复杂多并指(趾)畸形遗传定位及致病突变分析视网膜母细胞瘤中RB1基因致病突变检测
优秀研究生学位论文题录展示复杂多并指(趾)畸形遗传定位及致病突变分析视网膜母细胞瘤中RB1基因致病突变检测专　业: 遗传学关键词: 三节指节拇指 多并指综合征 遗传标记 遗传性视网膜母细胞瘤 RB1基因突变分类号: R682.150.232.5　
R730.231形　态: 共 108 页　约 70,740 个字　约 3.384 M内容阅　读:
内容摘要非综合征型并指(趾)畸形是人类最常见的肢端畸形，多呈常染色体显性遗传。Temtamy与McKusick按临床表现将非综合征型并指(趾)分为五型。其中Ⅳ型并指(syndactyly type Ⅳ，SD4；MIM186200)又称Haas型并指，主要表现为双侧完全性皮肤并指，多伴有第6根掌骨及手指多指现象，常常由于筋腱挛缩整个手呈杯状结构，但不存在骨性融合；通常下肢受累较轻，偶见伴发胫侧半肢畸形。三节指节拇指――多并指综合征(triphalangeal thumb-Polysyndactyly syndrome，TPTPs；MIM174500)是一种呈常染色体显性遗传的肢端畸形，表现为在第1指即大拇指的位置出现一个或多个具有三节指节的类似大拇指结构，同时存在第3―5指全并指或第4―5指并指，而第2指往往受累较轻；通常下肢受累较轻。
在胚胎早期肢端发育过程中，极化活性区(zone of polarizing activity，ZPA)分泌的Shh蛋白决定了指趾数目及形态，而人类SHH基因位于染色体7q36区域。人类染色体7q36区域与肢端发育密切相关，目前定位于此的肢端畸形有：轴前多指\三节指节拇指(preaxial polydactyly\triphalangeal thumb，PPD\TPT；MIM174500)，TPTPS，SD4及胫侧半肢―多并指―三指节拇指综合征(tibial hemimelia-Polysyndactyly-Triphalangeal thumbs syndrome，THPTTS；MIM188770)，无手足畸形(acheiropodia，ACHR；MIM200500)，肢胸综合征(acropectoral syndrome，ACRPS；MIM605967)。其中PPD\TPT，TPTPS及THPTTS都存在三指节拇指的表型。有趣的是，1999年，Heus等人将PPD\TPT致病基因的关键区域缩小到450kb并排除了SHH基因。Lettice等通过比较基因组和转基因动物的遗传定位分析实验发现，此区域内Lmbr1\C7orf2(limb region 1)基因第5内含子中存在大约800bp的ZPA调控序列(ZPA regulatory sequence，ZRS)，在它控制下的LacZ报告基因在肢芽后缘ZPA区域有特异性表达。随后，研究人员在8个人类PPD\TPT家系受累个体，3个PPD突变鼠模型及3个携带多趾表型的猫的ZRS内发现了不同的点突变，证实了ZRS作为SHH增强子在PPD\TPT中的致病作用。在一个泰国TPTPS家系中，TPTPS表型患者、SD4伴胫侧半肢畸形表型患者共存的事实提示，TPT、TPTPS、SD4和THPTTS可能有着相似的遗传致病机制。
拷贝数变异(copy number variation，CNV)是指基因组中>1kb的DNA片段存在拷贝数目变化的现象，通常包括插入、缺失和重复。研究发现，CNV在基因组中普遍存在，与每300bp就可出现一次的单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism，SNP)相比，CNV所涉及的DNA序列范围更为广泛，大概覆盖12%的人类基因组的序列。CNV与人类疾病发生密切相关，当基因组中由于CNV的存在，引起一些剂量敏感基因发生缺失、重复或者结构完整性破坏时，就会导致基因组疾病(genomic disorder)的发生。
本研究以6个中国人TPTPS\SD4家系为对象，家系1的患者具有典型的TPTPS手部畸形，家系2、3、4、6中TPTPS\SD4表型并存，家系5表现为典型的SD4。针对7q36区域，在4个家系中进行两点连锁分析，结果当θ=0时，在位于LMBR1基因内的遗传标记TG处获得最大累计LOD值为17.32，其中家系1为9.52，家系2为3，72，家系3为2.65，家系4为1.43，肯定连锁。首次在中国人TPTPS\SD4家系中确认了TPTPS\SD4致病基因定位于染色体7q36。通过单倍型分析将TPTPS\SD4致病基因定位至微卫星标记AGAA至AATT之间约647kb、不包含SHH基因的范围内。
