&蛋白质组的一个主要问题就是如何检测大量蛋白之间的互作。即使一个小小的细菌的基因组都包含了几千个基因，涉及百万个潜在的蛋白间的互作。很多蛋白在细胞中承担了多种角色。了解细胞内大量的互作对系统生物学和细胞模型的设计非常有必要。然而目前我们只对一小部分原核生物的胞内互作了解的较为深入，大部分情况是只了解很少一部分可能的互作，很多人类病原菌，如肺炎链球菌对抗生素的抗性日益增强，这也是很多医院感染的来源。了解蛋白间的互作网络有助于新的抗生素的设计。
&筛选蛋白间互作比较困难。酵母双杂交用于检测两个蛋白间的互作，这个方法也用于大范围蛋白互作图谱的制作。然而这个方法的缺点是，不能用于膜蛋白，在转录因子应用中也显示出很高的假阳性。蛋白复合体检测方面，常用亲和纯化与质谱技术相结合的方法。然而，为了区分特异互作与非特异互作，需要进行严格的洗涤步骤，这又会影响较为敏感的互作。
&基于芯片方法的蛋白互作筛选应用也很广泛。但是大多数目前的方法使用的是纯化后的蛋白，对于瞬时作用或者较弱的作用
&在蛋白的结构-功能关系中，蛋白的正确折叠至关重要。研究高度复杂的自组装过程，也就是对蛋白从无序的多肽链到形成高度复杂而且精密的结构的过程的研究，是关键而且具有挑战性的。在过去的十几年里，在研究水溶性蛋白的折叠方面取得了相当大的进步，而对膜蛋白来说却进展缓慢。通常对膜蛋白折叠的研究会采用在有机溶剂中变性然后再在去污剂中复性的方法，但是问题是，这样的模型能不能正确反映膜蛋白在体内的折叠机理？而且，另一个问题是，脂质双分子层提供的并不是一个均一的疏水环境，而是一个亲水性朝着脂类头部的具有大的梯度的环境。
&表面增强红外光谱可以在单分子水平上原位监测界面吸附分子的震动变化，提供定向和构象的信息。当分子吸附在粗糙贵金属表面上时，分子的红外吸收强度增强10-1000倍以上，这为利用SEIRAS技术监测界面单层生物分子的结构变化提供了可能。而且，这种方法是一种非侵入式方法，也就是说追踪监测过程中不会对蛋白造成任何改变和伤害。
人类基因组约1/3的基因编码膜蛋白，超过50%的膜蛋白为药物靶点；因此，合成出正确折叠的膜蛋白，对膜蛋白的结构、功能研究和药物筛选至关重要。
本研究中使用了来自真核生物昆虫细胞的抽提物进行蛋白合成。昆虫细胞在抽提物制备过程中，内质网形成微粒体，为信号肽介导的蛋白翻译、转移和N端糖基化、脂质修饰以及信号肽切割等过程提供了天然场所。CFPS系统合成的膜蛋白能够整合入天然脂质双分子层中并进行随后的翻译后修饰。昆虫的无细胞蛋白表达系统在表达有功能的膜蛋白从而进行结构和功能研究中能够发挥重要作用。
在研究中还进行了基于琥珀抑制子的非天然氨基酸掺入的实验。琥珀抑制子是能够消除琥珀突变所致的表型效应的突变基因。突变通常位于一个与琥珀突变无关的基因中，该基因编码一个有突变的反密码子的tRNA，从而当发生琥珀突变产生
& & & &转录因子(transcription
factor，TF)是一群能与基因5`端上游特定序列专一性结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。转录因子一般有不同的功能区域，如DNA结合结构域与效应结构域。转录因子不单与基因上游的启动子区域结合，也可以和其它转录因子形成转录因子复合体来影响基因的转录。
&&拟南芥基因组包含1500
创建突变体有助于研究蛋白间互作。本研究将体外无细胞蛋白表达与ELISA相结合，可快速、平行研究蛋白间的互作。
如上图是反应的原理图。红圈中是两个相互作用蛋白的基因，同时加入到反应体系中，利用大肠杆菌无细胞蛋白表达系统合成两种蛋白。其中bait蛋白（引诱蛋白）带有HA标签，体系中加入了兔来源的HA标签的抗体，抗兔的二抗固定到平板上。捕获蛋白prey带
无细胞蛋白表达系统中，能量的来源一般为烯醇式丙酮酸或磷酸肌酸的高能磷酸键（如下图）。这种传统的功能方式，其花费在整个体系中占了约50%。
在无细胞蛋白表达系统中，可以使用线性模板来进行蛋白的表达。通过两次overlap
PCR的方法，在目的基因的开放阅读框两侧加入核糖体结合位点、启动子和终止子等必须的元件就可以进行蛋白表达。因为PCR是可以批量进行的，因此从模板生成到蛋白表达和检测，整个过程都可以利用96孔板批量进行。这在利用
