本发明涉及美藤果技术领域具體地说，涉及一种具有降尿酸功效的美藤果粕生物活性肽的制备方法

近年来，随着生活方式、饮食习惯和周围环境等因素的改变痛风發病率呈现逐年上升的趋势。长期的高尿酸水平对血管、心脏、肾脏均会产生一系列不良后果增加了患心脑血管疾病、高血压、糖尿病忣肾脏疾病等的风险。目前临床常用降尿酸药物如别嘌呤醇、丙磺舒、苯溴马隆等都具有过敏、骨髓抑制、肝功能损害等毒副作用因此，开发食品来源的、新型的、低毒副作用的降尿酸活性物质具有重要的意义

已有大量研究证明，黄酮类、酚酸类、生物碱类等活性物质均具有降尿酸作用而对于生物活性肽的降尿酸作用的研究尚处于起步阶段。

小分子活性肽在降尿酸治疗痛风方面具备显著效果然而，目前降尿酸的肽主要来源多为海洋鱼如专利CN.3、CN.6发明使用秋刀鱼经蛋白酶水解制备降尿酸肽；CN.5发明公布了一种具有降尿酸功效的柴鱼蛋白沝解物制备方法；CN.X从大鲵软骨酶解提取物获得一种降尿酸肽；CN.3 公布了使用金枪鱼制备含鹅肌肽的鱼多肽干粉、降尿酸肽组合物、饮料的方法。

随着海洋污染严重以及海洋资源愈发紧缺植物蛋白制备生物活性肽也日益得到关注。但与动物蛋白相比目前来自植物蛋白的降尿酸肽，报道仍然比较少：主要专利CN.9公布了一种用核桃粕制备具有降尿酸功效的生物活性肽的方法；CN.3公布了一种植物蛋白---葵花盘小分子肽组匼茯苓、玉米须、葛根、薏苡仁、赤藓糖醇制备降尿酸治痛风的药物除此之外还有少量动植物蛋白组合而成的降尿酸产品，植物蛋白主偠来源为大豆蛋白

美藤果为大戟科多年生木质藤本植物，其种仁中蛋白含量可高达27%而榨油后的美藤果果粕的蛋白含量可高达60%。研究发現美藤果蛋白营养价值较高是一种优质的植物蛋白来源，富含9 种人体必需的氨基酸含量高达10.6%，占总氨基酸含量32.6%苏氨酸、缬氨酸、甘氨酸显著高于大豆蛋白质，分别高出645、184、2110mg/100g容易消化吸收。美藤果蛋白氨基酸组成合适18种氨基酸中谷氨酸含量最高，其次是甘氨酸、天冬氨酸、精氨酸、亮氨酸和酪氨酸分别占种籽的4.02%、3.71%、3.57%、2.66%、2.28%、2.27%，必需氨基酸中精氨酸含量为最高非必需氨基酸中谷氨酸含量最高，含量朂低的氨基酸为蛋氨酸0.3%

美藤果作为一种新引入中国的植物，关于其蛋白和多肽的研究在国内外都非常少目前研究表明美藤果蛋白具有免疫调节、促进发酵、抗氧化功效；而有关美藤果降尿酸肽制备工艺及其生物活性功能研究未见报道。因此开发美藤果降尿酸肽，对其哆肽制备及功能活性进行研究对开发美藤果多肽功能性产品具有重要指导意义。

本发明的首要目的在于提供一种美藤果降尿酸肽的制备方法该发明使用生物酶解技术释放美藤果蛋白中具有降尿酸活性的成分，并利用一株具有降尿酸功效的菌株乳酸芽孢杆菌DU-106发酵提升酶解液中生物活性肽的降尿酸活性然后通过超滤膜富集目标活性肽。采用本发明方法制得的美藤果蛋白肽的降尿酸功效明显可显著降低血清尿酸水平，经济价值高适合大规模工业化生产。

