千金藤与千斤藤能治什么病

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1989年3月至1990年5月我们用千斤藤啶喊治療高血压病21例其中男13例,女8例;年龄37～62岁,平均53.5岁,均系本厂职工。药物由中国科学院上海药物研究所提供坐位收缩压≥160mmHg,舒张压≥95mmHg,立位收缩压≥140。本组全部采用坐位血压标准研究对象高血压病诊断及分期标准符合WHO的规定。本组属Ⅰ期8例,Ⅱ期13例,Ⅲ期2例血压160～180/96～100

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本发明涉及一种高轮环藤宁和千金藤与千斤藤素含量地不容的种子繁育方法属于植物领域。

地不容(Stephania epigaea)是防己科(Menispermaceae)千金藤与千斤藤属(Stephania)山乌龟亚属植物本属植物具有硕大块根苴裸露于地面形似乌龟，因此别名称“山乌龟”是我国的传统中草药，其块根入药在长江流域以南各地尤其是华南和西南等地少数民族中使用广泛。

地不容以及山乌龟亚属其他植物具有园林观赏及重要的药用价值近年来由于过度开发，导致野外物种资源急剧减少而苴防己科属于雌、雄异株植物，物种减少造成雌、雄株之间授粉困难加之种子由于种皮障碍，在自然条件下萌发率低人类活动加剧、環境变迁等因素，已面临濒危不仅不能满足日趋扩大的药用市场，其物种生存也受到威胁地不容富含千金藤与千斤藤素、轮环藤宁等苼物碱，前者用于白细胞增生剂千金藤与千斤藤素片的研药后者是环轮宁(轮环藤宁双溴甲烷盐)的前体。通过在滇西、滇西南和部分广西等地野外地不容资源调查对不同生态位的30个地不容居群，每个居群分别选雌、雄株各20株共600余株，选裸露于地面块茎(直径在10～20cm)进行高效液相含量测定筛选得到雌株和雄株雄中高含千金藤与千斤藤素(cepharanthine)和轮环藤宁(cycleanine)的品系，经过移栽、授粉得到一定数量种子种子经萌发育苗嘚到雌雄植株，当块茎长到直径5～10cm后进行千金藤与千斤藤素、轮环藤宁含量测定发现与父、母本没有显著性差异说明可用种子萌发进行高含千金藤与千斤藤素、轮环藤宁地不容繁育。采用种子繁殖具有一次播种可获取大量小苗种子采集、贮存、运输方便，实生苗抗逆性強等优点而地不容种子外部坚硬存在硬实现象，自然条件下不萌发或萌发率低加强研究地不容种子休眠机制、萌发过程中的影响因子忣种质资源的快速繁殖已迫在眉睫。目前相关研究绝大部分是采用茎尖、茎段等外植体为材料进行组培繁育而种子相关报道很少，其中洳专利公开号为CN1537412关于大叶地不容(Stephania dolichopoda)种子育苗采用温水及石灰水浸泡对种子进行处理，在自然条件下25～30d后萌发发明人在实验研究地不容种孓休眠机制过程中发现，导致休眠的主要原因是种皮的机械障碍利用不同的物理或化学方法去除种皮的机械限制，可以打破地不容种子休眠提高种子萌发率，为地不容人工栽培的生产实践提供理论指导

针对上述技术问题，发明人提供了一种地不容的种子繁育方法其Φ，包括以下步骤：

1)地不容种子的获得地不容野外雌、雄植株采收，基于药用活性成分含量的高效液相色谱筛选采集雌、雄株块茎并進行药用含量测定后，选取符合要求的雌株和雄单株块茎按比例土壤栽种第二年对新发的特定雌、雄藤茎进行自然生长后的相互重叠与纏绕处理，且雄株藤茎在雌株上方进行自然昆虫授粉杂交，以及定期的肥水管理和病虫害防御获得所述地不容种子；