无细胞蛋白表达(CFPS)在合成毒蛋白、研究蛋白进化和自下而上的合成生物学中是一个强有力的工具。CFPS转录-翻译元件由含有20-30mg/mL蛋白的细胞抽提物提供。通常，细胞抽提物由物理破碎方法来制备，但是，这需要特定的仪器和较好的技术来完成。本研究报道了一种新方法制备大肠杆菌细胞抽提物进行无细胞蛋白表达。这种方法不同于以往的物理破碎或者超声波破碎法，而是利用生化手段来进行，文章中对一些制备过程中的参数的优化和制备的抽提物表达蛋白的效果进行了考察。
细胞抽提物的制备是无细胞蛋白表达的关键步骤，抽提物中包含了转录和翻译所需的所有关键元件。下表中显示的是从最初细胞抽提物制备的标准方法以及后来对它进行改进的概要性总结，可以看到，这些方法中对细胞的破碎使用的是弗式压碎或者超声波破碎的方法，需要使用弗氏细胞压碎器或者超声波破碎仪来进行。&
&人类基因与蛋白数据库（HGPD，http://hgpd.lifesciencedb.jp/cgi/）是一个展示人类蛋白质组学中大量基于实验结果的数据库，是唯一的储存与公共cDNA序列数据相关的克隆信息和体外表达蛋白信息的数据库。HGPD于2008年底建立，包含约三万个全长的人类cDNA序列，以及33275个人类Gateway克隆。Gateway系统是一个构建各种实验的不同表达克隆的多功能框架，利用一个高效的基于小麦胚芽提取物的无细胞蛋白质合成系统，在体外系统且全面地产生并分析了人类蛋白质组。
&在G蛋白信号通路中，G&蛋 白 偶 联 受 体
(G protein- coupled
receptors，GPCRs)接受胞外信号，激活G蛋白，引起G蛋白的α亚基结合并水解GTP（如下图）。GPCR具有
7个跨膜α-螺旋结构域以及一个胞外
N&端和一个胞内
C&端尾巴。目前从真核细胞中克隆的GPCR已超过800种。但是，截至目前，公认的来自植物中的GPCR仅有
GCR1，但还没有合适的GPCR和它的配体一起在任何植物品种里确认发现。另外，在拟南芥中还发现了一个包含7次跨膜结构域的蛋白AtRGS1，它和Gα亚基有生理上的相互作用。
&无细胞蛋白表达从1948年就开始研究，在这几十年里发展的很迅速，目前利用无细胞蛋白表达体系合成毫克甚至千克的蛋白规模都已经成为可能，但是对于生物制药级别蛋白的工业化生产，缺乏扩大生产的标准化程序。比如使用不同形式的生物反应器，或者扩大体系可能会带来产量的变化或者蛋白折叠的错误。
&利用无细胞体系进行蛋白的规模化生产需要的条件：有效的可重复的大量细胞裂解液的制备，就是说大量制备的裂解液以及不同批次之间它的质量要能保持稳定；稳定的低成本的能量生成系统；以及底物的供应，如氨基酸前体分子的再利用以延长底物的供应时间等等。
本研究中使用的体系是大肠杆菌无细胞蛋白表达系统。研究的蛋白是GM-CSF,重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子。这是一种已经应用于临床的药物，GM-CSF具有多种功能，既可刺激造血前体细胞
的增殖、分化和成熟及促进其从骨髓向外周转移,又可诱导多种细胞如巨噬细胞、角质细胞等的分化、增殖并活化、增强其功能。迄今为止，rhGM-CSF联系电话：025-
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资源描述：《 生 命 的 化 学 》 2 0 0 5 年 2 5 卷 4 期C H E M I S T R Y O F L I F E 2 0 0 5 , 2 5 ( 4 )● 技 术 与 方 法[ 8 ] J o o b e u r T e t a l . P l a n t , 2 0 0 4 , 3 9 ( 3 ) : 2 8 3 — 2 9 7[ 9 ] F e u i l l e t C e t a l . P r o c N a t l A c a d S c i U S A , 2 0 0 3 , 1 0 0 ( 2 5 ) :1 5 2 5 3 — 1 5 2 5 8[ 1 0 ] T a n k s l e y S D e t a l . T r e n d s G e n e t , 1 9 9 5 , 1 1 ( 2 ) : 6 3 — 6 8[ 1 1 ] S c h w a r t z D C e t a l . C e l l , 1 9 8 4 , 3 7 : 6 7 — 7 5[ 1 2 ] 王 永 军 等 . 