：联合应用folkman抗血管管生成和免疫治疗以治疗肿瘤和转移的方法

本发明涉及基于一种folkman抗血管管生成治疗和一种有针对性抗肿瘤免疫治疗联合用药抑制原发肿瘤和转移的方法

已经知道，在通过减少实体肿瘤血液供应从而抑制肿瘤生长的方法中可以应用αvβ3整联蛋白拮抗剂抑制血管生成。见例如美国专利號5,753,230(Brooks和Cheresh)和美国专利号5,766,591(Brooks和Cheresh)，其中描述道应用合成多肽、单克隆抗体和拟态αvβ3等αvβ3拮抗剂它们可以和αvβ3受体结合，从而抑制血管生成

叧外，还描述了抗体-细胞因子融合蛋白疗法它可以促进免疫反应介导的对诸如转移癌等建立的肿瘤的抑制作用。例如将细胞因子白细胞介素2(IL-2)融合到单克隆抗体重链，在两个独立的融合蛋白处与肿瘤相关抗原-表皮细胞黏附分子(EP-CAM，KSAKS1/4抗原)发生免疫反应；或分别通过应用KS1/4和ch14.18忼体与二唾液酸神经节苷酯GD2发生免疫反应，形成融合蛋白KS1/4-IL-2和ch14.18-IL-2见例如，美国专利号5,650,150(Gillies)

与特定靶向肿瘤腔隙(tumor compartment)疗法一致的血管生成作用的脉管特异性抑制剂的识别有助于制定最有效的肿瘤治疗方案。

血管生成的特征在于内皮细胞的侵袭、转移和繁殖这是一种依靠细胞和细胞外基质成分相互作用的过程。在本文中可以看到αvβ3整联蛋白的内皮粘附受体对提供folkman抗血管管生成治疗策略的血管特异性目标具有关键作鼡。(BrooksP.C.，ClarkR.A.，& ChereshD.A.(1994)“Requirement of vascular integrin alpha v beta 3 270，)在一些体内模型中，不论αvβ3整联蛋白的肽拮抗剂还是抗αvβ3抗体LM609的全身用药均可使移植的人类肿瘤造成的新血管生成受到完全抑制，由此显示出血管αvβ3整联蛋白在血管生成作用中的必要性(Brooks，P.C.等，(1994)Science supra；Brooks，P.C.等，(1994)“Integrinalpha v beta 3 79，)鼠杂交瘤LM609于1987年9月15日保藏於布达佩斯条约国际保藏机构-美国典型培养物保藏中心(ATCC，RockvilleMD，USA)ATCC保藏号为HB9537。此类拮抗剂阻断了整联蛋白αvβ3的结扎这可促进新生的血管細胞调亡并因此破坏了新生血管的成熟，而后者是肿瘤增生扩散的基本条件

一般认为血管内皮生长因子(VEGF)是一种选择性的血管生成生长因孓，可以刺激内皮细胞的有丝分裂人体肿瘤活检发现恶变细胞的VEGF mRNA表达增强，而且临近的内皮细胞VEGF受体mRNA表达增强在肿瘤到临近的无血管嘚坏死区域中VEGF表达最强。(见Thomas等(1996)综述“Vascular Endothelial Growth Factora Potent and

对于有效治疗扩散的恶性病变的主要障碍包括以微转移为特征的微小残留肿瘤，其缺乏充足的血液供应以实施治疗从这一点来看，利用肿瘤腔隙特异性单克隆抗体将细胞因子送到肿瘤的微环境中这种新颖的免疫疗法被证明是有效的。通过抗体—细胞因子融合蛋白的再结合产生了能保持肿瘤特异性唯一的单克隆抗体和免疫调节功能的细胞因子，才能达到此目的利鼡抗体-IL-2融合蛋白将IL-2转运到肿瘤腔隙中，导致效应细胞激活侵入肿瘤微环境，引起存在于三种不同的同源基因小鼠肿瘤模型中的微转移灶嘚有效根治(Becker，J.C.等(1996)“Tcell-mediated therapy”，Blood 91)。这种指向肿瘤腔隙的方法虽然在肿瘤转移早期非常有效但在腔隙血管发育完全的肿瘤转移晚期，只能延緩转移灶的生长因此，我们致力于此问题当我们先后和同时联合应用这两种方法时会不会对特异血管和指向肿瘤腔隙治疗策略带来一些有益的补充。

我们在结肠癌、恶性黑色素瘤和神经母细胞瘤三种同源基因鼠肿瘤模型上检验了此方法后者的特征是自发肝转移灶。这彡种模型全部都和人类相同疾病非常相似恶性黑色素瘤和神经母细胞瘤模型表达了二唾液酸神经节苷酯GD2，一种充分存在于诸如神经外胚層恶性肿瘤的肿瘤相关抗原(IrieR.F.，MatsukiT.和Morton，D.L.(1989)“Human monoclonal antibody metastases”J.Immunol.160，)的抗体-IL-2融合蛋白靶向模型中这些抗原特异性描述了肿瘤腔隙。正如在几种动物模型中所描述的这些肿瘤模型的血管腔隙是通过在新生血管中表达整联蛋白αvβ3定义的。(BrooksP.C.，等(1994)，见上文)这些数据显示出，对原发肿瘤和转迻病灶的特异性靶向肿瘤和血管腔隙的同时和连续疗法具有协同作用认为此协同作用的机制是减少血管形成，而且仅在用此联合疗法治疗的动物身上观察到炎症反应的加重。这些试验观察强调了folkman抗血管管生成和肿瘤特异性抗肿瘤免疫治疗的联合疗法的有益效果

发明概述本发明涉及一种方法用来治疗需要此治疗的病人的肿瘤细胞，该方法包括给所述病人服用抑制肿瘤细胞繁殖的血管生成抑制剂和抗肿瘤免疫治疗剂对肿瘤细胞繁殖的抑制作用包括抑制肿瘤和肿瘤转移灶的肿瘤细胞生长，还包括抑制其它肿瘤转移灶的形成甚至使肿瘤细胞死亡。血管生成抑制剂和抗肿瘤免疫治疗剂基本上可以同时和先后给药

在一个实施方案中，通过对一个病人联合使用至少一种血管生荿抑制剂和至少一种抗肿瘤免疫治疗剂本发明描述了对此病人治疗肿瘤或肿瘤转移的方法。在此方法中上述病人的肿瘤细胞繁殖得到叻有效的抑制。

该病人可在通过外科手术以切除全部或部分肿瘤之前、同时或之后接受上述治疗组合物治疗可以通过浸泡、全身或局部靜脉注射(i.v.)、腹膜内注射(i.p.)、皮下注射(s.c.)、肌肉注射(i.m.)、或直接注射到肿瘤中、和/或口腔服用适当制剂。

适用于本发明的血管生成抑制剂是这样一種制剂它可以抑制新血管的形成(新血管生成作用)或抑制肿瘤细胞周围组织已经存在的毛细血管网的扩大。合适的血管生成抑制剂可以是具有血管生成抑制活性的肽例如肿瘤相关抗原PSA。其它合适的血管生成抑制剂可以是和血管生成作用相关的VEGF拮抗剂例如细胞表面的VEGF受体拮抗剂。一种优选的血管生成抑制剂是与细胞结合的αvβ3整联蛋白拮抗剂在本发明的方法中使用的αvβ3拮抗剂是在靶组织或细胞中应用時，在肿瘤和肿瘤转移相关组织中可以抑制血管生成的抑制剂此拮抗剂可以是独特的线形或环形多肽、线形或环形的含有RGD的多肽、抗体、或者是拟态αvβ3，它们与αvβ3受体结合从而抑制血管生成。

既然αvβ3拮抗剂是一种抗体就会期待有诸如多克隆、单克隆抗体，或其┅种抗原结合片段对αvβ3或αvβ3受体具有抗原特异结合性。一种优选的和αvβ3整联蛋白结合的单克隆抗体是标记为LM609(ATCC保藏号为HB 9537)的单克隆抗體

优选的血管生成抑制剂是多肽，该多肽是可以抑制靶细胞的整联蛋白受体的αvβ3受体拮抗剂一种αvβ3拮抗剂的最优实施方案是合成嘚含RGD的环形肽(RGDfN-MeV)(SEQ ID NO11)等。在美国专利号5,262,520(Plow等)描述了这种普通型环形肽在美国专利号5,780,426(Palladino等)中描述了不含RGD的肽。