前期工作中，对TPTPS\SD4连锁区域内的候选基因及10个物种间高度保守的非编码序列(包括ZRS)进行测序，结果没有发现致病性序列改变。本研究中，通过回顾分析测序图谱，发现患者当中位于高度保守非编码区4内和ZRS内的两个SNP(rs，rs)存在等位基因不平衡现象；对更多患者和家系内正常个体的测序结果显示，该现象与疾病表型共分离，提示在该区域内可能存在与TPTPS\SD4相关的DNA拷贝数增加。通过实时定量PCR分析发现6个TPTPS\SD4家系中都存在ZRS拷贝数增加，并应用荧光原位杂交技术直接在患者间期核中观察到了该段DNA重复现象。Ssq小鼠的转基因插入位点也存在包含鼠ZRS在内的24kb的DNA重复，进一步证明了ZRS拷贝数增加的致病性。
本研究在647kb的TPTPS\SD4连锁范围内，综合运用实时定量PCR技术和Affymetrix SNP 6.0芯片，对家系1―6患者的重复突变断端边界进行了精细定位，并据此成功克隆了家系1、3和5的断裂接合片段。根据以上分析，家系1、3、5患者的重复突变范围确定为:144859bp、216761bp和324189bp；而家系2、4、6患者的DNA最小重复范围约为379kb、294kb和398kb。
分析家系1、3、5患者重复突变断端区域基因组序列及结构特征，提出家系1患者重复突变的形成机制可能是非等位基因同源重组(nonallelic homologous recombination，NAHR)和非同源断端连接机制(nonhomologous end―joining，NHEJ)或复制叉停顿和模板转位机制(fork stalling and template switching，FosTes)。家系3和家系5患者重复突变的形成机制可能是非同源断端连接机制(nonhomologous end―joining，NHEJ)。
总之，本研究在6个中国人TPTPS\SD4家系中确认了TPTPS\SD4致病基因位于染色体7q36区域一个约647kb的区间内；发现TPTPS\SD4致病突变是包含ZRS在内的DNA重复突变；患者表型严重程度与重复片段大小无直接关系；基于对本研究中6个TPTPS\SD4家系中患者表型的分析及分子遗传学发现，结合文献分析，提出PPD\TPT、TPTPS、SD4和THPTTS是一个连续的表型谱的概念。
RB1(Retinoblastoma 1，RB1；MIM 180200)基因突变是视网膜母细胞瘤发生中的起始基因缺陷。视网膜母细细胞瘤分遗传性和非遗传性两种，几乎所有的双侧和家族性患者都是遗传性视网膜母细胞瘤。只有15%的单侧视网膜母细胞瘤患者是遗传性的，其余都是非遗传性的散发病例。遗传性视网膜母细胞瘤患者携带生殖系RB1基因突变，RB1基因生殖系突变的检测有助于遗传性视网膜母细胞瘤患者的确认和其高危亲属中携带者的检出，从而提供相应的遗传咨询。迄今，已发现了近600种来自不同种族背景的RB1基因突变，根据一项RB1基因突变的meta分析报告，来自中国人群的突变仅有22种。
本研究中，首先应用变性高效液相色谱(High-Performance Liquid Chromatography，DHPLC)或高分辨熔解曲线分析(High Resolution Melting，HRM)做为初筛工具，结合测序验证，对31名中国汉族视网膜母细胞瘤患者进行了RB1基因外显子及邻近内含子区域的微小缺陷(micro―lesion)的突变筛查。对于在上述筛查中的阴性个体，进行了多重连接探针扩增分析(multiple ligation probe amplification，MLPA)，对RB1基因外显子或包含整个RB1基因的拷贝数变异进行检测。对基因组DNA水平上RB1基因突变检测阴性个体，进行了转录本分析，检测存在于内含子当中的剪接位点突变或大的重组造成的剪接改变。
在19名遗传性视网膜母细胞瘤患者中发现了18种RB1基因突变，其中10个为国际首报。本研究发现的新突变包括6个移码突变(p.Leu647HisfsX10，p.Asn598LysfsX13，p.Gly310ValfsX6，p.Glu746GlyfsX3，p.Ser393LysfsX2，p.Va1314PhefsX2)，一个通过外显子跳跃导致提前出现终止密码(p.Thr841X)的剪接位点突变(c．2663+1G>A)，2个包含整个RB1基因的缺失突变，缺失范围分别约为3Mb和10Mb；另外，在RNA水平上检测到一个RB1基因15、16和17外显子缺失突变(p.Glu464_Ser565del)，但造成这一剪接异常的DNA水平上的突变仍未确定。通过RB1基因检测，为31个家庭提供了遗传咨询：并通过检测绒毛、羊水或脐血DNA中的RB1基因突变，为12名孕妇进行了产前基因检测，检出1例携带RB1基因突变的胎儿。
综上，本研究丰富了中国人的RB1基因突变谱。经实践证明，利用多种方法组合进行RB1基因突变筛查的策略灵敏有效，在19名遗传性视网膜母细胞瘤患者中RB1基因突变检出率达到100%，从而使RB1基因突变筛查有可能成为视网膜母细胞瘤患者的医疗方案的一个组成部分..……
全文目录文摘英文文摘论文说明：英文名词及缩写论文一复杂多并指(趾)畸形遗传定位及致病突变分析1.
