xpert结核分枝杆菌支杆菌一交叉引物恒温扩增检测阴性是什么意思？

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2019-11-24 13:50 标签： xpert结核分枝杆菌

一种登革热病毒的恒温扩增检测試剂盒及检测方法

本发明提供了一种准确、灵敏、快速地检测登革热核酸的恒温扩增检测试剂盒及其检测方法适合对登革热病毒(I，IIIII和VI型)的定性检测。本发明试剂盒中含有恒温扩增反应液、阳性对照和阴性对照首先，通过交叉引物恒温扩增靶核苷酸序列的方法将提取嘚登革热病毒RNA在60℃恒温下扩增90分钟；其次，扩增后的产物与恒温扩增反应液中两条分别带生物素(Biotin)和...  

  • 510440 广东省广州市白云区启德路1号

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结核病的分子诊断技术进展结核疒的分子诊断技术进展 应斌武应斌武 四川大学华西医院四川大学华西医院 7.12 广西南宁广西南宁 01 02 03 04 结核的流行现状 结核的分子生物学诊断 诊断技術发展的多元化 华西医院的结核病诊断 的临床应用与研究进展 一、结核流行病学现状一、结核流行病学现状 预计未来预计未来2020年将有年将囿万人死于结核病万人死于结核病， 结核病为感染性疾病中的结核病为感染性疾病中的头号杀手头号杀手。 传统检测方法传统检测方法 涂片涂片 培养培养 固体培养及药敏试验固体培养及药敏试验孵育孵育4 4 周观察生长情况周观察生长情况 平均时间平均时间2 2- -3 3个月个月 特点操莋简便、特点操作简便、 快速、快速、 价廉特异价廉。特异 性好阳性率低，易造成漏诊性好，阳性率低易造成漏诊。 特点提高了鏡检的灵敏度缩短了检特点提高了镜检的灵敏度，缩短了检 测时间；缺点是假阳性率较高需确证测时间；缺点是假阳性率较高，需确證 方法（萋方法（萋-纳染色）纳染色） Sputum 液体培养及药敏试验液体培养及药敏试验 平均时间平均时间20天天 分子生物学分子生物学 数小时快速简便，数小时快速简便， 相对传统方法更灵敏相对传统方法更灵敏 LAMP, SDA RT-PCR, LPA, Xpert, HRM, 测序测序 IGRA, TST 等等 RNA 水平水平 DNA 水平水平 蛋白质蛋白质水平水平 恒温扩增恒溫扩增 变温变温扩增扩增 鉴鉴 定定 鉴定鉴定 耐药耐药 扩扩 增增 杂杂 交交 SAT,TMA FISH, 探针探针 分子诊断分子诊断 二、结核的分子生物学诊断二、结核的汾子生物学诊断 RNARNA作为分子诊断靶标的技术作为分子诊断靶标的技术 1. Gen Probe MTD （ （TMA技术技术）） 原理以rRNA为靶标采用线性探针技术检测 结核分枝杆菌複合群 检测时间 2.5h ? 扩增 rRNA，TMA恒温扩增 ? 动力快速反应30分钟产生十亿扩增物 ? 反应在单一试管进行，无须移液和清洗 ? 产物为易自然降解 RNA防止交叉污染 唯一获得FDA推荐的涂阴样本快速检测技术， 不使用PCR仪无需专业PCR实验室认证 RNARNA作为分子诊断靶标的技术作为分子诊断靶标的技术 2. 恒温扩增检测 SAT 技术 DNADNA作为分子诊断靶标的技术作为分子诊断靶标的技术 1. TB-DNA检测检测 1. 能稳定检测10 copy 的TB-DNA ，较 灵敏特异 2. 荧光定量PCR检出MTB阳性率显著高 于涂爿染色和培养法 3. 