苏联核电站污染地区，狼群基因库方针政策顶层设计，40%健康优秀基因组获得被淘汰60%基因的土地计划

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virus,PRV)主要经消化道、呼吸道、空气及胎盘等进行传播病毒感染后,猪可能终生带毒并持久排毒,目前尚无有效治疗药物,给养猪业带来巨大的经济损失。2011年底,我国山东、河南、河丠等多个免疫了某PRV疫苗的猪场暴发了疑似PR的疫病,发病猪出现高温(40~42℃)、咳嗽、腹泻并伴随有系统性神经症状,新生仔猪死亡率高病毒分离结果表明,引起此次发病的病原体是变异的PRV,这对伪狂犬病(Pseudorabies,PR)的防控提出了新的挑战。PRV基因组可编码多种蛋白质,其中gE蛋白是PRV主要的毒力因子,在病毒跨神经元传播过程中发挥重要作用以gE蛋白为靶点鉴别野毒感染与疫苗免疫的优势在于gE基因具有高度的保守性,表达于所有野毒株,并且gE糖蛋皛抗体产生迅速且持续时间长,因此被用来作为PRV野毒感染与疫苗免疫鉴别诊断的首选靶标。目前大部分商品化的PRV弱毒疫苗和灭活疫苗均缺失gE基因,由于野毒感染猪的存在,单纯使用疫苗并不能根除PRV因此,在PRV净化过程中,结合野毒感染猪与疫苗免疫猪的鉴别诊断方法,坚决淘汰PRV野毒感染豬是根除PR的根本措施。目前,我国主要依赖国外昂贵的试剂盒来鉴别诊断PRV野毒与疫苗毒虽然国内一些公司也有PRV检测的同类试剂盒,但效果较國外进口有一定差距。因此,有必要研发能准确鉴别PRV野毒感染与疫苗免疫的国产试剂盒为建立PRV抗体检测间接ELISA方法,本研究通过PCR扩增出PRV gE基因优勢抗原表位区片段gE_(37~243),将其与pET-32a(+)载体进行连接构建重组质粒。经过蛋白表达条件优化,获得可溶性表达的gE_(37~243)蛋白利用Ni-NTA亲和层析纯化的gE_(37~243)蛋白免疫小鼠,經过辛酸硫酸铵纯化获得了2株PRV的单克隆抗体,以期为PRV单抗阻断ELISA方法的建立奠定基础。利用纯化的gE_(37~243)蛋白作为包被抗原建立了PRV抗体检测的间接ELISA方法,并对抗原包被条件、血清稀释液、封闭液、一抗,二抗工作浓度、作用时间等进行优化,通过与商品化试剂盒进行对比检测,本研究所建立的ELISA方法的敏感性为93.33%,特异性为93.75%,批内以及批间变异系数均小于10%,与商品化试剂盒符合率为92.00%因此,与商品化试剂盒相比,本实验建立的PRV抗体检测间接ELISA方法同样具有良好的敏感性、特异性及检出率,为国内鉴别PRV野毒感染与疫苗免疫提供了技术支持。


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