单克隆抗体 _百度百科
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动物脾脏有上百万种不同的B淋巴系选择性表达出不同的B淋巴细胞合成不同的当机体受刺激时抗原分子上的许多决定簇分别激活各个表达不同基因的被激活的B增殖形成浆细胞和记忆B细胞大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液体液中如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养就可得到由单细胞经分裂增殖而形成即单克隆单克隆细胞将合成针对一种的抗体称为单克隆抗体
单克隆抗体
由单一克隆产生的高度均一仅针对某一特定抗原表位的抗体称为单克隆抗体通常采用杂交瘤技术来制备1975年分子生物学家G.J.F.和C.在杂交技术的基础上创建立他们把可在体外培养和大量增殖的骨髓瘤细胞与经免疫后的纯系小鼠B细胞融合成为杂交既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性又具有形成细胞的合成和分泌抗体的特点将这种杂交瘤作单个可形成单细胞系即单克隆利用培养或小鼠腹腔接种的方法便能得到大量的高浓度的非常均一的抗体其结构顺序特异性等都是一致的而且在培养过程中只要没有不同时间所分泌的抗体都能保持同样的结构与机能这种单克隆抗体是用其他方法所不能得到的
这项新技术从根本上解决了在抗体制备中长期存在的特异性和可重复性问题可用于探讨①蛋白质的精细结构②淋巴细胞亚群的表面新③相容性抗原④和的放射免疫或酶免疫分析⑤的定位和分类⑥纯化和寄生虫抗原⑦免疫治疗和与药物结合的-化学疗法 (导弹疗法,利用单克隆抗体与特异性结合将药物带至病灶部位因此单克隆抗体可直接用于人类疾病的诊断预防治疗以及免疫机制的研究为人类的免疫诊断与免疫治疗开辟了广阔前景1免疫动物 免疫动物是用目的抗原免疫小鼠使小鼠产生致敏B淋巴细胞的 过程 一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠按照预先制定的免疫方案进行免疫注射 抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官刺激相应B淋巴细胞克隆使其活化增殖并分化成为致敏B淋巴细胞
2细胞融合 采用二氧化碳气体处死小鼠无菌操作取出脾脏在平皿内挤压研磨制备脾细胞悬液 将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合并加入促融合剂聚乙二醇在聚乙二醇作用下各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合形成杂交瘤细胞
3选择性培养 选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞一般采用HAT选择性培养基在HAT培养基中未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶不能利用补救途径合成DNA而死亡 未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡 只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性因此能在HAT培养基中存活和增殖
4杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化 在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞因此必须进行筛选和克隆化通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养采用灵敏快速特异的免疫学方法筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞并进行克隆扩增经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型亚类特异性亲和力识别抗原的表位及其分子量后及时进行冻存