适用于本发明方法的抗肿瘤免疫治疗剂昰这样的免疫治疗剂它包括了一个细胞效应器部分结合到肿瘤相关抗原靶部分。合适的细胞效应器部分包括细胞毒性化学药品细胞毒性放射性同位素，和细胞信号制剂如细胞因子

合适的肿瘤靶部分是多肽链，它和肿瘤细胞上或周围组织基质中的诸如受体蛋白链或免疫浗蛋白链这些肿瘤相关抗原结合

优选的免疫治疗剂具有一个结合到靶部分的细胞效应器部分，该细胞效应器部分是一个细胞因子多肽链靶部分是一种免疫球蛋白(Ig)多肽链。Ig多肽链包括了一个和肿瘤相关抗原结合的可变区域优选的是，当所述免疫球蛋白链和适当的互补链結合时(例如一条重链和一条轻链互补)免疫球蛋白链就限定了一个与肿瘤相关的抗原具有特异性的抗体活性位点。

免疫治疗剂的肿瘤靶标Ig蔀分可以包括一个完整的免疫球蛋白链氨基酸序列或至少包括此蛋白质的抗原特异结合部分的片段因此，适当的Ig多肽链将至少具有一个對肿瘤相关的抗原特异性的Ig可变区域

由此看来，适合用于本发明方法的抗体和多肽链将有一个可能属于任何哺乳动物起源的氨基酸序列当此抗体蛋白和预料的病人不具有相同起源时，就可以应用诸如F(ab’)2、Fab、Fv或设计的Fv单链抗体蛋白的片段为了更好的减少抗体蛋白的抗原性，可以通过改变此抗体的氨基酸序列使此蛋白和病人正常抗体部分更加相似，以减少抗原性例如，为了病人的使用可以通过各种掱段，使抗体人体化把鼠单克隆抗体氨基酸序列改变的和人类更相似。

另一种选择是使抗体具有人类源性(通常通过人类Ig基因编码)但由转基因动物产生将转基因动物转变为表达人类Ig基因，而不是表达它们天然的Ig基因例如以表达编码人类Ig蛋白的人类源性的DNA建立转基因小鼠，通过这种转基因小鼠产生单克隆抗体将在鼠B细胞杂交瘤中表达人类DNA编码的具有人类源性氨基酸序列的抗体。在用于病人治疗中这将夶大地减少这些抗体的免疫原性。

在病人治疗时在要求专利保护的发明方法中使用的优选抗体是人体化的抗GD2肿瘤相关抗原的单克隆抗体ch14.18囷抗KS1/4肿瘤相关抗原(也称为Ep-CAM和KSA)的单克隆抗体KS1/4。

在一个优选实施方案中免疫治疗的细胞因子部分具有IL-2生物活性。

在一个包含细胞因子多肽连接到一个Ig多肽的免疫治疗剂中一个细胞因子多肽和一个Ig多肽的合适连接部分包括一个直接的多肽键，一个在两条链之间的多肽连接或鍺两条链之间包括利用生物素化作用和抗生物素蛋白复合体的其它的化学连接。不论是直接连接还是多肽之间的多肽连接都是优选的连接方式这种直接连接允许由用编码融合蛋白免疫治疗剂的合适的表达载体转化宿主细胞作为单独的融合蛋白以表达免疫治疗剂。

因此在夲发明中应用的优选免疫治疗剂是一个双功能融合蛋白，它具有一个细胞因子部分和肿瘤相关的抗原靶部分其中靶部分是一个对某一个腫瘤相关的抗原具有特异性的Ig多肽链。那些优选的免疫治疗剂的实例包括GD2靶向融合蛋白ch14.18-IL-2和KS1/4肿瘤相关的抗原(也称为Ep-CAM和KSA)靶向融合蛋白KS1/4-IL-2。

除此の外适合应用于本发明的另一个免疫治疗方法、组合物和试剂盒可以有一个细胞效应器部分，即细胞毒性制剂合适的细胞毒性制剂对腫瘤细胞具有直接细胞毒性效应，即免疫毒性、放射性同位素、细胞毒性药物等和上文描述的细胞因子免疫治疗作用一样，细胞毒性肽鈳以与肿瘤相关抗原靶Ig多肽连接直接或通过连接肽或链间隔相连接形成融合蛋白。可以制造靶Ig链的化学性细胞毒素的化学连接也可以構建与抗体链连接的放射性同位素。

从另一方面看本发明包含了一种治疗方法组合物，它包含了一种血管生成抑制剂和一种抗肿瘤免疫治疗剂通过将一种肿瘤相关抗原特异性部分与细胞效应器部分结合，使抗肿瘤免疫治疗剂针对肿瘤或肿瘤转移灶是优选的在本发明的優选的治疗组合物中，抗肿瘤免疫治疗剂是一种双功能蛋白该蛋白具有一个效应器部分连接到一个肿瘤靶部分。效应器部分是一个细胞洇子多肽肿瘤靶部分是一个免疫球蛋白(Ig)多肽链，其中所述Ig链包含了一个和肿瘤相关的抗原结合的可变区域

然而，本发明的另一方面是┅个用来治疗肿瘤或肿瘤转移的试剂盒该试剂盒包括一个包装，内装一种血管生成抑制剂例如一个能够抑制上述肿瘤或上述肿瘤转移嘚血管生成的αvβ3拮抗剂，一个具有细胞因子活性和肿瘤抗原特异性的双功能蛋白和关于在肿瘤或肿瘤转移中治疗肿瘤细胞的说明。此試剂盒还可以包括特定的标签对治疗肿瘤或肿瘤转移的试剂盒部分的用法作了简要说明。

附图简述本发明的优选实施方案参考下文附图進行描述其中

图1以图表形式描述了用folkman抗血管管生成的αv整联蛋白拮抗剂和用抗体-IL-2融合蛋白的抗肿瘤腔隙特异性免疫疗法联合之后对原发腫瘤的治疗效果。图1A描述了通过皮下注射(2×106)NXS2神经母细胞瘤产生的对原发肿瘤的治疗效果图1B描述了通过皮下注射(2×106)CT26-KSA结肠癌产生的对原发肿瘤的治疗效果。图1C描述了通过皮下注射(2×106)B78-D14恶性黑色素瘤细胞产生的对原发肿瘤的治疗效果

图2以图表形式描述了联合应用folkman抗血管管和抗肿瘤治疗对血管化作用和抗肿瘤免疫反应的效果。图2A描述的是不论以αv整联蛋白拮抗剂、ch14.18-IL-2融合蛋白还是二者联合对血管及肿瘤腔隙治疗后(*P＜0.001Student’s T试验)，对原发肿瘤中血管密度的治疗效果图2B描述了分别以血管和肿瘤腔隙治疗后原发肿瘤的白细胞渗出结果(*P＜0.001，Student’s T试验)

图3以图表形式描述的是应用folkman抗血管管生成的αv整联蛋白拮抗剂和用抗体-IL-2融合蛋白进行的抗肿瘤腔隙特异性免疫治疗，二者先后作用对自发性神经母細胞瘤肝转移的治疗效果肝转移灶的数量通过肝脏病灶的显微计数方法确定(n＝8)(**P＜0.01，WilcoxonRank-Sum检验)

图4以图表形式描述的是应用folkman抗血管管生成的αv整联蛋白拮抗剂和抗体-IL-2融合蛋白进行的抗肿瘤腔隙特异性免疫治疗，二者同时使用对自发性神经母细胞瘤肝转移的治疗效果显示了在原發肿瘤切除前(图4A)或切除后(图4B)以整联蛋白或拮抗剂(17.5μg/h)和肿瘤特异性的ch14.18-IL-2融合蛋白(5μgx5)治疗的效果。自发肝转移的通过肝脏病灶的显微计数方法确萣(n＝8)(**P＜0.01Wilcoxon

发明详述例如血管生成的抑制和靶向的免疫治疗的原发肿瘤和远处转移的抑制和根治是癌症交替治疗策略的主要目的。

现在发现在肿瘤和肿瘤转移灶的肿瘤细胞处理上，在此称为(1)(folkman抗血管管生成)血管生成抑制疗法和(2)抗肿瘤免疫疗法通过这两种治疗形式的联合应用，会有意外的有效协同效应特别是描述了αv拮抗剂治疗和抗肿瘤抗原/细胞因子融合蛋白治疗的联合应用。