遗 传 学 报 , 2 0 0 4 , 3 1 ( 1 ) : 8 7 — 9 0[ 1 3 ] 杨 立 春 等 . 中 国 农 业 科 学 , 2 0 0 4 , 3 7 ( 1 ) : 6 5 — 7 1[ 1 4 ] M a d s e n L H e t a l . M o l G e n e t G e n o m i c s , 2 0 0 3 , 2 6 9 : 1 5 0 — 1 6 1文 章 编 号 ： 1 0 0 0 - 1 3 3 6 ( 2 0 0 5 ) 0 4 - 0 3 3 3 - 0 3蛋 白 质 体 外 表 达 与 进 化 技 术王 长 松 刘 友 生 陈 燕 平1（ 第 三 军 医 大 学 西 南 医 院 病 理 学 研 究 所 ， 重 庆 4 0 0 0 3 8 ；1西 南 医 院 国 际 合 作 实 验 室 ， 重 庆 4 0 0 0 3 8 ）摘 要 ： 蛋 白 质 体 外 表 达 与 进 化 技 术 包 括 核 糖 体 展 示 技 术 和 m R N A 展 示 技 术 。 与 蛋 白 质 体 内 表 达 系 统 相 比 ， 体外 表 达 技 术 可 产 生 较 大 容 量 的 蛋 白 质 文 库 （ 约 1 01 2～ 1 01 3左 右 ） ， 同 时 在 回 收 编 码 蛋 白 质 的 信 息 时 对 文 库 进 行 了进 化 ， 增 加 了 蛋 白 质 文 库 的 多 样 性 ， 促 进 了 抗 体 或 配 体 类 蛋 白 质 的 亲 和 成 熟 能 力 。 该 文 介 绍 了 蛋 白 质 体 外 表 达技 术 在 新 蛋 白 质 （ 如 抗 体 或 配 体 等 ） 表 达 筛 选 中 的 应 用 。关 键 词 ： 蛋 白 质 体 外 表 达 ； 核 糖 体 展 示 ； m R N A 展 示 ； 进 化中 图 分 类 号 ： Q 5 1 ； Q 8 1 6— —— —— —— —— ——收 稿 日 期 ： 2 0 0 5 - 0 5 - 1 6国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 ( N o . 3 0 2 7 1 3 4 2 )作 者 简 介 ： 王 长 松 ( 1 9 7 2 — ) ， 男 ， 博 士 ， 主 治 医 师 ， E - m a i l ：g o l d e n f i n g e r 8 5 0 1 2 4 @ y a h o o . c o m . c n ； 刘 友 生 （ 1 9 5 5 — ） ， 男 ， 博 士 ，教 授 ， 博 士 生 导 师 ， 联 系 作 者 ， E - m a i l : y o u s h e n g l i u 6 6 0 @ h o t m a i l .c o m从 2 0 世 纪 8 0 年 代 至 今 ， 产 生 了 多 种 筛 选 肽或 蛋 白 质 文 库 的 新 技 术 ， 这 些 技 术 方 法 大 多 以 表面 展 示 来 命 名 ， 如 细 胞 表 面 展 示 、 质 粒 展 示 和 酵母 双 杂 交 系 统 等 。 因 为 有 活 细 胞 参 与 文 库 的 生 成或 筛 选 过 程 ， 这 些 方 法 都 属 于 体 内 表 达 系 统 。 但是 由 于 转 化 （ t r a n s f o r m a t i o n ） 的 限 制 ， 这 些 文 库 的 库容 量 大 多 在 1 09左 右 ， 在 一 定 程 度 上 影 响 了 蛋 白 质文 库 的 亲 和 成 熟 。 无 细 胞 翻 译 系 统 — —— 核 糖 体 展示 技 术 和 m R N A 展 示 有 效 地 解 决 了 这 种 缺 陷[ 1 ]。 无细 胞 翻 译 系 统 是 在 翻 译 的 过 程 中 将 蛋 白 质 的 表 型和 基 因 型 偶 联 在 一 起 ， 即 把 编 码 新 蛋 白 质 的m R N A 和 新 生 蛋 白 质 自 然 地 联 系 起 来 。 核 糖 体 展示 技 术 应 用 不 含 终 止 密 码 子 的 m R N A 来 表 达 蛋 白质 ， 并 和 核 糖 体 形 成 蛋 白 质 - 核 糖 体 - m R N A （ p r o -t e i n - r i b o s o m e - m R N A ， P R M ） 三 联 复 合 体 。 