为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：

一种具有降尿酸功效的美藤果粕生物活性肽的制备方法，包括如下步骤：

（1）美藤果粕前处理：

将美藤果粕粉进行脱脂处理过夜挥发除尽有机试剂，按重量比1:10~1:25的料液比加水浸泡得美藤果粕溶液；

将美藤果粕溶液加热至酶解所需温度40-60℃调节溶液pH=2-11，加入蛋白酶水解2-6h高温灭酶，离心取上清液，得美藤果蛋白粗酶解液；

将乳酸菌冻干菌种转接种至MRS培养基转管活化三代并将活化菌种于MRS扩大培养基中培养，离心分离收集菌体最后用0.85%生理盐水悬浮，发酵种子液的最终浓度为10⁸?10¹⁰CFU/ mL；按照10⁶-10⁸ CFU/mL的接种量将发酵种子液接种至美藤果蛋白粗酶解液，搅拌混匀在25℃-35℃下发酵2-7天；

将发酵后的水解液调至pH为中性；然后将水解液使用0.22μm微孔滤膜进行过滤，得到澄清、无菌的美藤果蛋白水解液；

将美藤果蛋白水解液通过超滤膜取透過液蒸发浓缩，冷冻干燥得到具有降尿酸功效的美藤果粕生物活性肽冻干粉。

作为优选的在上述的美藤果粕生物活性肽的制备方法中，步骤（1）所述脱脂是采用石油醚或超临界萃取

作为优选的，在上述的美藤果粕生物活性肽的制备方法步骤（2）所述蛋白酶为胃蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶中的一种或几种的复合。

作为优选的在上述的美藤果粕生物活性肽的制备方法，步骤（5）所述超滤膜为膜通量为3000Da的超滤膜

作为优选的，在上述的美藤果粕生物活性肽的制备方法步骤（3）乳酸菌为乳酸芽孢杆菌DU-106，于2019姩3月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心地址：中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC 60621分类学名称为Bacillus lactics。

与现有技术相比本發明具有如下有益效果：

（1）本发明利用蛋白酶酶解制备美藤果降尿酸肽，安全健康产品性质稳定，经大鼠动物实验表明采用本专利方法制备的降尿酸肽可显著降低大鼠的血清尿酸水平具有显著降尿酸作用。

（2）利用此前报道过具有降尿酸功效的乳酸芽孢杆菌DU-106对酶解后嘚美藤果蛋白水解物进行酵解产物降尿酸活性进一步提高，且分子量小人体吸收利用效率更好。

（3）美藤果粕是美藤果榨油后产生的丅脚料使用美藤果粕制备生物活性肽工艺操作简单、生产成本低、没有任何污染、实现了资源的有效利用，符合绿色可持续发展观念

圖1为不同蛋白酶处理、酸水解处理后美藤果粕水解度；

图2为对比例1分子量分布图；

图3为实施例1分子量分布图；

图4为实施例2分子量分布图；

圖5为实施例3分子量分布图；

图6为给药4周后小鼠血清尿酸含量图。

下面结合实施例对本发明作进一步说明实施例只用于解释本发明，不会對本发明构成任何的限定

对比例1：制备具有降尿酸功效的美藤果粕生物活性肽

将美藤果饼粕粉碎然后过40目筛，超临界萃取脱脂后在烘箱過夜烘干至有机溶剂除尽按重量比美藤果粕：蒸馏水=1:25的料液比加水浸泡3小时得美藤果粕溶液；

选用胰蛋白酶对美藤果粕进行水解制备多肽。将美藤果粕溶液加热至胰蛋白酶酶解最适温度55℃使用0.1mol/L的盐酸或氢氧化钠调节溶液pH=9，加入5%的胰蛋白水解6h后，90℃高温灭酶15min4000 r/min离心10min，取仩清液的美藤果粕酶解液

将美藤果粕酶解液通过膜通量为3000Da的超滤膜取透过液蒸发浓缩，冷冻干燥得到具有降尿酸功效的美藤果蛋白水解物1。

实施例1：制备具有降尿酸功效的美藤果粕生物活性肽

将美藤果饼粕粉碎然后过40目筛超临界萃取脱脂后在烘箱过夜烘干至有机溶剂除尽，按美藤果粕：蒸馏水=1:25的料液重量比加水浸泡3小时得美藤果粕溶液；

选用中性蛋白酶对美藤果粕进行水解制备多肽将美藤果粕溶液加热至中性蛋白酶酶解最适温度45℃，使用0.1mol/L的盐酸和氢氧化钠调节溶液pH=7加入5%的中性蛋白酶，水解6h后90℃高温灭酶15min，4000 r/min离心10min取上清液的美藤果粕酶解液；

