有助于临床治疗方案的确定，包括手术范围的确定。
（6）为临床提供治疗方案的选择。&
1楼 19:22&|
2楼 20:48&|
希望楼主能讲解一下两步法的精髓和奥秘！！
3楼 23:06&|
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本人做了一个月的，验证蛋白质2-D筛查的分子，摸了不少一抗浓度，最初1：00、1：3000，做的结果是目的分子在癌组织中比正常组织表达阳性要强，跟2-D筛查的结果相反，随着一抗浓度的稀释，现在做到了1：8000，跟最初的结果相反了，正常的比癌的阳性强，除了换了DAB以外，其他的条件都差不多，实在想不明白，请各位大侠指点指点，在下感激不尽！
1楼 10:28&|
做一抗很少有稀释到1：8000的，稀释到1：1000就已经够稀的了。2-D与免疫组化有误差是正常的，要不为啥用免疫组化验证呢？
2楼 11:04&|
快试试吧，可以对自己使用挽尊卡咯~◆◆
吧主，我的一抗用的是abcam的鼠单抗，我做到1：20000还有阳性结果，说明书上推荐的稀释浓度是1：23000，我就是来验证的，相反也就相反吧，但是无法解释结果颠倒的问题，很是头痛
3楼 09:19&|
抗体浓度过大、过小结果都不可靠，甚至做不出或作出相反的结果，建议按说明书的要求做。
4楼 18:36&|
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