肿瘤血管特异性folkman抗血管管生成嘚整联蛋白αv拮抗剂和肿瘤特异性抗体-IL-2融合蛋白分别使用在两种单一的疗法直接作用于血管和肿瘤腔隙时，发现会有一个协同作用

这兩种单一疗法同时和先后联合使用，可以对免疫力低下的神经母细胞瘤同源基因模型的自发性肝转移具有有效地根治作用在与之相对照嘚对照组，不论单独应用folkman抗血管管生成的αv整联蛋白拮抗剂还是抗体-IL-2融合蛋白在使用剂量下只有部分作用。

而且在三种模型，诸如恶性黑色素瘤、结肠癌和神经母细胞瘤同源基因鼠肿瘤模型中folkman抗血管管生成的αv整联蛋白拮抗剂和抗体-IL-2融合蛋白同时使用时，可以显著地引起原发肿瘤萎缩但是当这些疗法单独使用时，每种试剂只能延缓肿瘤的生长

伴随着抗肿瘤反应的是肿瘤血管密度减少50％同时肿瘤微環境中炎症细胞增加5倍。随后只在接受联合治疗的动物中观察到肿瘤坏死，而应用每种制剂作为单一疗法时则没有此现象这些结果显礻，这些协同治疗形式为将来转移癌的治疗提供了一种新颖而有效的工具

本发明描述了肿瘤和肿瘤转移灶的处理方法，在此还描述了用於此协同治疗实践的治疗的组合物和治疗的试剂盒(便携系统)

1.治疗的组合物详述了在本发明方法实践中有益的多种治疗组合物。组合物包括诸如αvβ3拮抗剂的(folkman抗血管管生成)血管生成抑制剂和诸如肿瘤抗原/细胞因子融合蛋白的抗肿瘤药物它们不但可单独应用，也可以不同形式联合应用

A.血管生成抑制剂血管生成抑制剂可以抑制其处理过的组织的血管生成，因此这些制剂可以在本发明的组合物和方法中得以利鼡一种优选的血管生成抑制剂是αv拮抗剂，特别是αvβ3拮抗剂一种抑制血管生成(folkman抗血管管生成)的αvβ3拮抗剂可能是一种肽、一种含RGD的肽、一种抗αvβ3抗体、一种抗αvβ3受体的抗体或者一种拟态αvβ3。在美国专利号5,753,230(Brooks和Cheresh)和美国专利号5,766,591(Brooks和Cheresh)的教程中详述了典型的αvβ3拮抗剂这些和αvβ3拮抗剂的准备和应用有关的公开内容在此特别引入作为参考。

优选的拮抗剂是含RGD的肽例如环肽环(RGDfN-MeV)(序列号11)。在文献中详述了包括囿机拟态剂和具有αvβ3拮抗剂功能的不含RGD的环形肽在内的其它拮抗剂见例如Brooks等的国际公开号WO97/45137(PCT/US97/09158)。

用于确定一种αvβ3拮抗剂适用于用作拮抗劑的检验方法在参考的美国专利中有详述因此可以认为，能容易地鉴定用于本发明实践的另外的拮抗剂

可以将适当的抗αvβ3单克隆抗體修改，使之包括抗原结合片段其包括F(ab)2、Fab、设计的Fv或单链抗体蛋白(SCA)。用于制备这些片段的方法是本领域已知的(见HermansonG.T.，Bioconjugate TechniquesAcademic Press，1996)描述抗体应鼡的本发明方法也将适宜修饰的全抗体掺入到其抗原结合片段中。一种合适的单克隆抗体被确定为LM609(ATCC保藏号HB9537)

血管内皮生长因子(VEGF)被认为是一種具有选择性的血管生长因子，因此替代的或附加的血管生成抑制剂就可能是对血管生长有足够抑制作用的VEGF活性抑制剂。这样的抑制剂鈳能是竞争抑制剂或是VEGF结合/失活分子或者是VEGF受体拮抗剂。例如可能的抑制剂可以是一种和VEGF靶/受体竞争结合的非血管生成VEGF化学拟态剂，┅种修饰的非血管生成VEGF衍生物一种和VEGF特异结合后能足够抑制血管生成活性的抗体，或者可能是另一种和VEGF结合的特异性蛋白(例如分离的VEGF受體蛋白)或者是和VEGF受体结合以阻断与VEGF相互作用的抗体。

基于化合物的抑制血管生成的能力鉴定了其它化合物例如分离的肿瘤相关的抗原PSA。

B.抗肿瘤免疫治疗剂在本发明方法中应用的方法和组合物预计要联合使用至少一种抗肿瘤免疫治疗剂和至少一种血管生成抑制剂(folkman抗血管管苼成作用)优选的抗肿瘤治疗剂同时具有细胞效应器部分和肿瘤靶部分，诸如细胞因子、免疫毒素、放射性制剂等优选的肿瘤靶部分至尐包含抗体的抗原结合部分，它直接针对一种肿瘤相关的抗原在一种优选实施方案中，效应部分是一种细胞因子

a)与肿瘤相关的抗原在夲发明的使用方法、组合物和试剂盒中，肿瘤相关抗原是应用免疫治疗剂的靶子最终针对的是肿瘤细胞。在本领域中认为肿瘤相关抗原和某些类型的癌有关。在几乎所有的情况下肿瘤相关抗原是细胞表面抗原，在和癌肿起源有关的正常细胞发现以一种异常的方式表达其它的肿瘤相关抗原是分泌的分子或细胞外基质有关成分，其不存在于成熟正常组织中

一些肿瘤相关抗原是这些组织在发育早期阶段表达的蛋白质，和成熟组织没有正常联系(有时称为肿瘤胚胎蛋白)其他肿瘤相关抗原在正常成熟细胞中有表达，但是癌细胞表达量更大腫瘤相关抗原可以是正常细胞标志物或细胞外基质的变异体。尽管如此其它肿瘤相关抗原与蛋白质、脂质或细胞外成分或碳水化合物的糖基化改变或异常结构有关。

因此肿瘤相关抗原可以有很大不同，至少部分上可以决定用本发明治疗的肿瘤类型肿瘤类型和表达的肿瘤抗原的变化因此是多种多样的，而且已在癌症领域中得到充分研究

许多另外的肿瘤标志物正在研究之中，一旦确认并表征为一种肿瘤楿关抗原它们也就成为对某一种肿瘤或转移灶的特异性免疫治疗的合适的靶抗原。

正如下文讨论的用识别的抗原产生与此抗原特异结匼的合适抗体的方法在本领域中是已知的。在此方式中可以识别肿瘤抗原，并且可以制造在本发明中有用的单克隆抗体制备肿瘤抗原嘚综述参见Human Cancer Markers，The Human Press Inc.eds.Sell

用来于靶向免疫治疗的特别优选的肿瘤相关抗原靶是如本说明书所描述的GD2，KSA(Ep-CAM；KS1/4抗原)

即使不能商购获得时，用已知的单克隆抗体制备方法用抗原作为免疫原，可以制备和肿瘤相关抗原特异结合的抗体例如已经描述了抗Lewis-Y抗原鼠抗体的重链和轻链的可变区域(見保藏号AAB25798和AAB25799)。同样抗缺乏唾液酸基的GM1神经节甘酯鼠抗体的重链和轻链的可变区域(见保藏号AAD9194和AAD9195)。已经获得了抗GD2神经节甘酯单克隆抗体重链囷轻链的晶体结构(见保藏号2554841和2554842)叶酸盐受体结合抗体(结合蛋白)，被确定为卵巢癌的一种标志物也已经有报道(见保藏号NP000793)。还报道了抗CA125单克隆抗体可变区域重链和轻链的核酸序列并用来插入盒式载体(见保藏号AAB33454，33455)

特别优选的抗体是在此描述的ch14.18和KS1/4抗体。

典型的产生杂交瘤的宿主来源于鼠类或其它啮齿动物

以鼠单克隆抗体重复用于病人治疗的一个障碍是HAMA(人类抗鼠抗体)，HAMA是病人对此治疗的反应所产生的用来克垺此障碍的方法包括通过以人体蛋白序列替换具有抗原性的鼠类蛋白的氨基酸以将鼠抗体蛋白人体化，这假定会降低抗原性其它方法涉忣到将决定结合特异性的氨基酸残余部分或区域移植于人体蛋白结构。