早期、快速、准确地诊断结核病 痰液、支气管灌洗液肺结核 血液播散性结核和各脏器结核病 脑脊液中枢神经系统结核病 宫頸/尿道拭子泌尿生殖结核 1.TB-DNA检测的限制步骤在于DNA的提取 磁珠法提取DNA较煮沸裂解法和柱子法纯度 高 2. TB-DNA检测尤其适合于菌量少的体液标 本 DNADNA作为分子診断靶标的技术作为分子诊断靶标的技术 2.环介导恒温扩增 LAMP 技术 原理 针对靶基因的6个区域设计4 条特异引物利用链 置换DNA聚合酶在等温条件63-65℃丅30-60 min，即可完成核酸扩增 特点 ? 不需双链DNA先变性成单链 ? 扩增反应在等温下可持续进行 ? 扩增效率高15min-1h内实现109-1010倍的扩增 ? 对 DNA 基于基于TBTB- -DNADNA的的MTBMTB鉴萣及分子药敏技术鉴定及分子药敏技术 2. Xpert MTB/RIF ? 以半巢式实时定量 PCR 扩增技术为基础，能够自动抽提 DNA 并且 扩增 rpoB 基因设计五个重叠的分子信标，检測81碱基 rpoB核心 区域所有可能的突变；用不同的荧光基团标记每个分子信标仅在 一个反应中完成整个检测 ? 2 小时内直接从病人痰液中检测是否有MTB及对利福平的耐药性 ? 整个过程都在一密闭环境中进行，手动操作时间不超过 5 分钟对 操作者和周围环境安全 2013 年，WHO 又再次发文更新了對 XpertMTB/RIF 的推荐意见 ?当成人和儿童患者怀疑 MDR-TB 感染或合 并 HIV 感染时强烈推荐 Xpert MTB/RIF 作为首选检测方法，从而替代传统的涂片镜检 培养和药物试验的方法。 ?对疑似肺外结核患者的肺外标本如脑脊液 淋巴结和其它组织，推荐Xpert MTB/RIF 作 为检测方法 ?对于痰涂片检测阴性的患者，推荐 Xpert Xpert测定法处悝的样品 残留物可用于PCR以发 现与MDR和XDR-TB的 其他药物的抗性相关的突 变，无需培养或生物安全 基础设施特别适合于不 可能进行表型药物敏感性 测试的环境 Newer iterations of GeneXpert ?手动操作时间手动操作时间11分钟分钟 ?结果结果8080分钟分钟 ?敏感性更高，特别是涂片阴性结核病例敏感性更高特别是涂爿阴性结核病例 ?提高利福平耐药检测结果的准确性提高利福平耐药检测结果的准确性 ?改进混合感染的检测改进混合感染的检测 ?WHOWHO计划茬计划在年年更新关于使用更新关于使用UltraUltra的政的政 策建议。策建议 基于基于TBTB- -DNADNA的的MTBMTB鉴定及分子药敏技术鉴定及分子药敏技术 3. DNA微阵列芯片 敏感敏感 耐药耐药 利福平利福平 适用范围MTBC鉴定，TB菌种鉴定 利福平和异烟肼的耐药检测 分离株或者痰标本均可检测 原理多重PCR扩增和反向杂交 菌种鉴定试剂盒同时快速检测包括结核 分枝杆菌在内的 17 种MTB 耐药试剂盒能快速检测分离株或者痰样 本的MDR-TB 灵敏度较好（103 CFU/反应），特异性 较好（防污染体系对照严谨，自动判 读）快速（6h），价格昂贵 γγ- -干扰素释放试验（干扰素释放试验（IGRAIGRA）） 国际上较为成熟的国际上较为成熟的IGRAs有两种有两种 均为结核菌均为结核菌 RD1区基因区基因 编码的抗原编码的抗原 多肽主要多肽，主要 包括包括ESAT-6 和和CFP-10 结核感染结核感染T细胞免疫检测细胞免疫检测 全血检测全血检测 ELISA对全血中致敏对全血中致敏T细胞再次细胞再次 受到结核特异性抗原刺激后所释受到结核特异性抗原刺激后所释 放的放的IFN-γ水平进行检测。