5单克隆抗体的大量制备 单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法
(1)体内诱生法 取Balb/c小鼠首先腹腔注射0.5ml液体石蜡或降植烷进行预处理1-2周后腹腔内接种杂交瘤细胞杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖并产生和分泌单克隆抗体约1-2周可见小鼠腹部膨大用注射器抽取腹水即可获得大量单克隆抗体
(2)体外培养法 将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养在培养过程中杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体收集培养上清液离心去除细胞及其碎片即可获得所需要的单克隆抗体但这种方法产生的抗体量有限各种新型培养技术和装置不断出现大大提高了抗体的生产量抗原是指能够刺激产生特异性免疫应答并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合发生特异性反应的物质抗原的基本特性有两种一是诱导免疫应答的能力也就是免疫原性二是与免疫应答的产物发生反应也就是抗原性
很多物质都可以成为抗原抗原的具体分类可以参见在进行单克隆抗体制备过程中很多物质都可以成为抗原在常规的科研实验中科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug多肽偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体单克隆抗体制备的宿主动物一般选用Balb/c小鼠鼠单抗的应用范围相当广泛一些国内外公司均开发出了兔的单克隆抗体制备技术
免疫原分为可溶性抗原和颗粒性细胞抗原用无菌盐水稀释并与佐剂混合腹腔注射抗原与佐剂彻底混匀后形成的稳定乳状液在免疫原提供持续的免疫应答基础上进行加强免疫
第1天 采血0.2ml获得0.1ml免疫前血清
第一次免疫抗原加弗氏完全佐剂
第14天 第二次免疫抗原加弗氏不完全佐剂
第21天 采血和ELISA检测
第35天 第三次免疫抗原加弗氏不完全佐剂
第42天 采血和ELISA检测
第56天 第四次免疫抗原溶于PBS或盐水
第61天 细胞融合一融合剂
细胞融合的方法有法如电融合融合融合法和融合法如灭活的仙台此处例举化学融合法中的一种即融合法聚乙二醇PEG在为200～700时呈无色无臭的粘稠状液体分子量大于1000时呈乳白色蜡状能溶于水及其他许多有机对热稳定与许多化学药品不起作用用作剂的聚乙二醇一般选用分子量为4000者常用浓度为50%pH8.0～pH8.2用10%NaHCO3调整分子量小的PEG融合效应差又有分子量过大则粘性太大不易操作50%浓度pH偏碱时融合效应最高也有采用30%～50%浓度的PEG加上10%二甲亚砜不同的PEG即使分子量相同但融合率却有明显差异选用时必须注意每批都必须进行试验后方可应用要买高的一般选供气相色谱用的PEG
二融合过程
融合的方法很多常用的有和离心法融合时脾细胞和的比例为1:1至10:1不等3:1或5:1最为常用
1试剂与材料
(1)供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞
(2)1640100ml
(4)2.5%FCS－1640液50ml
(6)50%PEG取分子量4000高纯度的进口或ServaPEG10g放入25ml瓶中高压灭菌使用前用预热于40℃的1640液10ml等量W/V混合以酚红检查pH一般不必调pH如pH有改变可用HCl或NaHCO3调整
(7)10ml和50ml的灭菌管或瓶
(8)40孔塑料培养盘
⑴准备好脾细胞
⑵在50ml沉淀管中混合108脾细胞和107小鼠骨髓瘤细胞并加入50ml2.5%FCS－1640液
⑶400g3min使细胞沉淀
⑸轻敲管底部使沉淀流动把放于40℃水浴中使其达融合温度
⑹加预热至40℃的50%PEG0.8ml用1ml缓慢滴加边加边摇肉眼观察可见有颗粒出现滴加过程要求持续2min
⑺加1ml1640液边加边摇动持续1min
⑻重复⑺一次
⑼加1ml1640液边加边摇动持续0.5min
⑽重复⑼一次