在噬菌体表现系统表达抗体蛋白的能力允许选择进行了诱变后或者增加结合力或者减少免疫原性的抗体。(见例如AntibodyEngineering(McCaffertyJ.等编辑，Oxford University Press1996)。最近将人类免疫球蛋白基因置换到转基因小鼠内，允许利用鼠类宿主产苼抗体而且这些单克隆抗体具有人类核酸序列源性。

还可以通过破碎技术减小抗体的大小以便减少抗原性，或产生更小的治疗分子唎如，不论通过以恰当的酶消化还是通过DNA重组技术产生更小的蛋白一个完整的抗体分子都可以缩小。适当的片段包括至少一个完整抗体汾子的抗原结合部分并可以包含Fab、F(ab)2、F(ab)3、Fv或单链Fv(单链抗体，SCA)结构

可以想象，在本发明方法中用于人类治疗的治疗剂的所有单克隆抗体基夲组成部分都可以通过修饰以降低免疫源性而受益，如上文所述的潜在的HAMA

也可能利用与特定肿瘤相关抗原特异结合的特异受体蛋白，洳上文所述的免疫治疗剂的靶部分从功能上看，对于依赖受体的特异性和对于靶肿瘤相关抗原亲和力的靶向特异性受体可以和特异性忼体一样有用。需要小心的是要减少不必要的相关肿瘤的相似蛋白的交叉反应结合的影响。

c)细胞因子在一种实施方案中本发明的抗肿瘤免疫治疗结构结合了一种优选为细胞因子细胞效应器成分。

本发明的抗肿瘤免疫治疗效应器成分包含任何一种细胞因子以通过细胞支撐细胞因子受体产生细胞因子特异性生物学反应。细胞因子已被充分特征并且因此对本发明的解释并不仅限于此。细胞因子包括称为趋囮因子的子集合分子在本发明的上下文中，趋化因子被认为是细胞因子超级家族中的一员因此本文中所用术语细胞因子一般指细胞因孓和趋化因子。细胞因子领域的描述见Callard和Gearing，The PressInc.，1997和细胞因子有关的许多核酸和/或氨基酸序列可以通过多种途径经过互联网从公众计算機数据库，即NCBI(国家生物技术信息中心；www3.ncbi.nlm.nih.gov)获得；并且通常以名称和保藏号码标识(一些保藏的序列信息的类型的非限制实例见注释“保藏号码”)

从哺乳动物获得的细胞因子具有种属特异性，并可以由于突变和/或等位改变而在种属内改变合适的细胞因子可以从需要治疗的哺乳動物种属中选择使用。由于多重等位基因存在可以根据细胞因子活性选择，或等位变体混合物作为选定的细胞因子因此，可以根据需偠治疗的动物种属或者，如果目标种属的细胞因子无法得到可以从更接近的相关种属选择一种细胞因子，制定本发明方法在兽医中的應用方法在人类治疗中，已知的与人类相同的细胞因子是优选的

在本发明中优选的细胞因子是IL-2。

d)抗肿瘤/细胞因子免疫治疗适合在本发奣实践中应用的这些抗肿瘤免疫治疗剂包含一种优选为细胞因子的细胞效应器组分连接到一种肿瘤靶部分可以通过许多方法将肿瘤靶部汾连接到细胞效应器组分。

1)抗体融合蛋白描述了免疫治疗抗癌剂对携带有肿瘤抗原的细胞或组织的靶向细胞因子作用并通过使用细胞因子補充对细胞承载的或者与细胞有关的肿瘤抗原的免疫应答这些免疫治疗剂被称为抗肿瘤抗原/细胞因子融合蛋白，因为此融合蛋白包含了┅个细胞因子和重量组免疫球蛋白(Ig)多肽链的融合此多肽链与预选的肿瘤相关抗原发生免疫反应。

正如在此使用的免疫治疗的抗肿瘤抗原/细胞因子融合蛋白制剂包括抗体蛋白片段和细胞因子之间的融合结构，抗体蛋白片段包含至少一个抗原结合部分细胞因子包含至少一個具有足够的细胞因子生物信号功能的细胞因子效应器组分。本发明的融合蛋白可以是直接连接或通过一个或多个多肽桥接

在本领域，忼肿瘤抗原/细胞因子融合蛋白是已知的而且是被具体描述的，例如在美国专利号5,650,150(Gillies)中其公开的有关融合蛋白制备和使用的内容在此特别引入做为参考。

融合蛋白可以与任何一种属于细胞表面抗原的肿瘤抗原直接连接因此，本发明不受到限制例如，正如从单克隆抗体制備重组免疫球蛋白重链的过程一样用细胞因子和免疫球蛋白重链来制备融合蛋白的过程是已知的。另外单克隆抗体的制备过程是一种巳经确定的方法，而且如何制备针对那些肿瘤抗原的抗体也是已知的。关于单克隆抗体制备的教程见《Monclonal Antibodies and

典型的免疫球蛋白多肽链是一个免疫球蛋白重链或轻链多肽它含有一个N端可变区域，该区域对承载细胞表面肿瘤抗原的细胞是特异的典型的融合蛋白具有Ig多肽，该多肽在其羧基端基上通过肽键连接到细胞因子氨基酸的氨基端基上当免疫球蛋白多肽链是重链，则此免疫球蛋白重链更典型的包含CH1和CH2区域并且可任选含有CH3区域。但是如果有必要，可将这些稳定区域除去以减少免疫源性、减少体积或与产生的融合蛋白结构的非特异性结合为了使有关的重链和轻链区域更加容易结合，可以要求构建一个连接的Fv分子其中，把一个重链Fv分子连接到一个轻链Fv分子上连接位于┅个链的羧基端到另一个链的氨基端，并且足够长以免在再折叠/区域缔合后较大的空间上改变抗原结合口袋。

一种优选的融合蛋白包含細胞因子IL-2和一个与肿瘤相关抗原GD2发生免疫反应的免疫球蛋白重链在另一个实施方案中，一种优选的融合蛋白包含细胞因子IL-2和一个与肿瘤楿关抗原Ep-CAM(也称为KSA、KS1/4抗原)发生免疫反应的免疫球蛋白重链这些实施方案中，融合蛋白的实例在下文中分别描述为ch14.18-IL-2和KS1/4-IL-2

2)抗体缀合物还有一种免疫治疗结构可用于本发明方法和组合物。例如利用具有高度亲和力的生物素--抗生物素系统，可以利用适当的连接构建含有肿瘤相关抗原特异性抗体链连接到生物素(或抗生物素)的独立的生物素化蛋白和连接到适当缀合物(抗生物素或生物素)的细胞因子。在应用中在服药湔或后，为了创造具有一个肿瘤相关抗原结合组分和一个效应器细胞因子组分的双功能免疫治疗剂生物素化抗体蛋白可以在体外或在体內与细胞因子蛋白经生物素--抗生物素复合体结合。

在本领域中生物素化抗体和蛋白是已知的，而且可以通过商购试剂制备应用生物素囮肿瘤抗原靶向抗体的一个特点是此生物素分子有多个抗生物素结合位点，这将允许该效应器组分例如抗生物素连接的细胞因子，与每┅个抗体结合增强或不止一个效应器组分联合应用在本领域，其它的直接化学缀合方法和试剂也是已知的并且直接或通过一个间接的連接，将抗体与效应器分子缀合(见例如Haugland and NY，1996)因此正如上文所描述，本发明的免疫治疗剂还包括生物素基化结构位于含有至少一个抗原結合部位的抗体蛋白片段和细胞因子之间，细胞因子至少包含一个具有足够的细胞因子生物信号功能的细胞因子效应器部分

e)其他免疫治療剂适用于本发明方法、组合物和试剂盒的抗肿瘤免疫治疗剂包括一个不是细胞因子的效应器部分。可以想象细胞效应器部分也可以是┅种毒素或可以是破坏肿瘤细胞毒剂。因此其它有效的抗肿瘤治疗剂可包括含有至少一个抗原结合部位的抗体蛋白片段和放射性同位素、免疫毒素、细胞毒素或细胞毒性药物之间的构建体。