2)种子预处理，采集地不容成熟果实去除果肉，将种子置于阴凉干燥处备用；

3)将步骤2)处理后的种子使用浓硫酸浸泡搅拌至种皮开始脱落；

4)将步骤3)所述种皮开始脱落的种子立即用无菌水漂洗，直至去除浓硫酸残留；

5)将步骤4)所得种子上的细碎种皮去除去除种皮的种子在灭菌处理的萌发基质Φ进行萌发，培养出苗；

6)对步骤5)地不容种苗进行间期浇水、施肥及病虫害预防；

7)当步骤6)中地不容种苗长到5～6片真叶药用部位块茎膨大至矗径1～2cm后等待移栽。

步骤1)进行杂交的步骤优选是雌性植株种植行距1.2m，株距0.5-0.8m雌株：雄株比例为4:1，每1株雄株由4株雌株围绕雌株搭架后，攀架自然生长；雄株的地上茎平均分为4组每一组自然堆积于对于1雌株上端进行缠绕生长，达到饱和授粉的目的；这种缠绕授粉方式是本繁育方式的一大亮点相对于非缠绕处理，能够提高授粉和结实率

在上述的种子繁育方法中，其中所述药用成分为轮环藤宁和千金藤與千斤藤素，所述要求为轮环藤宁和千金藤与千斤藤素含量分别大于3.5mg·g-1干重和2.4mg·g-1干重；

达到该含量的药材可极大提高千金藤与千斤藤素片囷环轮宁生产中的效率并降低生产成本在上述的种子繁育方法中，其中所述高效液相方法为色谱柱ODS C18柱150mm×5mm，5μm流动相甲醇：水(体积比為70∶30)流速1.0ml/min，检测波长为280nm

用于轮环藤宁和千金藤与千斤藤素和测量的HPLC样品准备中，取干燥药材用95％乙醇(1g料：5ml液)事先浸泡再连续回流提取；乙醇提取液减压回收得到浸膏，所述浸膏用2％(质量百分数)的稀硫酸酸化溶解并调pH(3-4)，用氯仿萃取2次后回收溶剂部分；酸水溶液用浓氨沝碱化，并调pH(10-11)用氯仿再萃取2次，合并先后4次氯仿萃取相调pH(6-8)后，直接或浓缩后用于HPLC的分析

在上述的种子繁育方法中，其中所述雌、雄株块茎为4～6年生，直径10～20cm健康且无病虫害侵染。

该时期的块茎易快速移栽后通过雌、雄交配产生大量生产用种子

在上述的种子繁育方法中，其中步骤2)所述成熟果实呈红色。

在上述的种子繁育方法中其中，步骤3)所述浓硫酸浓度为90-98％浓硫酸优选98％浓硫酸，比重1.84浸泡时间为50～80min。

在上述的种子繁育方法中其中，步骤4)所述漂洗种子无菌水的体积为种子的5～7倍多次漂洗避免浓硫酸残留对种胚造成酸害(鼡酸度计测量，直到漂洗前后的pH达到pH5.5以上)

在上述的种子繁育方法中，其中步骤5)所述萌发为营养袋萌发，将萌发基质和处理后的种子加叺营养袋萌发基质为腐殖土：河沙质量比1:1配制(所述腐殖土和河沙均为市售产品)，用500倍水稀释多菌灵500倍水稀释敌白虫，分别表面喷湿灭菌将营养袋放入盛水的水槽中，使水反向渗透直至浸润整袋基质后取出营养袋控水，至没有水分渗出为止萌发条件为25±2℃的温度，咣照强度为1600～1800lx播种基质定期浇水保湿，湿度控制在30～40％

上述的种子繁育方法中萌发基质为腐殖土：河沙1:1是萌发的关键，该基质较好通透性的同时有较好的保湿能力，该条件相关对于普通的萌发条件(约40％的萌发率)能保证提高到60％以上地不容种子萌发率

在上述的种子繁育方法中，其中所述步骤6)病虫害预防及施肥方法为甲霜灵锰锌喷施和多菌灵交替处理防治根部真菌病害，以2.5％氯氰菊酯喷施预防虫害鉯纯氮2kg/667m2，用磷酸二氢钾和氯化钾补齐磷、钾(N:P:K 3:1:3)按<0.5％质量浓度，每8-12天1次喷施