实验材料2.1.
主要仪器设备2.2.
主要试剂2.3.
TPTPS／SD4家系资料2.4.
分析软件，常用的网址3.
实验方法3.1.
TPTPS家系致病基因的定位研究3.2.
候选区域内SNP等位基因不平衡研究3.3.
实时定量PCR3.4.
荧光原位杂交技术验证DNA重复突变3.5.
应用Affymetrix SNP 6.0 array进行断端边界精细定位3.6.
使用Gap-PCR进行重复突变断裂接合片段克隆3.7.
重复突变断裂接合片段分析4.
实验结果4.1.
中国人TPTPS和SD4家系表型分析4.2.TPTPS／SD4致病基因的定位研究4.3.
SNP等位基因不平衡研究4.4.
实时定量PCR检测结果4.5.
荧光原位杂交技术验证重复突变结果4.6.
应用Affymetrix SNP 6.0 Array进行断端边界精细定位结果4.7.
重复突变断裂接合片段分析5.
定位于人类染色体7q36的肢端畸形5.2.
中国人TPTPS／SD4家系致病基因定位及初步突变筛查5.3.
定位于7q36区域肢端畸形的分子遗传学研究5.4.
重复突变范围与表型的关系5.5.
重复突变范围的确定及断裂接合片段的克隆5.6.TPTPS／SD4家系致病重复突变发生机制初步探讨6.
参考文献论文二视网膜母细胞瘤中RB1基因致病突变检测1.
实验材料2.1.
家系临床资料2.2.
仪器设备2.3.
主要分析软件2.4.
主要试剂2.5.
突变查新数据库3.
实验方法3.1.
血液样品的采集3.2.
RB1基因DNA水平突变检测3.3.
RB1基因转录本水平突变检测3.4.
RB1基因突变体细胞嵌合体的检测3.5.
RB1基因突变的验证3.6.
高危胎儿的产前诊断4.
实验结果4.1.
RB1基因的突变筛查结果4.2.
RB1基因突变体细胞嵌合体检测结果4.3.
RB1基因突变的验证4.4.
产前诊断结果5.
RB1基因生殖系突变检测策略5.2.
RB1基因突变谱分析5.3.
基因型表型关系6.