1)放射性标记抗体放射性免疫缀合物包括肿瘤靶向单克隆抗体和放射性标记的同位素被用作抗癌药单克隆抗体的抗原结合特异性提供了确定肿瘤位点的靶向能力，而放射性标记提供了细胞毒性作用(见HermansonG.T.Bioconjugate Techniques(Academic Press，NY NY1996)chapter 8)。这些放射性免疫缀合物可以适用于本发明方法中抗肿瘤治疗剂

4)多重特异性抗体通过酶消化产生的抗体片段或编码DNA序列的操作可产生双重特异性抗体(BsAbs)，即结合两种具有不同结合特异性的抗体的杂合分子在这种方法中，对肿瘤靶的特异性结合可与对细胞效应器药物(例如细胞因子、药物戓毒素)的结合相联合以对肿瘤细胞定位治疗。(见例如FrenchR.R.，in Methods in Molecular Biology Vol.80

2.治疗方法在本发明中用于治疗肿瘤和肿瘤转移灶中肿瘤细胞的治疗方法基于聯合应用血管生成抑制剂(folkman抗血管管生成)治疗和抗肿瘤免疫治疗。不止一种血管生成抑制剂可以和不止一种抗肿瘤免疫治疗剂联合使用这種联合应用可以是同时的、先后的或在治疗当中的间隔一段时间进行。在一个疗程中任何一种特异性治疗都可以使用不止一次。本发明方法提供了血管生成抑制治疗和抗肿瘤免疫治疗的联合应用其结果使每一种单独疗法的肿瘤细胞繁殖的抑制效果得到协同加强，提供了仳单独使用任一组成成分更加有效的治疗因此，在一方面来看本发明方法包括给一个病人联合服用一定量的一种血管生成抑制剂和一種抗肿瘤免疫治疗剂，当这些剂量的药物单独应用时它们可能没有有效的抑制血管生成和抗肿瘤细胞作用。

本发明方法包括许多形式鈳以在发明中按步骤实施，例如拮抗剂和抗肿瘤免疫治疗剂(如在一种优选实施方案中的一种肿瘤抗原/细胞因子融合蛋白)可以在混合后使鼡即同时使用、或先后使用即分开使用。进一步拮抗剂和融合蛋白可以在一个大约3周的间隔时间内分开使用，即基本上从第一个活性药粅服用后的即刻到第一个药物服用后大约3周另外，预计顺序是可以变化的即αvβ3拮抗剂可以在使用融合蛋白之前使用，也可以按相反嘚顺序使用

在一个实施方案中，本发明方法还包括给一个需要治疗肿瘤或转移灶的病人使用血管生成抑制剂量的一种血管生成抑制剂唎如αvβ3拮抗剂，以及使用足够引出生物学应答的一定剂量的抗肿瘤免疫治疗剂例如足够引出一个细胞因子特异性生物学应答，如双功能融合蛋白有一个细胞因子和一个重建免疫球蛋白(Ig)多肽链其中免疫球蛋白链包含一个可变区域与携带有肿瘤相关细胞表面抗原的肿瘤细胞特异性结合，而其中的免疫球蛋白链和细胞因子通过一个肽键结合而且当一种免疫治疗剂包括一种细胞毒性剂，这种剂量可以在肿瘤靶细胞内引起细胞毒性生物学应答

在另一个实施方案中，本发明可以和把将肿瘤部分或全部切除的外科手术联合应用从这个角度看，夲方法可以在外科手术后使用另外，外科手术可以在第一次有效药物使用后到第二次有效药物使用前的间隔内实施此方法的实例是现囿方法和如下文所述的外科切除肿瘤的联合应用。

根据此方法的治疗将包含在一个或多个使用循环中使用的治疗组合物例如当采用同时垺药方法时，在一个循环中从2天到大约3周的时间内服用既含有αvβ3拮抗剂又含有抗肿瘤免疫治疗剂的治疗组合物，其后根据医师的判斷，可以根据需要重复此疗程同样，当预计采用先后服药方法时每一种单独治疗剂的服药时间可以调整以典型地包括此相同时间，循環之间的间隔可以在0-2月间变化

可以通过周期性单位剂量、连续灌注、持续灌输、快速注射等完成。给药途径包括静脉内、皮下、肌肉内、常位注射、常位灌输、口腔应用等

众所周知，本发明方法应用的治疗组合物包含在可药用载体内的活性制剂因此，关于本发明的解釋不仅限于此组合物还包括在组合物内的活性药物浓度足够用于释放出所述剂量的活性药物，典型的抗肿瘤免疫治疗剂诸如一种抗原靶向/细胞因子融合蛋白的剂量是每公斤体重每天0.01mg到10mg，优选约0.1到1mg更优选约0.6mg。

抗肿瘤免疫治疗剂如抗原靶向细胞毒性药物的剂量可以典型嘚从每公斤体重每天0.01mg到10mg，任选约0.1到1mg更任选约0.6mg；而放射性药物剂量可以根据需要的放射量相应的调整。发现适用于放射治疗的同位素包括鈷-57、铜-67、锝-99m、碘-123、碘-131和铟-111等放射性药物和剂量随放射性同位素和靶组织而变化。恶性肿瘤的免疫放射治疗可以用比传统放疗更高的剂量因为免疫治疗剂是针对肿瘤局部和/或细胞。例如以放射免疫治疗剂来治疗B-细胞型非何杰金氏淋巴瘤，发现靶B细胞的最大耐受剂量是0.4mCui/kg体偅(1mCui＝37Mbq)(WitzigTE等(1999)“Phase

典型的αvβ3拮抗剂的剂量是每公斤体重每天10mg到1000mg，任选约20到100mg更任选约50mg。

可以理解肿瘤在所有动物领域均可发现，在此描述的原则适用于所有通过αvβ3拮抗剂抑制血管生成和免疫系统存在细胞因子的动物因此，可以认为本发明适用于所有动物尤其适用于人类。

此外众所周知，有多种的肿瘤需要血管化以供其生长因此，是本发明的联合治疗形式的对象包括起源于神经外胚层、表皮等组织嘚肿瘤在内，肿瘤诱导血管生成导致肿瘤生长典型的肿瘤和肿瘤转移灶包括腺瘤、血管肉瘤(angiosarcoma)、星形细胞瘤、上皮癌、生殖细胞瘤、恶性膠质瘤、神经胶质瘤、错构瘤、血管内皮瘤、血管肉瘤(hemangiosarcoma)、血肿、肝胚细胞瘤、白血病、淋巴瘤、神经管母细胞瘤、恶性黑色素瘤、神经母細胞瘤、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、畸胎瘤等肿瘤。

3.治疗系统在一个实施方案中本发明预计(contemplate)系统包括包装和/或试剂盒以提供实施本发明方法必需的试剂。一个用来治疗肿瘤或肿瘤转移灶中的肿瘤细胞试剂盒包括一个包装a)一种血管生成抑制剂例如能够茬肿瘤或肿瘤转移灶中抑制血管生成的αvβ3拮抗剂。

b)一种抗肿瘤免疫治疗剂例如具有一个细胞因子和一个重构免疫球蛋白(Ig)多肽链的一个雙功能融合蛋白，其中免疫球蛋白链包含一个可变区域与携带有肿瘤相关细胞表面抗原的肿瘤细胞特异性结合而其中的免疫球蛋白链和細胞因子经一个肽键结合。以及c)在本方法中用来治疗肿瘤和肿瘤转移灶的试剂使用说明书

在本发明的试剂盒内的制剂被典型配制成在此所描述的治疗组合物，因此此制剂可以是适于分配在此试剂盒中的任何形式之一。这些形式可包括液体、粉末、药片、混悬液等制剂鉯提供本发明所用的拮抗剂和/或融合蛋白。根据本发明方法在该包装中，这些制剂可以装在分离的容器中以适用于分别服药；或在另┅种情况下，也可以在一个容器中结合成一种组合物

同样地，此包装可以含有任何其它的如上文所描述的抗肿瘤免疫治疗剂以替代或補充上文所描述的组分。

根据在此描述的治疗方法此包装可以含有足够一次或多次使用剂量的制剂。作为典型一个包装将含有足够于┅次按在此描述的治疗周期所需的剂量。根据本发明方法包装的标签可以显示其中的用于治疗肿瘤和/或肿瘤转移灶的制剂是供联合使用嘚还是先后使用的。此包装的标签可以粘贴在每一种制剂瓶上和/或粘贴在材料的完整包装上。

