一条引物可以扩增吗会引起PCR产物的峰干扰。

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2022-11-10 23:36 标签： pcr反应的基本过程不包括以下

本专栏介绍荧光定量PCR的基本原理，包括以下内容：

首先我们看一下什么是PCR？PCR，即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶的作用下，以母链DNA为模板，以特异性引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸（按半保留复制机制进行延伸）等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。

那么我们做PCR的目的是什么呢？

我们做PCR的目的就是扩增出大量目标基因以达到可检测水平。比如，我们进行新冠检测，我们的口腔拭子所采集的样本中可能含有新冠病毒基因，但是这个量是非常少的且不能被相关仪器所检测到。那么我们就可以通过PCR的方式对新冠基因进行扩增，以达到可检水平。

PCR反应成分通常包括以下成分：模板、引物、酶、dNTP、Mg2+、反应缓冲液（Buffer）、水等。模板即我们获得的可能含有目标基因的核酸；引物即针对目标基因所在核酸范围的特异性的引物；酶通常为DNA聚合酶，或者包含反转录酶等；dNTP为PCR反应扩增的原料；镁离子能增强DNA聚合酶的活性，提高扩增效率；此外，反应缓冲液通常包括Tris-HCl用于稳定缓冲液pH值，以及钾离子、铵离子和其他表面活性剂等。

那么什么是实时荧光定量PCR呢？

qPCR，即荧光定量PCR是利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增中每一个循环扩增产物量的变化，并进行定量分析。我们通常做的常规PCR只是关注PCR最后扩增的产物，通过电泳进行判断，产物是否发生扩增，即我们的模板中是否存在我们待检测的目标基因。而qPCR是期望对PCR反应过程的每一步都能进行监测，而不只是关注PCR最终的扩增结果。

那么我们如何实现这种实时监控呢？

我们就是在PCR反应体系中加入荧光基团，来实现对PCR的实时监控。

目前，我们常用的两种方法就是染料法和TaqMan探针法。

首先，介绍一下染料法。我们常用的染料就是SYBR Green Ⅰ这种染料。这种染料有以下特性：该染料可以非特异地结合在双链DNA小沟上，而不与单链结合。这里的非特异性是指，只要是双链DNA，它都能结合上去，不管该双链DNA是否是你期望扩增的目标基因还是非目标基因。这种染料在游离状态下几乎不会产生荧光，因此仪器也就没有反应，一旦染料结合了双链DNA就会产生较强的荧光信号，仪器也就有所反应。

那么，具体在扩增过程中。首先，在扩增的起始阶段，经过热变形双链DNA发生解链变成单链，染料结合不上去，因此就没有荧光信号。随着反应的进行，有双链形成之后，染料就会结合在双链形成的小沟上。每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去；染料一结合，就产生荧光信号；信号强度与DNA分子总数目成正比。那么在PCR的每一个循环中这种荧光信号的积累过程就能被仪器所实时监控。

当然，由于SYBR Green Ⅰ是非特异性结合在双链上，所以一旦在PCR扩增过程中有非特异性产物的生成，它也会产生被仪器所检测到的荧光信号，这种非特异性的信号与特异性的信号由于无法区分就会导致实验结果的不准确性。

通常，为了保证我们实验结果的准确性。我们在做染料法时，通常都会做熔解曲线，来帮我们判断实验结果是否可靠。

那么熔解曲线是什么呢？熔解曲线是在我们扩增结束以后，在仪器上设定的一组程序，将仪器的温度从60℃逐渐升温到95℃，每隔一定时间，对PCR产物的荧光信号进行监测。

在扩增结束后，我们会获得大量的双链DNA产物，这些双链DNA产物都会结合上一定数量的荧光染料。那么，随着我们设定的温度逐渐升高，双链DNA就会发生解链，结合在双链上的染料也会逐渐游离出来，那么我们做监测到的荧光信号就会逐渐降低，如上左图所示。

那么在熔解曲线中有一个重要的概念Tm值，它是DNA的双螺旋结构打开一半时的温度。它有一个特点就是在在温度时DNA双链解链速度最大，那么反应在左图上时也就是在该点时图形的斜率最大，那么对左图的曲线就行求斜率之后就会得到右图。在Tm值时，右图有一个极大值点。所以如过我们做的PCR扩增的特异性好，那么熔解曲线他就呈现为单峰图。一旦出现非特异性产物，熔解曲线就不是单峰了。

以上是两种常见的双峰图，左边是发生了非特异性扩增，就是扩增出了非目标基因。右边是引物二聚体引起的结果，它是在引物设计时由于引物设计不合理，引物自身会发生配对，导致在PCR扩增中引物自身配对并延伸扩增。

那么在熔解曲线上这两种有什么区别呢？通常非特性扩增峰的荧光增峰会比引物二聚体峰要强，非特异性峰的Tm值通常大于80℃，而引物二聚体峰Tm值通常为75℃。

除了这两种情况会出现双峰，我们做实验时如果有污染也会导致双峰的情况发生。通常我们是通过阴性对照来帮助我们判断结果的。引物二聚体做阴性时只会出现二聚体峰信号，非特异性扩增做阴性时不会出现信号，而污染做阴性时与样品孔信号是一致的。

以上是染料法的原理。那么第二种常用方法是TaqMan探针法。TaqMan探针是一段短的核苷酸序列，它的5‘端连接有一个荧光报告基团，3’端连接有一个猝灭基团。当探针完整时，荧光基团和猝灭基团距离很近，荧光基因所产生的荧光信号汇报猝灭基团屏蔽。一旦探针发生水解，荧光基团就会和猝灭基团分离，那么荧光基团所产生的荧光就能被仪器所检测到。

