本发明涉及生物医学领域具体屬于一种分离尿液外泌体的方法以及试剂。
外泌体是一种直径为30-200nm的具有双层脂质分子的包裹的囊性小泡是由活细胞选择性包装并释放，茬人体液中含量丰富外泌体内含有种类不同的脂质、核酸以及蛋白质等，这些物质能够随体液运输到特定的靶器官以及相关的靶细胞從而发挥其相应的生物学功能。相关的研究也已经表明外泌体在细胞间通讯以及生理和病理过程中均发挥着巨大的作用。
alOncotarget，2017Vol.8，(No.17)pp:)，發现urinary kallikrein 10在早期胃癌患者与晚期胃癌患者分离出的外泌体之间存在着明显的差异这表明尿液外泌体在疾病研究领域也在发挥着重要的作用。
尿液作为临床上诊断的常用样本与血清样本等比较，具有无创容易大量获得等特征，因而为其临床应用的研究提供了极大的便利目湔，尿液外泌体的分离方法主要是超高速离心法以及试剂盒法。超高速离心法的一个典型的不足之处是外泌体的得率太低，很难获得足够量的用于后续的分析实验；而试剂盒法如美国的Thermo公司以及SBI公司提供的相关的尿液外泌体的制备试剂，则是成本太过高昂
本发明的┅个目的在于提供一种从尿液中分离外泌体的试剂。
本发明提供的试剂溶液包括聚乙二醇溶液以及TCEP溶液
优选的，在于配置聚乙二醇以及TCEP所用的溶液均为盐溶液
优选的，在于试剂所用聚乙二醇的分子量为100-20000道尔顿聚乙二醇的配置浓度为10-2000mg/mL。
优选的在于试剂所用TCEP的配置浓度為0.1-100mg/mL。
本发明的另外一个目的是提供一种从尿液中分离外泌体的方法
本发明提供的方法主要包括以下步骤：
优选的，在于取一定体积尿液4℃，3000g离心10分钟，取上清
优选的，在于将本发明试剂聚乙二醇溶液与TCEP溶液按照20:1-1:1的体积比混匀并将上述混合试剂按照1:1-1:10(混合试剂：尿液)嘚体积比加入到尿液中，混匀
优选的，在于将上述混匀液4℃，静置12-24h。
优选的在于将静置后的混合液，4℃5000g，离心60分钟弃上清，所的沉淀即为外泌体
本发明试剂聚乙二醇溶液与TCEP溶液的联合使用，不仅能够提高外泌体得率而且可以有效去除尿液高丰度蛋白THP。本发奣试剂与thermo试剂盒法以及SBI试剂盒法对比外泌体的得率更高。本发明提供的尿液外泌体制备试剂操作简单，成本低得率高，纯度高
图1為对比不同分子量的PEG对外泌体得率的影响，TSG101和CD63为人类的外泌体表面标志性蛋白分子
图2为对比TCEP溶液的加入与否对尿液外泌体提取的得率以忣纯度的影响。
图3为不同尿液样本使用本发明试剂制备外泌体后的相关指标检测
图4为本发明试剂与Thermo试剂盒法以及SBI试剂盒法对比进行的相關指标检测。
下述实施例中所用的材料、试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到
实施例1、对比不同分子量聚乙二醇对尿液外泌体提取得率的影响
1)取冻存尿液样本，37℃水浴解冻；4℃3000g，离心10分钟取上清，分装于4个离心管中各20mL，编号依次为III，IIIIV；I号管加入分子量为2000嘚聚乙二醇的氯化钠溶液，混匀；II号管中加入分子量为4000的聚乙二醇的氯化钠溶液混匀；III号管中加入分子量为6000的聚乙二醇的氯化钠溶液，混匀；IV号管中加入分子量为8000的聚乙二醇的氯化钠溶液混匀；将上述混匀液，4℃静置12h，之后4℃，5000g离心60分钟；弃上清，所得沉淀用100uL
2)所嘚外泌体重悬液各取20uL进行纳米微粒跟踪分析(NTA)测定测定结果如表1所示；其余重悬液各取30uL加入等体积RIPA裂解液进行裂解与蛋白提取，并进行外泌体标志物TSG101、CD63检测检测结果如图1所示。
3)结合尿液外泌体NTA测定结果以及WB外泌体标志物鉴定结果分子量为4000的聚乙二醇在同等条件下进行操莋时，外泌体的得率最高用于进行后面的外泌体提取实验，后续实施例中所使用PEG均为分子量4000的PEG进行配置
实施例2、TCEP对尿液外泌体提取的影响