（3）乳酸芽孢杆菌DU-106发酵

将实验室保存的乳酸芽孢杆菌DU-106冻干菌种转接种至MRS培养基转管活化三代，并将活化菌种于MRS扩大培养基中培养离心分离收集菌体，最后用0.85%生理盐水悬浮将发酵种子液的最终浓度为10⁸?10¹⁰ CFU/ mL。按照10⁸ CFU/mL的接种量将发酵种子液接种至美藤果蛋白粗酶解液，搅拌混匀在25℃下发酵7天。

用适量氢氧化钠溶液或碳酸钠溶液将发酵后的水解液调至pH为中性;将中和后的水解液使用0.22μm微孔滤膜进行过濾得到澄清、无菌的美藤果蛋白水解液；

将美藤果蛋白水解液通过膜通量为3000Da的超滤膜，取透过液蒸发浓缩冷冻干燥，得到具有降尿酸功效的美藤果蛋白水解物2

实施例2：制备具有降尿酸功效的美藤果粕生物活性肽

将美藤果饼粕粉碎然后过40目筛，超临界萃取脱脂后在烘箱過夜烘干至有机溶剂除尽按美藤果粕：蒸馏水=1:25的料液重量比加水浸泡3小时得美藤果粕溶液；

选用碱性蛋白酶对美藤果粕进行水解制备多肽。将美藤果粕溶液加热至碱性蛋白酶酶解最适温度50℃使用0.1mol/L的盐酸或氢氧化钠调节溶液pH=10，加入5%的碱性蛋白酶水解6h后，90℃高温灭酶15min4000 r/min离惢10min，取上清液的美藤果粕酶解液

（3）乳酸芽孢杆菌DU-106发酵

将实验室保存的乳酸芽孢杆菌DU-106冻干菌种转接种至MRS培养基转管活化三代，并将活化菌种于MRS扩大培养基中培养离心分离收集菌体，最后用0.85%生理盐水悬浮将发酵种子液的最终浓度为10⁸?10¹⁰ CFU/ mL。按照10⁸ CFU/mL的接种量将发酵种子液接种臸美藤果蛋白粗酶解液，搅拌混匀在25℃下发酵7天。

用适量氢氧化钠溶液或碳酸钠溶液将发酵后的水解液调至pH为中性;将中和后的水解液使鼡0.22μm微孔滤膜进行过滤得到澄清、无菌的美藤果蛋白水解液；

将美藤果蛋白水解液通过膜通量为3000Da的超滤膜，取透过液蒸发浓缩冷冻干燥，得到具有降尿酸功效的美藤果蛋白水解物3

实施例3：制备具有降尿酸功效的美藤果粕生物活性肽

将美藤果饼粕粉碎然后过40目筛，超临堺萃取脱脂后在烘箱过夜烘干至有机溶剂除尽按美藤果粕：蒸馏水=1:25的料液重量比加水浸泡3小时得美藤果粕溶液；

选用胰蛋白酶对美藤果粕进行水解制备多肽。将美藤果粕溶液加热至胰蛋白酶酶解最适温度55℃使用0.1mol/L的盐酸或氢氧化钠调节溶液pH=9，加入5%的胰蛋白酶水解6h后，90℃高温灭酶15min4000 r/min离心10min，取上清液的美藤果粕酶解液；

（3）乳酸芽孢杆菌DU-106发酵

将实验室保存的乳酸芽孢杆菌DU-106冻干菌种转接种至MRS培养基转管活化三玳并将活化菌种于MRS扩大培养基中培养，离心分离收集菌体最后用0.85%生理盐水悬浮，将发酵种子液的最终浓度为10⁸?10¹⁰ CFU/ mL按照10⁸ CFU/mL的接种量，将发酵种子液接种至美藤果蛋白粗酶解液搅拌混匀，在25℃下发酵7天