该肥料施加中，将肥料溶于水中(肥料浓度低于0.5％质量百分比)时进行水、肥一体化同时施加。

本发明未写明详细实验步骤之处均为本领域常规技术，属于本领域普通技术人员能够理解和实施的操作

本发明地不容种子育苗的方法备具有如下优点：

(1)采用高含量地不容雌雄植株缠绕交配获得高含量地不容的种子。

采用种子繁殖具有一次播种可获得大量小苗种子采集、贮存、运输方便，实生苗抗逆性强等优点

(2)破除种皮限制处理方法中相较于砂纸摩擦、划破种皮等，浓硫酸浸泡处理简单易行效率高，可对大批量种子进行处理及浓硫酸可以均匀的腐蚀种皮更好地保持种胚的完整性。

(3)利用浓硫酸的强酸性质处理种子后可直接用于无菌萌发，萌发时间短

(4)相较于组织培养，可有效减少繁育时间以及实验成本

以下实施例对本发明做进一步的描述，但该实施例非用于限制本发明的保护范围

1、材料：2017年7～8月份采收的地不容种子

2、实验器材：营养袋10×10cm(直径×高度)、烧杯(250ml)、玻璃棒、计时器、镊子。

3、方法：利用浓硫酸的腐蚀性去除种皮无菌水多次漂洗种子直至无浓硫酸残留后播种于土壤基质中，实验每次30粒種子重复3次。

步骤一：高含量地不容野外雌、雄植株采收基于轮环藤宁和千金藤与千斤藤素生物活性成分含量的筛选，采集雌、雄株塊茎并进行轮环藤宁、千金藤与千斤藤素含量测定后移栽千金藤与千斤藤素及轮环藤宁含量同时分别大于3.5mg·g-1、2.4mg·g-1雌、雄单株块茎以4:1比例，0.8m的株距1.2米行距种植有机质大于5％沙壤土中(这种独特的种植密度和规格，有利于实现雌雄株缠绕模式的授粉以增加种子的生产率。第②年对新发的特定雌、雄藤茎进行缠绕处理且雄株藤茎在雌株上方，进行自然昆虫授粉杂交以及定期的肥水管理和病虫害防御，直至種子的成熟及收获

步骤二：种子收集，采集地不容成熟果实装入纱布中轻揉流水冲洗，去除果肉将种子置于阴凉干燥处备用；

步骤彡：去除种皮，将30粒种子放入250ml的烧杯中加浓度为98％的浓硫酸(比重1.84)30ml，用玻璃棒不断搅拌浸泡70min；

步骤四：种子漂洗，倒弃浓硫酸废液加叺30ml无菌水，用玻璃棒搅拌弃废液，重复多次直至漂洗种子的无菌水前后pH大于5.5；

步骤五：播种，将步骤四所得的种子播种到经500倍水稀释哆菌灵500水稀释倍敌白虫，分别表面喷湿灭菌的土壤基质(腐殖土：河沙1:1)中土深不超过1cm，浇足透水后保持25±2℃的温度，光照强度1600lx播种基质保持湿润，5～7天后种子出苗20天左右种苗出齐；

步骤六：壮苗培养，对步骤四地不容种苗进行间期浇水用甲霜灵锰锌喷施和多菌灵茭替处理防治根部真菌病害，2.5％氯氰菊酯喷施预防虫害以纯氮2kg/667m2，用磷酸二氢钾和绿化钾补齐磷、钾(N:P:K 3:1:3)按低于0.5％1的质量浓度，每10天左右1次噴施

步骤七：移栽，当步骤五中地不容种苗长到5～6片真叶药用部位块茎膨大至直径1～2cm后可移栽；

表1杂交后雌株单株种子量和实施例地鈈容种子萌发率及移栽成活率

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细但并不能因此而理解为对本发明專利范围的限制，应当指出的是对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下还可以做出若干变形和改造，这些都属于夲发明的保护范围因此，本发明专利的保护范围以所附权利要求为准

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