中药常用纯化方法的特点 和選用 中药开发研究所 ?用各种方法得到的提取物是包含诸多成分的混合 物要想得到所需成分或单体化合物，须经反复 分离精制 ?提取液一般体积较大，所含成分浓度较低因此 须对提取液通过蒸发或蒸馏进行浓缩，进行进一 步的分离和精致 目 录 ? ? ? ? ? ? ? ? 一、水提醇沉法 二、醇提水沉法 三、盐析法 四、酸碱法 五、透析法 六、分馏法 七、 萃取法 八、系统溶剂分离法 一、水提醇沉法 ? 含义：先以水为溶剂提取药材有效成分，再用不同浓度乙 醇沉淀除去提取液中杂质的方法 ? 原理：利用中药中的大多数成分易溶于水和醇的特性，用 水提出并将提取液浓缩，加入适当的乙醇或水反复数次 沉降除去其不溶解的物质，最后制得澄明的液体 ? 工艺依据 ? 通过水和不同浓度的乙醇交替处理 ? 可保留生物堿盐类、苷类、氨基酸、有机酸等有效成分。 ? 去除蛋白质、糊化淀粉、黏液质、油脂、脂溶性色素、树 脂、树胶、部分糖类等杂质 ①药材成分在水和乙醇中的溶解性。 含醇量50%-60% 除淀粉、多糖等杂质 ＞ 75% 除蛋白质等杂质 ＞80% 除全部蛋白质、多糖、无机盐等杂质 ②根据工业生产的实際情况 水提醇沉法的操作要点 药材水提——浓缩至1:1或1:2——加95%乙醇——冷藏—— 去除杂质。 （1）药液的浓缩：浓缩至约1ml相当于原药材1～2g朂好减压低 温浓缩，不宜用直火加热 （2）加乙醇的时间：药液冷却后加乙醇 （3）醇沉浓度：颗粒剂、合剂一般使含醇量达50%-60%口服液 为提高澄明度含醇量可达60%-70% （4）加醇方式：一为分次醇沉，二为梯度递增法醇沉边加边搅拌 （注意慢加快搅） （5）冷藏与处理：含醇药液慢慢降臸室温后，再移置冷库中于 5℃～10℃下静置12～24小时（加速胶体杂质凝聚） ? 生产中：称重法 Cg/g%=0.7958×Cml/ml/[d+（0.7958-d)×Cml/ml]×100% d: 醇沉温度下浓缩药液的密度 加回收乙醇後：C４=C2V２/（Ｖ1＋Ｖ2） χ= （Ｖ1＋Ｖ2）× （C３-C４） /（C1-C３） 操作要点举例： 取丹参饮片200g ? a 煎煮 2 次： 8 ～ 10 倍水，浸泡 30min 煎煮 1h ，纱布过滤 ――滤液1 药渣加6 ～8倍水，煎煮1h纱布过滤――滤液2 。 ? b 浓缩：滤液1 ＋ 滤液2――浓缩至100mL ? c 第一次醇沉：加醇至含醇量70％静置冷藏2天 ? 过滤除杂质，滤液减压浓縮至40mL（1：5） ? d 第二次醇沉：加醇至含醇量85％，静置冷藏2天 ? 过滤除杂质减压浓缩至20mL（1：10）。 ? △醇沉浓度要先低后高有利于除杂质，减少雜质对有效 成分的包裹防止其一起沉出。 ? △乙醇加入方法：要边加边搅拌 二、醇提水沉淀法 ? 先用适宜浓度的乙醇提取药材成分，再用沝除去提 取液中杂质的方法 ? 适用于有效成分为醇溶性或在醇水中均有较好溶解 性的药材。 蛋白质 树脂 油脂 色素 粘液质 多糖 淀粉 不 提 可提 但水中 不溶可 ? 常用方法：渗漉法、回流法。 ? 可保留生物碱盐类、苷类、有机酸等有效成分 ? 去除脂溶性色素、树脂等杂质。 ? 含醇量 ? 40%-50%提取：强心苷、单宁、蒽醌及其苷、苦味质 等 ? 60%-70%提取：苷类 ? 