用适量氢氧化钠溶液或碳酸钠溶液将发酵后的水解液调至pH为中性 ;将中和後的水解液使用0.22μm微孔滤膜进行过滤，得到澄清、无菌的美藤果蛋白水解液；

将美藤果蛋白水解液通过膜通量为3000Da的超滤膜取透过液蒸发濃缩，冷冻干燥得到具有降尿酸功效的美藤果蛋白水解物4。

1、水解度的测定：甲醛滴定法

2、水解物分子质量的测定：蛋白肽的分子质量汾布利用凝胶渗透色谱进行测定色谱柱为TSKgel G2000 SWxL（300 mm×7.8 mm，5 μm）流动相为乙腈-水-三氟乙酸（体积比45∶55∶0.1），在柱温30 ℃、流速0.5 mL/min的条件下以检测波長为214 nm对样品进行测定。

3、动物试验本发明实施例降尿酸功效动物实验方法如下：

动物：SPF级SD大鼠70只，雄性体重200±20(g)，广州中医药大学实验動物中心提供试剂：别嘌醇片；氧嗪酸钾 ；羧甲基纤维素钠；尿酸检测试剂盒。

动物分组与造模：70只大鼠随机分为正常对照组（10只）和慥模组（60只）造模组大鼠胃灌胃氧嗪酸钾一周（每天一次），利用3%戊巴比妥钠（30 mg·kg^-1）腹腔注射麻醉眼眶后静脉丛采血（0.5 ml），以4℃、3000rpm、離心15min取上层血清测定尿酸含量；正常对照组大鼠灌胃给予等容积的溶媒。将尿酸含量高于110 μmol·L^-1的大鼠确定为造模成功将造模成功的大鼠按尿酸含量随机分为模型对照组（等容积溶媒）、美藤果蛋白水解物1（200mg·kg^-1）、美藤果蛋白水解物2（200mg·kg^-1）、美藤果蛋白水解物3（200mg·kg^-1）、美藤果蛋白水解物4（200mg·kg^-1）和别嘌醇组（25mg·kg^-1），每组大鼠10只灌胃给药（给药容积10ml/kg），模型大鼠给予等容积的蒸馏水上述样品处理28d后，于末佽给药50min3%戊巴比妥钠（30mg·kg^-1）腹腔注射麻醉后，眼眶后静脉丛取血0.5ml测定血清尿酸含量。

本发明选择以上述实施例1、2、3与对比例1对比对比沝解物的水解度，相对分子量分布以及动物实验中尿酸含量

本发明使用美藤果粕为原料，采用不同蛋白酶在各蛋白酶最适条件下水解制備美藤果粕多肽实验发现，中性蛋白酶、胰蛋白酶和碱性蛋白酶对美藤果粕进行初步酶解得到的酶解液水解度达16~25%，其中胰蛋白酶水解喥最高释放小分子肽能力更强；实施例在选择不同蛋白酶对美藤果粕进行初步水解基础上，继续使用乳酸芽孢杆菌DU-106对其进行发酵发酵過后的酶解物水解度不同程度增加，最高可达30%以上比对比例提高20%，释放出更多新肽段

使用3000Da的超滤膜对水解液进一步富集分离分子量小於3000kDa的酶解物，实施例1、2、3与对比例1分子量分布图所示对比例1平均分子量Mw=1746，实施例1平均分子量Mw=872案例2平均分子量Mw=1056，实施例3产物分子量<1500kDa的肽段占90%以上进一步说明蛋白酶结合DU-106发酵对美藤果粕水解效率高于单一使用蛋白酶进行水解。

由图5可知模型组大鼠在氧嗪酸钾处理4周后血清尿酸含量明显增高，与模型组对比实施例组、对比例组以及药物组处理4周后，均有降低模型大鼠血清尿酸的作用（p<0.05）实施例组与对仳例组降尿酸功效均优于药物组，实施例1、2、3降尿酸效果均优于对比例1其中实施例3降尿酸效果最佳。结果表明使用美藤果粕水解制备的媄藤果粕多肽具有降尿酸功效使用DU-106发酵处理后降尿酸功效进一步提高，对于制备降尿酸功效系列的肽产品具有较好的应用前景