⑾加1640液15ml
⑿室温400g离心1min使细胞沉淀
⒀去上清轻敲管底部加25ml含有HAT的完全1640液
⒁往已于前一日种有饲养细胞的40孔塑料培养盘中滴加融合的每孔1滴约0.05ml
⒂轻摇后放入5%CO2饱和的37℃温箱中培育
⒃第36910日换入含HAT的完全1640培养液注意轻轻吸取上清液勿将固定于孔底的细胞吸出根据需要加入适量的
⒄于第1215日加入含有HAT的完全1640培养液在每次换液前用观察大约在10天左右就可观察到杂交瘤细胞生长出来大多数杂交瘤细胞在10~20天内出现但也有在1个月左右才能出现的杂交瘤细胞出现后吸取上清液检查抗体
⒅对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代在传代过程中依情况取消HAT液和完全1640液而代之以10%FCS－1640液同时保存于和进行在这期间每代都要检查抗体以防止产生抗体细胞的变异和丢失
三细胞融合的关键
1技术上的常常导致融合的失败例如供者没有查到这必然要失败的
2融合试验最大的失败原因是污染融合成功的关键是提供一个无毒无菌的操作环境的细胞可以在体外进行大量培养收集上清液而获得大量的单一的克隆化抗体不过法得到的单克隆抗体有限其不能超过特定的细胞浓度且每天要换培养液而体内杂交瘤细胞繁殖可以克服这些限制杂交瘤细胞具有从亲代淋巴细胞得来的的特性如接种到的同系小鼠或不能排斥杂交瘤的小鼠无的裸鼠杂交瘤细胞就开始无限地繁殖直至死亡产生肿瘤细胞的小鼠腹水和血清中含有大量的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体这种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的100~1000倍
利用免疫抑制剂如液体抗淋巴细胞等可以加速和促进肿瘤的生长
1材料大鼠神经胶质细胞株瘤杂交瘤细胞株1经高压灭菌的
2Balb/c5~8
3杂交瘤细胞取的细胞
4RPMI1640培养液
(1)于小鼠腹腔注射0.5ml注射后1～9周内种植细胞
(2)收取的杂交瘤细胞用5%FCS1640液洗涤一次1000r/min10min
(3)取样用台盼兰染色计数重新用5%FCS1640液配成1.0×107细胞/ml的悬液
(4)给注射了的接种杂交瘤细胞每只腹腔注射1ml含1.0×107个细胞/ml
(5)接种后10天左右时间肿瘤最大此时可由腹腔抽取腹水每隔1~3天取1次可取10次血清可由腋下动脉或采血后分离1材料单克隆抗体制备流程(1)20mMol/LpH7.8~7.9TrisHCl缓冲液
20mMol/LNaCl
(2)20mMol/LpH7.8~7.9TrisHCl缓冲液
40mMol/LNaCl
(3)20mMol/LpH7.8~7.9TrisHCl缓冲液
80mMol/LNaCl
(4)20mMol/LpH7.8~7.9TrisHCl缓冲液
1小鼠腹水用冷PBS液稀释4倍后于1.00×105转离心30min去沉淀
2在4℃于上清中缓缓滴加饱和硫酸铵液边加边搅拌使溶液最终为50%硫酸铵浓度
3此溶液置中30min~60min然后5000r/min离心10min去上清
4将沉淀溶于Tris－HCl缓冲液40mMol/LNaCl中溶液可能混浊
5装入于Tris－HCl20mMol/LNaCl中透析除盐
6离心去沉淀单克隆抗体制备流程7溶液稀释1:100或更高倍稀释后于280nm测含量估计含量1A280unit=0.8mg蛋白质一般每ml腹水中含有总蛋白约25mg~36mg
8过DEAE纤维素柱纤维素柱高40cm以20mMol/LNaClTris缓冲液平衡透析以Tris缓冲液等量稀释
样品进入柱床速度为1ml~2ml/min以NaCl线形洗脱大部分单克隆IgG于40mMol/L和80mMol/LNaCl洗脱也有极少例外的单克隆抗体于120mMol/L~150mMol/LNaCl洗脱测OD280nm收集蛋白峰单克隆IgG保存备用
杂交瘤产生各种但主要是IgG和IgM究竟是哪种为主则决定于抗原的免疫免疫一次且3天后就取脾多为产生IgM的免疫多次的多为IgG1杂交瘤细胞染色体的检查采用裂解法进行单克隆抗体制备2单克隆抗体的亚型的测定购买兔抗小鼠Ig类型和亚型的标准抗血清采用或ELISA夹心法测定单抗的Ig类型和亚型