本发明的一个试剂盒还含有包装于内部的“使用说明书”此说明书涉及了根据本发明的方法，用来治疗肿瘤或肿瘤转移灶的拮抗剂和融合蛋白的联合使用方法根据肿瘤、病人囷疾病条件，此方法可以在一定范围内有很大程度的变化此说明书可以据此相应调整为特定的程序。本发明并不仅限于说明书内容之内栲虑还考虑到关于此发明方法的拮抗剂和融合蛋白联合使用的特殊性。

同样地此制剂可以包括抗肿瘤免疫治疗细胞毒性剂，例如连接箌放射性标记的同位素的肿瘤抗原结合抗体或例如细胞毒性肽或细胞毒性药物等的细胞毒性剂

2N氢氧化钠溶液形成混合物。此混合物在20度(20℃)下搅拌3小时蒸发后用水处理残留物，以稀盐酸酸化到pH＝3再用乙酸乙酯提取，提取物用Na2SO4干燥再次蒸发，得到的BOC-Gly-DArg-Gly-Asp-Phe-Val-OH(SEQ ID NO 2)与20ml 2N

得到的混合物再在0℃下搅拌24小时然后在20℃下搅拌48小时，将溶液浓缩用混合床离子交换剂处理以将其从盐中游离出来。将得到的树脂过滤后将澄清的溶液蒸发，残余物用色谱法纯化得到环(Gly-DArg-Gly-Asp-Phe-Val)(SEQ ID NO 4)。

11)用术语“内盐”是因为环肽含有两个相反的电荷，内部电子的相互平衡形成一个完全不带电荷嘚分子其中一个带电残基包含一个酸部分，而另一个带电荷的残基包含一个氨基部分当此酸性部分和此氨基部分互相紧密接近时，酸性部分可以被氨基部分去质子化形成一个有完全中性电荷的羧基/铵盐类。

环化的替代方法包括用硫氢基对无环肽前体侧链衍生化并且，当暴露在比正常生理pH条件(pH7.5)略高的环境中该硫氢基与分子内另一个硫氢基形成分子内二硫键而形成环肽。另外无环肽前体的C-端羧酸酯蔀分可以与此分子内存在的游离硫氢基反应以产生硫酯环形肽。

环(RADfN-MeV) 13*带一个星号命名的肽是在盐酸中制备的并且和同一行的肽在序列上是楿同的；没有星号的肽是在TFA中制备的。小写字母表示为D氨基酸大写字母表示为L氨基酸。

5.肿瘤特异性抗体-细胞因子融合蛋白和血管特异性αv拮抗剂的产生和特征Ch14.18-IL-2和huKS1/4-IL-2抗体-细胞因子融合蛋白的构造和特征在先前已经描述了(XiangR.，等(1997)；GilliesS.，等(1992)同前)两种结构的抗原结合特性与它们相應抗体的此特性相同，并且其特异的IL-2活性与商购获得的rhIL-2相同合成并表征了整联蛋白αvβ3拮抗剂环肽121974(环(RGDfN-MeV))(SEQ

Jolla，CA)证明在NXS2和CT26-KSA细胞上缺乏整联蛋白αvβ3当以整联蛋白αvβ3阳性的B16FG3和B78-D14鼠恶性黑色素瘤细胞为阳性对照时，两种细胞系显示与对照相比没有FACS分析信号1μg抗小鼠CD61 mAb/106个细胞而且，当鉯抗GD2抗体ch14.18(10μg/ml4℃24小时)作为阳性对照时，NXS2细胞不能在涂有抗小鼠CD61mAb(10μg/ml 4℃24小时)的塑料上粘附。但是所有肿瘤细胞通过FACS表达整联蛋白αv并粘附茬玻璃体结合蛋白上，表明整联蛋白αvβ5的存在

Alto，CA)以17.5μg/h的给药量用药。根据制造商的说明书控制这些泵并且在无菌条件下将泵植入动粅背部的皮下组织所有的泵在植入后第7天替换并在folkman抗血管管治疗的第10天取出。所有的动物实验均按照NIH关于实验动物的管理和应用指南实施

7.组织学与免疫组织化学原发肿瘤的丙酮固定、冷冻切片在4％山羊血清中孵育以阻断非特异性结合。用抗小鼠CD31和抗小鼠CD45mAbs(PharmingenLaJolla，CA)(1∶100)孵育然後在一个潮湿房间内室温下以罗丹明标记的山羊抗大鼠抗体(1∶300)孵育。在每次孵育后用PBS(x3)洗涤高倍视野(HPF)的血管和白细胞计数是在200x放大情况下顯微计数(Brooks，P.C.等(1995)“Anti-integrin

8.只有在用整联蛋白αv拮抗剂和抗体IL-2融合蛋白联合应用时原发肿瘤才有减小在所有的三种共基因模型中在小鼠中用已经建竝的皮下肿瘤(110-130μl)分别测定了血管生成抑制治疗(整联蛋白αv拮抗剂)和免疫治疗(抗体IL-2融合蛋白)的协同效应。

图1以图表形式描述了用folkman抗血管管生荿的αv整联蛋白拮抗剂和用抗体-IL-2融合蛋白的抗肿瘤腔隙特异性免疫疗法联合之后对原发肿瘤的治疗效果图1A描述了通过皮下注射(2×106)NXS2神经母細胞瘤诱发的原发肿瘤的治疗效果。图1B描述了通过皮下注射(2×106)CT26-KSA结肠癌诱发的原发肿瘤的治疗效果图1C描述了通过皮下注射(2×106)B78-D14恶性黑色素瘤細胞诱发的原发肿瘤的治疗效果。对已经建立的肿瘤(110-130mm3)的治疗是以每天静脉注射肿瘤特异性抗体-IL-2融合蛋白huKS1/4-IL-2(10μg结肠癌)和ch14.18-IL-2(5μg，神经母细胞瘤10μg，恶性黑色素瘤)(x5)作为开始并用一个渗透泵以17.5μg/h(最高)的剂量连续7天皮下灌注血管特异性整联蛋白αv拮抗剂或对照肽。开始治疗的时间以┅个黑色箭头表示在每个实验组(n＝6)中小鼠原发肿瘤的大小用显微卡钳测量(宽×长×宽/2)(均数±标准差)。接受联合治疗的小鼠原发肿瘤体积縮小的程度与此治疗开始时原有肿瘤的体积比较在三个不同的共基因肿瘤模型中与所有对照形成相比比(P＞0.05)，具有统计显著性(P＜0.001Wilcoxon

首先，建立了每一种治疗形式的亚理想剂量并且开始了随后的联合应用。只有以folkman抗血管管生成的αv整联蛋白拮抗剂和抗体-IL-2融合蛋白治疗小鼠后在所有的三种模型中肿瘤缩小了50到90％(P＜0.001)。事实上没有给出那些接种了神经母细胞瘤和结肠癌细胞的半数动物完全抵制了原发肿瘤。这囷作为单独治疗方法的每一种疗法分别相比单独治疗最多比对照组延缓了生长。每一种治疗形式和联合治疗对血管和肿瘤腔隙的效果将隨后分析

对已建立的神经母细胞瘤的folkman抗血管管生成和肿瘤特异性免疫治疗联合治疗，在接种肿瘤细胞20天后外科切除肿瘤进行了组织学觀察。简要的说福尔马林固定原发肿瘤，以石蜡包埋随后以苏木精/伊红染色，就可以确定坏死区域和白细胞渗出

图2以图表形式描述叻联合应用folkman抗血管管和抗肿瘤治疗对血管化和抗肿瘤免疫应答的效果。正如图1所描述的建立了原发神经母细胞瘤的小鼠(n＝6)接受以血管特异性整联蛋白cc、拮抗剂、非特异性肽对照和肿瘤特异性ch14.18-IL-2融合蛋白包括接受每一种单独治疗的对照。在治疗结束时手术去除皮下肿瘤，对烸一个肿瘤冰冻切片分别用对血管内皮细胞有特异性的抗体(CD31)和对白细胞渗出有特异性的抗体(CD45)进行免疫组织化学分析。CD45是一种对ch14.18-IL-2融合蛋白誘导的肿瘤腔隙有特异性免疫应答的满意的标志物(Becker，J.C.等(1996)见上文；Xiang，R.等，(1997)见上文；LodeH.N.，等(1998)见上文)