m R N A展 示 也 是 将 m R N A 及 其 编 码 的 多 肽 作 为 一 个 筛 选单 元[ 2 ]， 形 成 m R N A - 蛋 白 质 复 合 体 ， 快 速 的 建 立一 个 较 大 容 量 的 多 肽 文 库 ， 一 般 情 况 下 产 生 的m R N A - 蛋 白 文 库 的 库 容 多 在 1 01 2～ 1 01 3之 间[ 3 ]。m R N A 展 示 和 核 糖 体 展 示 技 术 之 间 无 明 显 区 别 ，唯 一 的 不 同 之 处 在 于 m R N A 和 蛋 白 质 在 复 合 体 中的 连 接 方 式 不 同 ， 在 m R N A 展 示 中 二 者 通 过 一 个小 的 连 接 分 子 形 成 共 价 连 接 ， 而 核 糖 体 展 示 中m R N A 、 核 糖 体 和 新 生 蛋 白 质 之 间 采 用 一 种 稳 定的 非 共 价 连 接 。 蛋 白 质 体 外 表 达 系 统 代 替 体 内 表达 系 统 将 更 有 利 于 研 究 蛋 白 质 的 功 能 ， 体 外 表 达技 术 和 基 因 芯 片 技 术 的 发 展 正 逐 渐 成 为 大 规 模 分析 蛋 白 质 的 有 效 工 具 。1 . 体 外 表 达 与 进 化 技 术 的 特 点1 . 1 核 糖 体 展 示 及 影 响 因 素 和 体 内 表 达 系 统相 比 ， 核 糖 体 展 示 技 术 有 一 些 潜 在 的 优 点 ， 如 易构 建 大 容 量 的 文 库 ； 减 少 由 于 细 胞 内 表 达 所 产 生的 差 异 性 ； 更 易 于 产 生 突 变 等 。 核 糖 体 展 示 技 术基 于 E . c o l i 提 取 物 或 兔 网 织 红 细 胞 系 统 ， 可 用 于表 达 和 筛 选 具 有 特 异 结 合 能 力 的 功 能 性 单 链 抗 体（ s i n g l e - c h a i n a n t i b o d y ， s c F v ） 。 由 于 核 糖 体 展 示 技术 产 生 的 文 库 容 量 较 大 ， 因 此 易 于 筛 选 到 与 抗 原具 有 特 异 性 结 合 能 力 的 s c F v 。 兔 网 织 红 细 胞 系 统属 于 真 核 表 达 系 统 ， 与 E . c o l i 系 统 相 比 R N A 酶 活性 较 低 ， 有 利 于 保 持 P R M 复 合 体 的 稳 定 性[ 4 ]， 还可 以 促 进 翻 译 和 / 或 更 有 效 地 折 叠 新 生 蛋 白 质 。m R N A 均 和 核 糖 体 相 连 ， 形 成 s c F v - 核 糖 体 -m R N A 复 合 体 ， 用 抗 原 筛 选 后 得 到 编 码 该 抗 体 的c D N A ， 以 c D N A 为 模 板 继 续 进 行 下 一 轮 的 表 达 和筛 选 。 目 前 应 用 该 技 术 已 获 得 了 一 些 和 抗 原 有 较高 亲 和 力 的 s c F v 抗 体 ， 还 进 化 了 部 分 鼠 源 和 人 源""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""3 3 3· ·● T e c h n i q u e s a n d M e t h o d s《 生 命 的 化 学 》 2 0 0 5 年 2 5 卷 4 期C H E M I S T R Y O F L I F E 2 0 0 5 , 2 5 ( 4 )的 抗 体 文 库[ 5 ]。 在 核 糖 体 展 示 中 ， 有 时 第 1 轮 筛 选后 的 文 库 即 可 与 抗 原 结 合 ， 说 明 产 生 的 文 库 容 量较 大 ， 在 多 数 情 况 下 经 过 4 轮 筛 选 后 ， 抗 体 仍 在进 化 。 核 糖 体 展 示 技 术 也 适 用 于 表 达 有 毒 性 的 ，对 蛋 白 酶 分 解 极 度 敏
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无细胞蛋白表达系统研究进展
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