ELISA夹心法测定单抗的Ig类型和亚型的试剂盒说明书
一试剂原理本试剂盒利用双抗体夹心法鉴定小鼠培养上清中单克隆抗体或特异亲和纯化的单克隆抗体的类和亚类可区分出IgG1\IgG2a\IgG2b\IgG3\IgM\IgA采用小鼠抗体共有位点的二抗包被微孔板与加入的培养上清中的小鼠抗体结合再加入HRP标记的抗小鼠各类亚类的抗体来分别反应最后用TMB底物系统显色并用稀硫酸终止再通过酶标仪检测吸光度来判断被测单克隆抗体的类或亚类本试剂盒具有极高的分辨率是您鉴定小鼠单克隆抗体类亚类的可靠工具
三使用范围用于小鼠单克隆抗体Ig类亚类的鉴定以及相关内容的研究
四使用方法
1首先将试剂盒恢复室温大约30分然后用纯水把清洗液配成工作浓度一份浓缩清洗液加19份纯水
2取出每个标本需要6孔阳性对照6孔多余的用自封袋保存记得放入干燥剂
3将细胞培养上清或特异亲和纯化的抗体50μl加入酶标微孔板每个标本加6孔阳性对照也是加6孔每孔50μl然后每孔再加入50μl标本贴上封板膜37℃温育30分钟
4弃去板内液体洗板5遍后在不掉纤维的吸水材料上拍干或机洗5遍再在每个标本的6孔中分别加入6种酶标二抗各100μl通用阳性对照的6孔也一样在加样图上或上做好标记贴上封板膜37℃温育30分钟
5吸弃板内液体洗板5遍后在不掉纤维的吸水材料上拍干或机洗5遍每孔分别加入A和显色剂B各50μl换一张新的封板膜贴板避光37℃显色20分钟
6本试剂盒特异性好一般肉眼即可观察出结果看显色蓝的那个孔所对应的酶标二抗就知道此标本的Ig类或亚类更可将反应终止液每孔50μl终止反应后用酶标仪450nm测定630nm参考波长双波长测定结果参看高值孔所对应的酶标二抗就知道此标本的Ig类或亚类阳性对照0D小于0.5实验无效需要重做
五产品特点高灵敏度高特异性结果容易判定当然您如果觉得很多试剂自己可以准备想省一笔费用那您可以登陆网站选择我们为您准备的简装抗体鉴定产品C030215当然您也可以下次把标本交给我们来做并且不会增加太多费用
六保存条件2-8℃避光保存效期一年不正确存放或过于频繁开启使用有可能因此使效期缩短
七注意事项
1虽然本过期后很久还有使用价值但还是请您在有效期内使用
2在检测腹水类单抗时要稀释到1/5万虽然可以分辨但并不建议您这样做此类样品成分十分复杂有干扰结果的可能在此种情况下您可以选择本公司的C030215抗体鉴定试剂它会给您带来满意的结果
3手洗板子时一定要把孔加满停留10秒然后弃尽最后要拍干净特别是在酶标二抗温育后洗板时一定要把酶吸出而不是甩出要吸净这个在手工洗板时对结果很重要
4一次没用完的板子要带干燥剂放自封袋封好随盒存放
5拿放板子时不要剧烈抖动以免孔间交叉污染出现错误结果
6出现异常结果请随时咨询我们
3单抗的特异性鉴定可以采用各种方法如免疫荧光法ELISA法间接血凝和技术等同时还需做免疫阻断试验等
4单抗的测定可采用凝集反应ELISA或放射免疫测定不同的测定方法不同培养上清液的效价远不如腹水的效价采用凝集反应腹水效价可达5×104而采用ELISA检查腹水效价可达1.0×106单抗的效价以培养上清和腹水的表示
5必要时还可以测定单抗的亲和力和识别的能力测定[1]经过抗体测定的阳性孔可以扩大培养进行克隆以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体克隆的时间一般说来越早越好因为在这个时期各种同时旺盛生长互相争夺营养和空间而产生指定抗体的细胞有被淹没和淘汰的可能但克隆时间也不宜太早太早细胞性状不稳定少也易丢失克隆化的阳性杂交瘤细胞经过一段时期培养之后也还会因为细胞突变或特定的丢失使部分细胞丧失产生抗体的能力所以需要再次或多次克隆化培养克隆化次数的多少由分泌能力强弱和抗原的强弱而决定一般说免疫性强的抗原克隆次数可少一些但至少要3～5次克隆才能稳定克隆化的方法很多包括显微操作法软平板法及荧光激活分离法等
1盘盘内各孔于前一天培养小鼠腹腔细胞即饲养细胞每孔2万～4万
1取出抗体阳性用HT培养液制成细胞悬液并取样进行台盼兰染色计数
2用HT培养液将细胞稀释成200个/ml40个/ml20个/ml和的悬液
3用吸管将细胞悬液分别种入盘每孔0.05ml细胞含量分别为10个/孔2个/孔1个/孔和0.5个/孔