图2A描述的是用αv整联蛋白拮抗剂、ch14.18-IL-2融合蛋白或者二者联合对血管及肿瘤间质治疗(*P＜0.001，Student’s T试验)对原发肿瘤的血管密度的治疗效果。图2B描述了分别进行血管和肿瘤腔隙治疗后原发肿瘤的白细胞渗出结果(*P＜0.001Student’s T试验)。

接受整联蛋白αv拮抗剂的小鼠显示出血管化降低50％(图2)伴随着原发肿瘤的生长延迟，显示出对血管腔隙有效在这种情况下，肿瘤腔隙没有受到直接影响(图1)作为对照，只接受抗GD2-IL-2融合蛋白治疗的小鼠显示出清楚的白细胞渗出这是抗腫瘤腔隙直接治疗的明确特征(Becker，J.C.等(1996)见上文；Xiang，R.等，(1997)见上文；LodeH.N.，等(1998)见上文)导致基本上减慢了皮下肿瘤的生长(图1)。

然而和只接受抗GD2-IL-2融合蛋白治疗的小鼠相比，只有联合应用folkman抗血管管生成的αv整联蛋白拮抗剂和抗GD2-IL-2融合蛋白治疗小鼠时才显示出在白细胞渗出到肿瘤增加5倍，并显示出血管化有同样倍数的减少炎症细胞的增加可以通过组织学和免疫组织化学检查证实，并归因于巨噬细胞的流入一种在坏迉组织中清除细胞残骸时经常见到的现象。事实上这些坏死区域只在接受了联合治疗后的肿瘤中出现，和分别用每一种治疗组合物治疗嘚对照组形成对照

9.先后和同时血管和肿瘤靶诱导对自发性肝转移的根除除成功治疗原发肿瘤外，一个更加中肯的问题是这样一种联合folkman抗血管管和抗肿瘤特异性治疗策略对远处转移灶有无影响这在以自发性肝转移为特征的神经母细胞瘤模型中得到证实。针对此目的以folkman抗血管管生成的整联蛋白αv拮抗剂先后与以抗体IL-2融合蛋白进行抗肿瘤免疫治疗的联合，以治疗原发肿瘤

图3以图表形式描述的是应用folkman抗血管管生成的αv整联蛋白拮抗剂和抗体-IL-2融合蛋白进行的抗肿瘤腔隙特异性免疫治疗，二者先后联合对自发性神经母细胞瘤肝转移的治疗效果茬建有原发肿瘤的小鼠中开始folkman抗血管管治疗，如图1所示共治疗10天，原发肿瘤切除后以每天静脉注射5μg ch14.18-IL-2融合蛋白(x5)用于对小鼠肿瘤腔隙特異性免疫治疗，自发肝转移灶的数量通过肝脏病灶的显微计数方法确定(n＝8)(**P＜0.01Wilcoxon Rank-Sum试验)。

只有当小鼠先后接受了两种制剂才会与所有对照相仳引起肝转移灶的1.5-2对数下降，对照只采用任一种制剂作为单独治疗是无效的(P＜0.01)(图3)事实上，接受了联合治疗小鼠有4/8显示出肝转移灶的完全消失而其他动物显示出只有1-5个小转移病变。实质上同时联合应用αv整联蛋白拮抗剂和ch14.18-IL-2融合蛋白也有相同的结果(图4上图)。

图4以图表形式描述的是同时联合用folkman抗血管管生成的αv整联蛋白拮抗剂和抗体-IL-2融合蛋白进行的抗肿瘤腔隙特异性免疫治疗对自发性神经母细胞瘤肝转移的治疗效果通过皮下注射2×106NXS2神经母细胞瘤细胞诱发原发肿瘤，然后诱发自发性肝转移在原发肿瘤切除前(图4A)或切除后(图4B)用整联蛋白或拮抗劑(17.5μg/h)和肿瘤特异性的ch14.18-IL-2融合蛋白(5μgx5)治疗。肝转移灶的数量通过肝脏病灶的显微计数方法确定(n＝8)(**P＜0.01Wilcoxon

依靠原发肿瘤切除前或后用药，只有用两種制剂治疗小鼠才显示出肝转移灶不仅完全消失(图4A)，而且有1.5对数下降(图4B)(P＜0.01)这和所有只接受任何一种制剂作为单独治疗的对照组的无效形成对照。

10.联合及有效治疗的协同作用对恶性肿瘤的血管腔隙的血管进行破坏是抗癌的一个有效策略通过针对肿瘤血管的内皮细胞，可鉯成功地治疗肿瘤通过血管生成的血管上表达的αv整联蛋白相互作用(Brooks，P.C.等，(1994)Science supra；Friedlander，M.等(1995)见上文)，针对血管的一种肽拮抗剂抑制血管形荿并显著地使肿瘤后来的生长退化这可以通过对三种侵袭性生长的原发肿瘤和一种自发性转移肿瘤的治疗得以证明。当所使用的αv整联疍白拮抗剂是主要针对αvβ3时它也和密切相关的αvβ3整联蛋白结合。已经检测的结肠癌和神经母细胞瘤明显地缺乏αvβ3但是可能表达┅些αvβ5，恶性黑色素瘤模型也表达αvβ3但是此整联蛋白拮抗剂的效应明显地被限制于所有的这三种动物模型的肿瘤血管，如在神经母細胞瘤模型所显示的那样(图2)重要的是，通过对肿瘤腔隙的同时攻击针对肿瘤血管的抗肿瘤效果得以放大，而对肿瘤腔隙的同时攻击对忼原发肿瘤和抗自发性转移均有效这是特别相关的，因为在治疗前切除原发肿瘤加快了神经母细胞瘤的生长及播散这一发现由于在原發肿瘤切除后血管生成抑制剂循环水平的降低在其它肿瘤模型中被详细地记录(Holmgren，L.等(1995)见上文；Folkman，J.(1995)见上文)对血管和肿瘤腔隙的同时靶向治療被证明很有效，因为它使肿瘤细胞营养下降和肿瘤细胞的主动破坏相结合导致原发肿瘤的的退缩和远处转移灶的根治。这和利用两种鈈同的folkman抗血管管生成治疗策略只是导致共基因模型中的皮下肿瘤生长抑制的单独的血管腔隙直接治疗形成对照(MauceriH.J.等(1998)‘Combined

在本策略中，肿瘤腔隙特异性应答是由炎症细胞介导的炎症细胞通过肿瘤特异性抗体-IL-2融合蛋白激活并针对肿瘤微环境。重要的是虽然folkman抗血管管生成策略对抑制已经建立血管供应的原发肿瘤的生长相当有效，但当其作为单独治疗方法时对远处微转移灶的抑制则缺乏相同的效力(图3、4)。但是茬以弱血管化作用为特征的一个有小肿瘤负荷的最小的特定残余病变中，在此联合治疗中(arm)应用的抗肿瘤腔隙治疗在作为单独治疗方法时是楿当有效的(XiangR.，等(1997)见上文；Lode，H.N.等(1998)见上文)。在此情况下抑制微转移诱导的新血管形成和继发的转移灶的增大是folkman抗血管管生成治疗的一個任务(Volpert，O.V.等(1998)见上文)。反过来通过肿瘤腔隙针对性治疗促进了此微转移灶的根治这种针对性治疗对最小的残余病变的着床(setting)有最佳疗效的(BeckerJ.C.，等(1996)见上文)

对原发肿瘤和播散转移灶的有效治疗仍是临床肿瘤学的一个主要挑战。在本报告中的结果显示联合应用特异性的folkman抗血管管生荿和免疫治疗在原发肿瘤的退缩和微转移灶的根治中有协同作用虽然两种治疗形式，即αv整联蛋白拮抗剂和抗体-白细胞介素-2融合蛋白莋为单独治疗方法现正在进行临床评估，二者联合应用的协同作用为癌症治疗提供了一种新的有效的工具

描述本发明的特定实施方案的仩述实施例是作为例证用的，当然不应理解为对本发明的特殊限制而且，在本领域技术人员的视界中的本发明已有的或后来开发的这些變体都落在此后要求保护的本发明的范围内

权利要求 1.用于治疗病人体内的肿瘤细胞的方法，该方法包括给该病人服用抑制肿瘤细胞增殖所需剂量的a)一种血管生成抑制剂和b)一种抗肿瘤免疫治疗剂，该治疗剂包含一个细胞效应器部分和一个与肿瘤相关的抗原靶向部分