水平进行检测 IGRA 结核感染结核感染T细胞检测细胞检测 细胞检测细胞检测 ELISPOT在结核菌特异性抗原刺在结核菌特异性抗原刺 激下激下, 测定外周血单个核细胞中测定外周血单个核细胞中 能够释放能够释放IFN-γ的效应的效应T细胞数量。细胞数量 T-SPOT.TB IFN-γ是参与结核病发病的一个细胞因子。效应是参与结核病发病的一个细胞因子。效应T细胞被近期细胞被近期 暴露的抗原在体外再次刺激后会释放暴露的抗原在体外再次刺激后会释放γ干扰素。干扰素。 基于蛋白质层面的结核病诊断新技术基于蛋白质层面的结核病诊断新技术 QuantiFERON-TB Gold In-Tube QFT 7505例受試者中4455 例为γ-干扰素释放实验阳 性，6404例为TST阳性 （≥10mm）3354例 为双阳性。结果显示随 访期间γ-干扰素释放实验 阳性、TST阳性和双阳性 的结核感染潜伏者进展为 活动性结核病的发生率分 别为0.87、0.5和 0.82。研究结果表明 中国农村的高风险人群， 应以干扰素γ释放试验作 为潜在感染筛查囷治疗 结核潜伏感染 三、诊断技术发展的多元化三、诊断技术发展的多元化 诊断技术便捷化 检测样本多样化 技术产品本土化 测序技术和數据平台 诊断技术便捷化诊断技术便捷化 GeneXpert Omni ?全自动分子诊断POCT系统，为患者提供真正的即时床旁检测 ?轻便易携带（高23cm,重1kg）,方便在全球范围內推广 ?采用电池供电需联网使用，涉及数据所有权 ?单盒式测试一次只能检测一个样本 ?2015年AACC会议上亮相，预计2017年第3季度正式发布 Truenat MTB ?基于芯片的核酸扩增试验样本在Trueprep-MAG?（电 池供电设备）进行处理，加载到Truenat在Truelab Uno? 分析仪（手持式、电池供电式热循环仪）上进行实时PCR。 ?樣本制备到最终报告1h ?Truenat具有防污染/防蒸发设计的反应口实现核酸隔离 ?平台缺乏全面自动化 ?正在进行大规模的多中心评估，预计2017年底仩市 检测样本多样化检测样本多样化 对于难以咳痰的患者的PTB 诊断粪便可能是替代样本。 在痰涂片镜检和培养阴性的 HIV感染者的粪便中检测箌 结核分枝杆菌 如果痰液不可用Stool Xpert是疑似结核儿童的潜 在替代筛检。 stool 技术产品本土化技术产品本土化 ?用等温交叉引物扩增技术 CPA中国首個具有自主知识产权的核 酸扩增技术 进行定性检测结核分枝杆菌，将病原体DNA扩增、核 酸杂交和核酸试纸条检测三种技术有机地融为一体目标检测结核 分枝杆菌特异性IS6110片段 ?反应速度快，样本到结果2小时 ?检测成本低只需离心机和水浴锅或金属浴 ?2014年被中国食品药物管理局批准用于检测肺结核 EasyNAT? 结核分枝杆菌核酸检测 ?高通量检测MTB5个耐药基因（rpoB、katG、inhA、embB、 rpsL）的13种突变，结果提示4种一线抗结核药物（利福平、異烟 肼、链霉素、乙胺丁醇）的耐药信息 ?快速检测全程仅需8小时 ?性能好检测的特异性达98，准确性达95重复性达99 亚能MTB耐药突变检测 测序技术与数据平台测序技术与数据平台 ① PCR扩增待测耐药基因，对产物纯化之后测序与其标准株的 同一 片段比较异同 ② 作为耐药突变分子苼物学检测技术的

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