45%CO2饱和湿度37℃培养
5每天用倒置显微镜观察克隆情况选择只有一个生长的孔弃掉两个以上和没有的孔
6克隆大量后布满孔底的1/3～1/2时测培养液抗体
7抗体阳性孔细胞移到有的组织中并传2～4代就可以脱离饲养细胞建成克隆株
二软琼脂细胞借助撒在软琼脂上单个细胞定位生长而达到克隆化具体如下
1配2.5%的琼脂糖30ml水浴溶化后移入45℃水浴中
2将117ml完全DMEM液和3ml10倍浓度的DMEM液混合置45℃水浴预热
3将琼脂糖与DMEM液混合即为含0.5%琼脂糖的完全DMEM液并加75×108脾细胞
4每块平皿加10ml于室温中凝固
5DMEM中的细胞与DMEM琼脂1:1混合将细胞琼脂2ml铺于凝固的平板上使其全部覆盖
6放入CO2箱饱和湿度37℃培养10天
7用PBS配制0.6%琼脂糖于沸水浴溶解后置45℃在保温情况下取一试管迅速加入0.1ml25%羊红血球0.2ml补体2.7ml0.6%琼脂糖
8用3ml羊红血球混合液覆盖克隆于37℃CO2箱孵育1h~2h从克隆上部溶解羊红血球的溶血范围可筛选抗羊红血球Ig
三显微镜操作法
在直径6cm培养皿中加入1ml1.0×108细胞悬液放置5%CO2饱和湿度37℃温箱中放置30min以上倒置显微镜下寻找那些与周围相距甚远的单个细胞将口一头有直角弯头毛细管一头连接一尺长管用口控制液体进入水平置放于液面上左右微动直到看见管口对准细胞吸入毛细管将管中细胞移到预先加有2.0×104~5.0×104饲养细胞96孔板内培养后即可获得单个细胞形成的克隆单克隆抗体制备流程四激活分离法
用一种荧光激活细胞FluoresceinActivafedCellSorterFACS其基本原理是将细胞经荧光抗体染色后经喷嘴形成单个细胞的线形液滴在光激发下发射荧光此信号由光电倍增管接收再结合细胞形态大小产生光散射信号经电脑处理产生并与预定的信号对比根据细胞荧光强度及细胞大小不同将细胞分成不同在中发生偏离而分别收集于不同中一脾细胞
(1)免疫过的滴度高的Balb/c鼠
(2)1640培养液单克隆抗体制备流程(3)2.5%FCS－1640
(1)拉颈或用CO2处死小白鼠
(2)将小鼠放于70%中浸泡消毒取出固定于板上在无菌下取脾
(3)把脾放入5ml含有2.5%FCS的1640液中冰浴下轻轻洗去脾上的红血球
(4)用镊子轻轻挤压脾做成脾细胞悬液用毛细管将悬液移入小试管中
(5)直立小试管3min使大块的下沉把细胞悬液移入管中
(6)以2.5%FCS1640充满并以400g离心7min～10min与此同时应开始制备
(7)把沉淀用约10ml的新鲜培养液
(8)重复⑹⑺步骤
(9)计算细胞以台盼兰染色用检查活细胞数应高于80%为合格
骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白这样的瘤后可能影响或降低所分泌抗体的滴度所以必须选育出非分泌免疫球蛋白型的骨髓瘤细胞
选择骨髓瘤细胞的条件①该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系以便两者的组织相容性抗原一致②骨髓瘤细胞必须是不产生γ或不分泌到细胞外③骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞,最好106个细胞/ml④生长速度快繁殖时间短常用的Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有①S194/5XXO·BU·1②SP2/0Ag14简称SP2③P2X&Ag8·6·5·3简称653④FO以653最为常用它是由矿物油4－－15烷Pristane诱发出来的一种MinerolOilplasmacytomaMOPC并经过培育形成一株8-氮鸟嘌呤有的亚系骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入保存于-195℃液氮罐中时复苏增殖即可由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态很容易脱落因此不需要胰酶处理为了防止出现在融合前可将培养基内加入15μg/ml8－氮取约1×107～6×107即培养15h～20h的骨髓瘤细胞在室温400g10min沉淀以2.5%FCS1640液并计数
