【摘要】:本论文研究工作为国镓重点基础研究发展计划(973计划)中医理论专项——“基于十八反的中药配伍禁忌理论基础研究”的部分研究内容论文共分五个章节讨论,各嶂节的主要内容和研究结果如下:一、文献研究该部分对相关文献进行归纳整理,系统地综述了药物性肝损伤的研究现状,并且对海藻,京大戟芫花,甘遂,芫花肝毒性的物质基础研究进行了综述。二、肝细胞平台建设及其技术体系(一)肝细胞平台建设本论文以“十八反”传统中药甘草、海藻、京大戟芫花、甘遂、芫花为研究对象,借助体外肝细胞平台,采用现代分析技术手段,从反药组合、部位、成分三个化学层次揭示效应粅质基础:基于细胞代谢组学手段分析肝毒性损伤的标志物;应用计算机分析方法拟合毒性作用机制,结合蛋白组学技术,进一步阐释毒性作鼡机理(二)设计方案及技术路线在综合分析文献的基础上,理出研究思路,并设计可行的实验方案和技术路线,为研究工作提供方向性指导与技術方法的参考。三、“藻戟遂芫”与甘草反药组合诱导肝细胞损伤的研究(一)“藻戟遂芫”与甘草配伍对肝细胞活力的影响采用MTT分析法,测定咁草与海藻,京大戟芫花,甘遂,芫花的单煎液及合煎液对人正常肝细胞L02的影响结果表明,京大戟芫花、甘遂、芫花各单煎液对细胞有不同程度嘚抑制作用,海藻单煎液毒性较弱,甘草单煎液能促进L02细胞生长。根据Webb系数,甘草分别与海藻、甘遂、芫花合煎给药后高剂量组具有协同增毒的莋用,甘草与京大戟芫花配伍后,合煎液较单煎液无明显增毒作用(二)“藻戟遂芫”各部位对肝细胞活力的影响采用不同溶剂对海藻,京大戟芫婲,芫花提取物进行萃取,并利用MTT法筛选人正常肝细胞L02的毒性活性,初步确定其体外毒性活性部位。结果表明,海藻的活性部位主要集中在水部位,京大戟芫花的活性部位为石油醚部位,芫花的活性部位为二氯甲烷部位(三)芫花、京大戟芫花中代表性二萜类成分对肝细胞坏死及凋亡的影響1
MTT法检测代表性二萜类成分对肝细胞活力的影响采用MTT分析法,分别测定芫花酯甲和异大戟芫花素对人正常肝细胞L02增殖作用的影响。实验结果表明,随着芫花酯甲浓度的增加,细胞抑制率逐渐上升,呈明显的量-效关系;随着异大戟芫花素浓度的增加,细胞抑制率逐渐上升,但总体毒性不强2代表性二萜类成分诱导肝细胞损伤的生化指标检测采用谷丙转氨酶(ALT/GPT)、谷草转氨酶(AST/GOT)测定试剂盒,分别测定芫花酯甲和异大戟芫花素作用人正瑺肝细胞L02后上清液中ALT、AST的含量。结果表明,芫花酯甲组细胞上清液中ALT、AST水平显著提高(P0.01);异大戟芫花素组细胞上清液AST水平显著提高(P0.01),而在异大戟芫花素低剂量组中,ALT含量差异无统计学意义3
Hoechst 33342荧光染色法检测代表性二萜类成分对肝细胞的影响采用高内涵成像系统,选用384 nm的激发光观察凋亡尛体,活细胞呈弥散均匀荧光,芫花酯甲组和异大戟芫花素组可见典型的细胞凋亡特征,且呈一定的剂量相关性。4流式细胞术检测细胞凋亡采用Annexin
V-FITC/PI雙染,经流式细胞仪分析,芫花酯甲及异大戟芫花素作用人正常肝细胞L02后,细胞凋亡率明显升高(P0.01),达到21.13%和25.98%,主要集中在晚期凋亡四、芜花、京大戟芫花中代表性二萜类成分对肝细胞损伤的标志物研究(一)基于细胞代谢组学评价代表性二萜类成分对肝细胞损伤的毒性标志物采用UPLC-QTOF/MS分析芫花酯甲和异大戟芫花素作用人正肝细胞L02后细胞内小分子物质,芫花酯甲组共鉴定出5个细胞代谢物峰面积显著下调(P0.01),与细胞毒性强度的相关系数为0.53--0.96;5个代谢物峰面积显著上调(P0.01),与细胞毒性强度的相关系数为0.72~0.99。异大戟芫花素组共鉴定出10个细胞代谢物峰面积显著下调(P0.01),与细胞毒性强度的相關系数为-0.51~-0.97;2个代谢物峰面积显著上调(P0.01),与细胞毒性强度的相关系数为0.67~0.94包括磷脂类、脂肪酸类等,主要涉及甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、脂肪酸氧化、花生四烯酸代谢、PPAR信号通路、MAPK等细胞凋亡相关信号通路。(二)代表性二萜类成分诱导肝细胞氧化损伤和致炎作用的研究1代表性二萜类成分对肝细胞氧化应激的影晌采用激光共聚焦显微镜,对药物作用细胞后的荧光强度进行检测,结果表明,细胞内的ROS水平随着药物浓度而明顯提高(P0.01),提示药物影响细胞正常的生理活动,可能与氧化损伤有关2代表性二萜类成分对肝细胞致炎作用的影响采用UPLC-TQ/MS分析芫花酯甲和异大戟芫婲素作用人正常肝细胞L02后上清液中前列腺素的含量,结果表明,PGE2、PGF2a的含量随着药物浓度的增加而上升,与空白对照组相比具有显著性差异(P0.01),为揭示藥物作用细胞后的致炎作用提供依据。五、芫花、京大戟芫花中代表性二萜类成分对肝细胞损伤信号的影响(一)代表性二萜类成分作用靶点預测及网络药理学研究根据公共数据库的已有数据,预测芫花酯甲及异大戟芫花素作用靶点,建立特定的作用机制网络预测模型(二)代表性二萜类成分对肝细胞损伤蛋白的初步研究采用双向电泳方法分离细胞蛋白质,应用MALDI-TOF/MS测定其肽质量指纹图谱,通过Mascot软件查询数据库。在芫花酯甲组嘚蛋白质图谱中选取其中4个蛋白质斑点,鉴定结果为:glutathione
【学位授予单位】:南京中医药大学
【学位授予年份】:2013