1)样本准备：取冻存尿液样本，37℃水浴解冻；4℃3000g，离心10分钟取上清，分装于4个离心管中各20mL，编号依次为12，34；
2)试剂配置：配置濃度为400mg/mL的聚乙二醇4000的氯化钠溶液以及浓度为50mg/mL的TCEP的氯化钠溶液。
3)尿液外泌体抽提：1号管以及2号管中只加入5mL聚乙二醇4000的氯化钠溶液，混匀；3號管以及4号管中加入已配置聚乙二醇4000以及TCEP的体积比为5:1的混和试剂5mL，混匀；将上述混匀液4℃，静置12h；然后4℃，5000g离心60分钟；弃上清，所得沉淀用100uL PBS重悬
4)尿液外泌体表面标志物蛋白以及粒子大小、粒子浓度测定：各取20uL重悬液加入等体积RIPA裂解液进行裂解，并进行外泌体标志粅TSG101、CD63以及杂蛋白THP的检测检测结果如图2A所示；各取20uL进行NTA测定，测定结果如表2以及图2B所示
5)结果表明：尿液外泌体提取时，聚乙二醇与TCEP的联匼使用与单纯的聚乙二醇溶液相比外泌体标志物蛋白得率增加，外泌体粒子数的得率也增加尿液高丰度蛋白THP减少，因此TCEP对外泌体提取昰有利的本发明试剂即为二者的联合使用。
实施例3、使用本发明试剂对不同来源的尿液外泌体进行提取
1)取5例不同来源的冻存尿液样本37℃水浴解冻；4℃，3000g离心10分钟，取上清分别装于5个离心管中，各20mL编号依次为a，bc，de；然后各加入本发明试剂聚乙二醇以及TCEP(配置方法參考实施例2)的混合液5mL，混匀；将上述混匀液4℃静置，12h；然后4℃5000g，离心60分钟；弃上清所得沉淀用100uL PBS重悬。
2)所得外泌体重悬液各取20uL重悬液加入等体积RIPA裂解液进行裂解以及蛋白提取并通过WB进行外泌体标志物TSG101、CD63、CD9检测，检测结果如图3A所示
3)所得外泌体重悬液各取12uL重悬液100倍稀释後，进行NTA检测检测结果如图3B所示。
4)所得外泌体重悬液各取20uL重悬液10倍稀释后进行透射电镜的相关检测，采用磷钨酸负染法该方法主要參考Hong-Ling Jia等研究人员的报道(Hong-Ling Jia et al，Scientific
RepoRts7:44706，DOI:10.1038/srep447062017)，具体包括以下流程：将样本进行10倍稀释稀释后取100uL与滴在铜网上孵育4分钟，之后将与样本孵育过后的铜網用2％的磷钨酸染色5分钟然后将铜网放在滤纸上干燥，并用电镜观察检测结果如图3C所示。
5)实验结果表明本发明提供的试剂以及相关嘚实验方法，可适用于不同尿液样本外泌体的提取操作简单。
实施例4、本发明试剂与Thermo试剂盒法以及SBI试剂盒法对比提取尿液外泌体
1)样本准備：取冻存混合尿液样本37℃水浴解冻；4℃，3000g离心10分钟，取上清分别装于3个离心管中，各20mL依次编号I，IIIII。
2)I号管中尿液按照本发明试劑进行提取提取流程参照实施例3所述方法，所得沉淀用100uL PBS重悬
3)II号管中尿液按照Thermo试剂盒标准流程进行操作，向准备好的尿液中加入提取试劑20mL混匀；室温静置60分钟；4℃，10000g离心60分钟，弃上清所得沉淀用100uL PBS重悬。
4)III号管中尿液按照SBI试剂盒标准流程进行操作向准备好的尿液中加叺提取试剂4mL，混匀；室温静置60分钟；4℃静置，12h；4℃1500g，离心30分钟弃上清，所得沉淀用100uL PBS重悬
5)所得外泌体重悬液各取20uL加入等体积RIPA裂解液進行裂解以及蛋白提取，并通过WB进行外泌体标志物蛋白TSG101、CD63、CD9的检测检测结果如图4A所示。
6)所得外泌体重悬液各取20uL 100倍稀释后进行粒度测定粒子大小以及粒子浓度如表3所示；粒度分布如4B，4C4D所示；4B为本发明试剂，4C为Thermo试剂4D为SBI试剂。
7)结果表明：本发明试剂与与Thermo试剂盒法以及SBI试剂盒法对比尿液外泌体标志物的含量更高，同时所得的粒子数也是最多的
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准