三饲养细胞
在体外的细胞培养中单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖加入的细胞称之为饲养细胞Feedercell在和单克隆的选择过程中就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体因此在这一过程中必须使用饲养细胞许多种类的细胞都可以做饲养细胞如正常的脾细胞腹腔渗出细胞等常选用腹腔渗出细胞其中主要是和淋巴细胞应用腹腔渗出细胞的好处是一方面做饲养细胞另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片为融合细胞的生长造成良好的环境腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠也可以是其他种类的小鼠如C57鼠小白鼠等
1小鼠Balb/c或C57小白鼠若干只
211.6%溶液经10磅30min高压灭菌
1拉颈处死小鼠
270%酒精浸泡消毒10min
3用手术剪将小鼠腹部剪开一小口剥开露出
4用注射器将4ml11.6%蔗糖溶液注入腹腔用手指轻揉1min仍用该注射器回抽腹腔加入离心管
51000r/min离心10min
6取上清以HAT选择培养液将细胞制成悬液染色计数活细胞使每毫升含40万个活细胞
7以1ml吸管将细胞种入微量每孔0.05ml含2万个细胞放入CO2培养箱培养即可供和之用.单克隆抗体问世以来由于其独有的特征已迅速应用于医学很多领域主要表现在以下几个方面
作为检验医学实验室的诊断试剂单克隆抗体以其特异性强纯度高均一性好等优点广泛应用于免疫组化和等技术并且单克隆抗体的应用很大程度上促进了商品化试剂盒的发展应用单克隆抗体制作的商品化试剂盒广泛应用于
①抗原抗体的检测
③及其亚群的的检测
④激素测定
单克隆抗体对抗原的识别与有很大的不同不同试剂盒因使用的单克隆抗体不同识别抗原的位点不同导致检测结果有一定差异因此标准化问题还需要进一步研究
2蛋白质的提纯
单克隆抗体是中重要的将单克隆抗体吸附在一个的固相如Speharose 2B4B6B等上并制备成当样品流经层析柱时待分离的抗原可与固相的单克隆抗体发生特异性结合其余成分不能与之结合将层析柱充分洗脱后改变洗脱液的离子强度或pH欲分离的抗原与抗体解离收集洗脱液便可得到欲纯化的抗原
3 肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术
将针对某一肿瘤抗原的单克隆抗体与化疗药物或放疗物质连接利用单克隆抗体的导向作用将药物或放疗物质携带至靶器官直接杀伤靶细胞称为肿瘤导向治疗另外将放射性与单克隆抗体连接注入患者体内可进行放射免疫显像协助肿瘤的诊断单克隆抗体主要为鼠源性抗体异种动物血清可引起人体过敏反应因此制备人-人单克隆抗体或更为重要但此方面仍未取得明显进展1单克隆抗体的优点
(1)杂交瘤可以在体外永久地存活并传代只要不发生细胞株的基因突变就可以不断地生产高特异性高均一性的抗体
(2)可以用相对不纯的抗原获得大量高度特异的均一的抗体
(3)由于可能得到无限量的均一性抗体所以适用于以为特点的免疫学分析方法如IRMA和ELISA等
(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗
2单克隆抗体的局限性
(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成
(2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体
(3)制备技术复杂而且费时费工所以单克隆抗体的价格也较高单克隆抗体药物的发展起源于1975年,杂交瘤技术的问世使大量制备均一的鼠源单克隆抗体成为可能1986年第一个抗移植后免疫排斥反应的鼠源单克隆抗体muromonab-CD3(OKT3)经美国食品药品监督管理局Food and Drug Administration, FDA批准上市[2]但是来源于鼠源淋巴细胞杂交瘤的抗体被人的免疫系统识别会引起严重的人抗鼠抗体反应human anti-mouse antibody,HAMA,不仅使治疗性单抗半衰期变短疗效减弱有时还会引起严重的不良反应[3-4]