具体在扩增过程中是，扩增的起始阶段，探针就会以碱基互补配对的原则特异性的结合在单链DNA上。由于DNA聚合酶具有5‘-3’的外切活性，一旦新链扩增到探针的5‘端，DNA聚合酶就会水解探针使得荧光基团和猝灭基团分离。每合成一条DNA链就切断一条探针；每切断一条探针，就产生一个单位信号；信号强度与结合探针的DNA分子数成正比。就是通过这种方式实现对PCR扩增的每一个循环进行实时监控的。

我们常用的报告基团有很多，这些不同的基团都有相应的检测通道，这样我们就可以通过不同检测通道的报告基团实时多重PCR，即在同一个反应体系中检测多个基因。比如，我们进行的新冠检测，他会检测新冠的orf基因用FAM标记探针，检测新冠的N基因用VIC标记探针，检测人源基因RNase P用Cy5标记探针。这三个属于不同的通道，那么就可以仪器上选择对应通道进行荧光信号检测，实现在一次荧光定量PCR实验中就可以同时检测多个基因。而染料它不能区分不能基因产物的荧光信号，因此只能检测一个基因，不能同时检测多个基因。

常用的猝灭基团是这三个，在引物合成时，一般合成公司都会有相应的推荐。

此外，参比荧光ROX后面会介绍。

以上就是两种方法的比较。

那么为了实现实时监控PCR扩增过程，除了需要荧光基团，另一个需要的就是荧光定量PCR仪器。那么仪器的原理就是，仪器会发生光，透过滤光片照射到PCR反应板上，反应体系产生的荧光会再次通过滤光片被仪器所接手到，在经过信号转换就得到了我们常见的数字信息。

那么我们如何去理解这种数字信息呢？首先就需要去了解一下PCR的数学原理。PCR的数学原理比较好理解，就1变2，2变4，一直2的n次方的过程。比如一个DNA分子他又两条链，他会以这两条链为模板合成两个DNA分子，那么N个循环之后就会有2的N次方个DNA分子，当然这是在理想状态下的情况。后来，人们引进扩增效率(Ex)这个概念，就有了以上的非理想的PCR反应方程。当扩增效率为100%时，就是理想状态。当扩增效率不是100%时，就会出现以上的情况。

上图都是常见的PCR扩增曲线，我们看线性图谱。由于PCR的过程是在体外进行的，我们在反应体系中的一些原料都是有限的，还有荧光定量PCR仪对荧光信号的检测也会受到一些其他因素的影响。所以，我们看到扩增曲线并不是按住2的N次方那种指数扩增进行的。

首先，看红圈部分，他叫指数增长期，这一部分曲线是复合我们上面方程那种指数增长的部分。红圈部分左边的一段时期称为基线期，在这个时期为扩增的起始阶段，扩增的产物很少，荧光信号低，此外试剂或者耗材的干扰可能也会导致仪器检测不到荧光信号，因此，在这一阶段呈现为y=0的直线。随着反应进行，由于扩增是一种指数扩增，荧光信号积累的很快，于是就会出现指数增长的图形。那么反应继续进行，由于一些酶等原料的消耗，扩增就会以某一个恒定的速率逐渐增长，就会出现一段线性增长期。在PCR反应的末期，由于一些原料消耗殆尽，增长速率逐渐降低或者不在增长就会进入平台期。

除了四个时期，还有几个重要的概念需要去了解。基线、阈值、Ct值。

我们通常做荧光定量PCR都会关注Ct值，那么我们为什么关注它呢？那就要从PCR的数学原理讲起。首先我们假定PCR的阈值为N。也就得到了1式，经过数学运算及整理就会得到3式，由于Ex在扩增中其实是一个定值，以及N也是我们人为设定的一个定值，那么该方程就变成了一个2元1次的方程，描述了Ct值与我们样本中初始浓度的线性关系。因此，我们就可以通过Ct值对样本的初始浓度进行定量计算。这就是我们关注Ct值的原因。

那么对3式再进一步的整理就会得到我们常见的线性回归方程，我们在做定量分析时通过标准曲线得到的线性回归方程就是这么来的。我们一般要求扩增效率在90-110%一直，那么标曲的斜率就在-3.85--3.10之间。

除了以上的原因，我们关注Ct值还与它的特点有关。首先是定量范围宽，我们知道如果两个样本之间的浓度差10倍，那么他们的Ct值就会差3.33个循环。我们的扩增曲线的Ct值通常会从10-40之间都有，那么就是30个循环，除以3.33，约为9左右。那就说明我们可以用定量PCR检测样本浓度相差10的9次方倍的样本。另外一个特点就是极具重现性，如图所示做96次重复，可以看到他们几乎从同一ct出现。这就是关注Ct值的原因。

那么我们是如何利用Ct值进行定量分析的呢？

通常包括绝对定量以及相对定量两种方式，具体原理见上图。

由于PCR反应板等耗材的材料并不是完全均一的，导致荧光信号会有所差异，以及仪器长时间没有校准清洁都会引起荧光信号的差异，导致不同反应孔本底荧光差异较大，导致实验结果不准确。通过ROX可进行校准荧光差异。（ROX是惰性染料，不参与PCR扩增，用来校准孔间差异，以及监控反应过程中反应液是否挥发了）

以上就是荧光定量PCR的基本原理。

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