参考文献文献综述RB1基因突变检测方法及突变谱研究现状
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眼科遗传性疾病诊断项目基因
眼科遗传性疾病基因诊断项目一、项目概述眼科遗传性疾病是临床上常见且危害严重的遗传性致盲疾病，主要包括各种类型的先天性青光眼、先天性、视网膜色素变性(Retinitis pigmentosa, RP)，雷伯氏先天性黑曚(Leber congenital amaurosis, LCA)，先天性静止性夜盲(Congenital stationary night blindness, CSNB)，卵黄样黄斑营养不良(Vitelliform macular dystrophy, VMD)，Stargardt病(Stargardt macular dystrophy, STGD)，家族性渗出性变（(Familial exudative vitreoretinopathy，FEVR），视神经萎缩（Optic atrophy），视网膜母细胞瘤（Retinoblastoma，RB）、视网膜霹雳(retinoschisis，RS)、视网膜毛细血管扩张症（Retinal Telangiectasis）又称Coats病，脉络膜视网膜萎缩（Chorioretinal atrophy or degeneration）等；还有一些以综合征的形式表现出来，如Usher综合征(Usher Syndrome，USH)和Bardet Biedl综合征(Bardet Biedl Syndrome, BBS)等。眼科遗传性疾病是世界范围内工作年龄人群中的第一位致盲眼病。眼科遗传性疾病特别是遗传性（IRDs）具有高度的临床异质性和遗传异质。同种疾病可有多种不同的临床表型，如RP除典型RP表现外，还可表现为如无色素性RP、环状RP、扇形RP及单眼RP等多种特殊类型；不同疾病的表型之间可有一定的相似性和交叉性。同时，IRDs涉及多种遗传模式、具有明显的遗传异质性，其遗传模式非常复杂，遗传模式有常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传或X连锁隐性遗传等。例如大约的15-20%视网膜色素变性表现为常染色体隐性遗传模式（Autosomal recessive RP,ARRP），20- 25%的病人表现为常染色体显性遗传模式（Autosomal dominant RP, ADRP），10-15% 的病人则表现为X染色体连锁模式（X-linked RP, XLRP），极少数病例表现为双基因模式（RDS和ROM基因同时杂合突变）和线粒体遗传方式。除典型的家族发病之外，散发病例约占全部RP患者的30%。研究发现眼科遗传性疾病的分子遗传病因异常复杂，如与IRDs相关的基因编码的蛋白涉及到包括视觉信号转导、视紫红质循环周期、光感受器结构、光感受器细胞转录调控等。每一种基因又往往存在多种致病突变，除了突变的多样性以外，同一个基因上不同的突变往往引起了不同的疾病，例如，RHO基因（编码视杆细胞视紫红质的基因）上的不同突变可能引起常染色体显性遗传RP，或常染色体显性遗传的先天性静止性夜盲，或罕见的常染色体隐性遗传RP。RDS基因（编码外周蛋白的基因）突变可能引起常染色体显性遗传RP、常染色体显性遗传黄斑变性或双基因RP。RPE65基因突变就可引起Leber先天性黑曚和RP两种不同类型的疾病。而各种IRDs疾病的临床表型类似，依据临床表现及临床症状区分各种IRDs疾病非常困难，很多IRDs疾病不能临床确诊。对IRDs患者进行分子诊断显得尤为必要。二、基因诊断的必要性：迄今尚无有效的眼科遗传性疾病的防治手段，因此现阶段对病人仍以咨询方式或对症治疗服务为主， 眼科遗传性疾病无法用超声、磁共振等影像学手段在产前阶段检出，且有些直到成年甚至晚年才发病；而一旦发生病变，就面临不可逆的视力下降甚至失明。由于该病迟发性的特点，很多患者在疾病确诊时已经结婚生子，此时多已将致病基因传给下一代。这给患者的家庭带来极大的精神压力和经济负担，疾病成为家族中挥之不去的阴影。由于眼科遗传性疾病目前尚无有效治疗方法，因此及时对眼科遗传性疾病有发病风险的成员进行症状前基因诊断，尤其是对高风险胎儿或胚胎进行产前诊断及植入前遗传学诊断是控制其发生和发展的关键。已经进行了基因确诊的家系，考虑生育的夫妇可通过遗传咨询门诊进行咨询，做好产前诊断的必要准备，可通过产前诊断明确胎儿是否携带致病基因，从而使夫妇获得选择的可能。针对眼科遗传性疾病的基因诊断可提高眼科遗传性疾病早期发现率，结合产前诊断可降低其发生率和致残率。三、检测及报告时间&&& 1.检测前必须由患者在分子遗传中心签署《知情同意书》；&&& 2.从接受标本之日开始，40个工作日内给出报告。四、标本的采集与保存&&& 8ml静脉血于EDTA钾抗凝管(紫头管)中，轻轻颠倒混匀，密封，4℃保存，72小时内送检。五、产前诊断中心遗传咨询门诊联系方式联系人：杨季云联系电话：地址：四川省医学科学院●四川人民医院产前诊断中心（老内科楼六楼）&&&&&&
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先天性视网膜劈裂症基因突变分析
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3秒自动关闭窗口香港医院做无创产前检测费用,怀孕多久可做无创dna发布时间： 17:36:54
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