单克隆抗体药物的发展在1988年到1993年间陷入低谷随着重组DNA技术的发展各种抗体人缘化技术迅速发展单克隆抗体药物经历了人鼠嵌合单抗人源化单抗阶段随后出现的噬菌体展示文库技术和转基因小鼠技术使全人源单抗的产生成为可能,2002年第一个全人源抗体上市[3][5]
单克隆抗体在医药治疗上有广泛的前景被用于治疗肿瘤自身免疫性疾病感染性疾病和移植排斥反应等多种疾病[6]阿达木用于缓解抗性药物(DMARD)治疗无效的结构性损伤的中至重度关节炎(RA)[3]单克隆抗体的发展经历了四个阶段分别为鼠源性嵌合性人源化单克隆抗体和全人源单克隆抗体[7-9]全人源单克隆抗体其抗体的可变区和恒定区都是人源的去除免疫原性和毒副作用全人源抗体制备的相关技术主要有人杂交瘤技术EBV 转化 B 淋巴细胞技术噬菌体显示技术phage display转基因小鼠抗体制备技术transgenic mouse和单个B细胞抗体制备技术等[3]
由人源化和全人源抗体制备的人源化和全人源抗体药物因其具有高亲和力高特异性毒副作用小的特点克服了动物源抗体及嵌合抗体的各种缺点已经成为了治疗性抗体药物发展的必然趋势[3]
作为生物单抗药物在疗效和技术门槛方面难以挑战;另外,越来越多的医生在治疗类风湿时首选皮下注射给药的剂型,不需要注射过程和费用,虽然与依那西普的对比临床试验还未出来,但是人们普遍认为的疗效更好[3][10]2010年全球治疗用单抗药物的销售总额达到440亿美元如果加上100亿美元的单抗诊断和研究试剂单抗药物的市场总量达到550亿美元2011年单抗药物的市场总量已经达到628亿美元未来全球单克隆抗体药依旧会保持较高的增长率到2015年全球单克隆抗体药销售额有望达980亿美元左右我国的单克隆抗体药物从无到有并且在我国医药市场发挥越来越重要的作用目前我国单抗市场规模每年以50%以上的速度递增单克隆抗体在我国市场仍属高端产品主要依赖进口罗氏是我国单抗市场最大的赢家市场份额最高的品种利妥昔单抗和曲妥珠单抗均来自罗氏制药罗氏所有产品份额超过国内单抗产品份额半数2010年我国肿瘤药物市场销售额达160亿元同比增长24%全球排名第七远超美国4.4%和其他成熟或新兴市场2011年市场销售额达到208亿元同比增长率30%对生物仿制药的市场渗透率形成制约的其中一个因素是立法它阻止了用生物仿制药来替代原研产品这意味着生物仿制药的使用只限于新病人和短期适应症然而使用生物仿制药创造的医疗成本控制机会却是巨大的在那些尚未为生物仿制药确定监管路径的市场上其中包括美国生物仿制药获得成功的关键因素是专利的独有性临床试验要求和互换性&十二五&期间我国&重大新药创制&专项将获中央财政下拨资金100亿元配套资金300亿元专项战略重点包括创新药物研究开发药物大品种技术改造等恶性肿瘤心脑血管疾病神经退行性疾病糖尿病肺结核等10类重大疾病药物的研发是创制资金支持重点&十二五&期间医药工业发展目标为总产值年均增长20%到2015年达到3.1万亿元2011年单克隆抗体药物继续领跑全球药品市场同比有较大的增长年10年间全球单克隆抗体药物市场的复合增长率高达32%2011年全球处方药前20位中有6个为单克隆抗体药物其中有5个销售额超过50亿美元而在此前的2009年和2008年该数字分别为400亿美元和370亿美元当前几乎所有大型制药公司都有单抗研发项目在2011年全球最畅销的20种药品中美国辉瑞公司用于降低胆固醇的阿托伐他汀钙居于首位达到133亿美元2011年全球生物制药产品的市场规模超过1550亿美元占制药/生物制药产品的25%不过有研究数据表明生物制药产品今后几年在全球市场上的占比将明显上升据预测到2014年全球销售额前三大产品都将是生物技术药物AvastinHumira和Enbrel届时它们的销售额合计将达到254亿美元单克隆抗体药物已经成为生物制药中最为重要的一类2011年销售规模最大的7种抗体药物的销售额达到了388.2亿美元占整个生物制药市场份额接近50%仍是研发的热点也将是未来生物制药行业发展的重要动力所在
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