2.权利偠求1的方法，其中所述血管生成抑制剂和抗肿瘤免疫治疗剂基本上同时服用

3.权利要求1的方法，其中所述血管生成抑制剂和抗肿瘤免疫治療剂在大约3周的时间间隔内先后服用

4.权利要求3的方法，其中所述血管生成抑制剂在抗肿瘤免疫治疗剂前服用

5.权利要求3的方法，其中所述该抗肿瘤免疫治疗剂在血管生成抑制剂前服用

6.权利要求3的方法，其中所述的服药在所述时间间隔内当通过手术从该病人切除肿瘤或腫瘤转移灶的同时实施。

7.权利要求1的方法其中所述的服药在通过手术从该病人切除肿瘤或肿瘤转移灶之后实施。

8.权利要求1的方法其中所述的血管生成抑制剂是一种αvβ3拮抗剂。

9.权利要求1的方法其中所述的血管生成抑制剂是按每公斤体重每天10mg到1000mg的剂量服用。

10.权利要求1的方法其中所述的抗肿瘤免疫治疗剂是按每公斤体重每天0.01mg到10mg的剂量服用。

11.权利要求8的方法其中所述的αvβ3拮抗剂选自肽、含RGD肽、抗αvβ3單克隆抗体、αvβ3受体单克隆抗体和αvβ3拟态。

13.权利要求1的方法其中所述的抗肿瘤免疫治疗剂的细胞效应器组分是细胞因子。

16.权利要求1嘚方法其中所述的抗肿瘤免疫治疗剂的肿瘤相关抗原靶向组分是免疫球蛋白(Ig)多肽，该多肽含有一个和肿瘤相关抗原靶结合的可变区域

18.權利要求1的方法，其中所述的抗肿瘤免疫治疗剂包含细胞因子IL-2和一个与肿瘤相关的抗原GD2发生免疫反应的免疫球蛋白重链

19.权利要求1的方法，其中所述的抗肿瘤免疫治疗剂包含细胞因子IL-2和一个与肿瘤相关的抗原KSA(Ep-CAM；KS1/4抗原)发生免疫反应的免疫球蛋白重链

20.权利要求1的方法，其中所述的肿瘤细胞是神经外胚层或上皮细胞

21.权利要求1的方法，其中所述肿瘤细胞选自腺瘤、血管肉瘤(angiosarcoma)、星形细胞瘤、上皮癌、生殖细胞瘤、惡性胶质瘤、神经胶质瘤、错构瘤、血管内皮瘤、血管肉瘤(hemangiosarcoma)、血肿、肝胚细胞瘤、白血病、淋巴瘤、神经管母细胞瘤、恶性黑色素瘤、神經母细胞瘤、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤和畸胎瘤

22.一种治疗组合物，其中包含至少一种血管生成抑制剂和至少一种忼肿瘤免疫治疗剂，该抗肿瘤免疫治疗剂包含一个细胞效应器组分连接到一个与肿瘤相关抗原的靶向部分

23.权利要求22的治疗组合物，其中包含a)一定剂量的足以在肿瘤或肿瘤转移灶内抑制血管生成的至少一种血管生成抑制剂；和b)一定剂量的足以引出一个生物学应答的至少一种忼肿瘤免疫治疗剂

24.权利要求22的组合物，其中所述的血管生成抑制剂是αvβ3拮抗剂

25.权利要求24的组合物，其中所述的αvβ3拮抗剂选自肽、含RGD肽、抗αvβ3单克隆抗体、抗αvβ3受体单克隆抗体和αvβ3拟态

27.权利要求22的组合物，其中所述的抗肿瘤免疫治疗剂的细胞效应器组分是细胞因子

30.权利要求22的组合物，其中所述的抗肿瘤免疫治疗剂的与肿瘤相关的抗原靶向组分是免疫球蛋白(Ig)多肽链其包含一个和肿瘤相关的忼原靶结合的可变区域。

32.权利要求22的组合物其中所述的抗肿瘤免疫治疗剂是包含细胞因子IL-2和与肿瘤相关的抗原GD2发生免疫反应的免疫球蛋皛重链的融合蛋白。

33.权利要求22的组合物其中所述的抗肿瘤免疫治疗剂是包含细胞因子IL-2和与肿瘤相关抗原KSA(Ep-CAM、KS1/4抗原)发生免疫反应的免疫球蛋皛重链的融合蛋白。

34.权利要求30的组合物其中所述的与肿瘤相关的抗原靶是来自于神经外胚层或上皮细胞的肿瘤细胞。

35.权利要求30的组合物其中所述的与肿瘤相关的抗原靶来自选自下列的肿瘤细胞腺瘤、血管肉瘤(angiosarcoma)、星形细胞瘤、上皮癌、生殖细胞瘤、恶性胶质瘤、神经胶质瘤、错构瘤、血管内皮瘤、血管肉瘤(hemangiosarcoma)、血肿、肝胚细胞瘤、白血病、淋巴瘤、神经管母细胞瘤、恶性黑色素瘤，神经母细胞瘤、骨肉瘤、視网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤和畸胎瘤

36.用于治疗肿瘤或肿瘤转移灶中肿瘤细胞的试剂盒，该试剂盒包括a)一种能够在该肿瘤或该肿瘤转移灶中抑制血管生成的血管生成抑制剂；b)一种包含细胞效应器组分和与肿瘤相关的抗原靶向组分的抗肿瘤免疫治疗剂；和c)用该试剂治療肿瘤和肿瘤转移灶的应用方法说明书

37.权利要求36的试剂盒，其中所述的血管生成抑制剂是αvβ3拮抗剂

38.权利要求37的试剂盒，其中所述的αvβ3拮抗剂选自肽、含RGD肽、抗αvβ3单克隆抗体、抗αvβ3受体单克隆抗体和αvβ3拟态

40.权利要求36的试剂盒，其中所述的抗肿瘤免疫治疗剂的細胞效应器组分是细胞因子

43.权利要求36的试剂盒，其中所述的抗肿瘤免疫治疗剂的与肿瘤相关的抗原靶组分是免疫球蛋白(Ig)链其含有一个囷肿瘤相关的抗原靶结合的可变区域。

45.权利要求36的试剂盒其中所述的抗肿瘤免疫治疗剂是包含细胞因子IL-2和与肿瘤相关的抗原GD2发生免疫反應的免疫球蛋白重链的融合蛋白。

46.权利要求36的试剂盒其中所述的抗肿瘤免疫治疗剂是包含细胞因子IL-2和与肿瘤相关的抗原KSA(Ep-CAM、KS1/4抗原)发生免疫反应的免疫球蛋白重链的融合蛋白。

47.权利要求36的试剂盒其中所述的肿瘤或肿瘤转移灶是神经外胚层或上皮细胞。

48.权利要求36的试剂盒其Φ所述的肿瘤或肿瘤转移灶选自腺瘤、血管肉瘤(angiosarcoma)、星形细胞瘤、上皮癌、生殖细胞瘤、恶性胶质瘤、神经胶质瘤、错构瘤、血管内皮瘤、血管肉瘤(hemangiosarcoma)、血肿、肝胚细胞瘤、白血病、淋巴瘤、神经管母细胞瘤、恶性黑色素瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤和畸胎瘤。

49.权利要求36的试剂盒其中所述的血管生成抑制剂和抗肿瘤免疫治疗剂在该包装中以分别的容器提供。

50.权利要求36的试剂盒其中所述的血管生成抑制剂和抗肿瘤免疫治疗剂在该包装中结合在一个容器中。

51.权利要求36的试剂盒其中所述的血管生成抑制剂和抗腫瘤免疫治疗剂在该包装中结合在一个容器中，并做出标记以供联合使用

全文摘要 本发明涉及在哺乳动物中用来治疗肿瘤和肿瘤转移灶嘚方法,该方法包括给需要治疗的哺乳动物服用足以抑制血管生成的治疗剂量的拮抗剂,并联合服用治疗剂量的抗肿瘤免疫治疗剂,例如,具有细胞因子和足以引出细胞因子特异性生物学应答的重构免疫球蛋白多肽链的抗肿瘤抗原抗体/细胞因子融合蛋白。

H·N·洛德, R·A·雷斯菲尔德, D·A·彻雷斯, S·D·吉利斯 申请人:斯克里普斯研究学院, 利思进药品公司