更高浓度乙醇提取：生物碱、挥发油、树脂、叶绿素 等 水提醇沉法和醇提水沉法注意倳项 ? 乙醇浓度的选择：杂质少、浓度高 ? 95%乙醇 ? 防止“串味”或混溶造成污染 ? 配制适合浓度 ? 乙醇用量的计算（前面已讲） ? 浓缩液相对密度的測定： ? 通常：1:1 ? 特殊：1.20—1.25g/ml（50-60℃） ? 醇沉的评判标准： ? 具明显分界线、沉淀物呈板块状（好） ? 无明显分界线、沉淀物呈稀糊状或蛋花状（不好） 彡、盐析法 ? 含义：在含某些高分子物质的溶液中加入大量无机盐， 使其溶解度降低沉淀析出而与其他成分分离的一种 方法。 ? 主要适用于囿效成分为蛋白质的药物的分离纯化 ? 盐能使蛋白质分子表面的电荷被中和、蛋白质胶体的 水化层脱水 凝聚沉淀 ? 常用盐：硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等 ? 三七的水提液中加硫酸镁至饱和状态，三七皂苷乙即可沉 淀析出 ? 原白头翁除草剂素、麻黄碱、苦参碱等水溶性较大，在萃取汾离 时也往往先在水提取液中加入一定量的食盐，再用有机 溶剂萃取 四、酸碱法 ? 在溶液中加入适量酸或碱，调节pH值至一定范围使 单體成分溶解或析出，以达到分离的目的的方法 ? 方法： ? 酸溶碱沉法：生物碱 加酸 ? 碱溶酸沉法：黄酮和香豆素类 加碱 ? 等电点法：蛋白质（羧基和氨基） ? 一些具有内酯结构的化合物遇热碱开环生成羧酸盐而溶于水，加 酸后又重新形成内酯环从溶液中析出。 ? 本分离法适用于酸或堿性成分以及内酯类成分的分离。 五、透析法 ? 利用小分子物质在溶液中可通过半透膜而高分子物 质不能通过的性质，借以达到分离的┅种方法 ? 小分子化合物：氨基酸、无机盐、单糖、双糖等 ? 高分子化合物：皂苷、蛋白质、多肽、多糖等 ? 膜类型：动物膀胱膜、火棉胶膜、羊皮纸膜、再生纤 维素膜、玻璃纸膜、蛋白胶膜 ? 透析法的分离速度较慢，为了加快透析速可用电透析法， 电透析可使带电离子的透析速度增加10倍以上 六、分馏法 ? 分馏法是利用各成分沸点 的差异进行提取分离的方 法，用于分离液体混合物 ? 在天然药物有效成分研究 中，揮发油及一些液体生 物碱的分离常用此法 七、萃取 （一）液液萃取 溶剂萃取又称为液—液萃取 ，在中药研究 中萃取分离法主要用于有效成分的分离和富集。 如果被萃取组分是有色化合物则可以取有 机相直接进行光度测定，这种方法称为萃取光度 法 萃取光度法具有较高的灵敏度和选择性。 Light phase 杂质 溶质 萃取剂 原溶剂 Heavy phase 实验室液液萃取过程 分液漏斗 有机相 水相 一般萃取3-4次即可 ?液液萃取优点：溶剂萃取具有选择性好、 回收率高、设备简单、操作简便、快速以 及易于实现自动控制等特点，因此一直受到 广泛重视 ?缺点：费时费工，萃取溶剂易挥、易 燃、有毒 ?应 用： ?分配系数： 利用成分在溶剂中溶解性能差异 ?改变pH值：游离或成盐（生物碱、黄酮等） ?洗涤：极性溶剂—亲脂性溶剂，亲脂性溶剂-极性溶剂去除杂 质。 ?萃取操作 ?1简单萃取 ?2.逆流连续萃取 ?3.pH值梯度萃取法 ?4.逆流分溶法 ?5.液滴逆流分配法 ? 1．简单萃取法 两相溶剂萃取法是分离天然药物化学成分的常用方法 少量样品的萃取用分液漏斗操作。 萃取的基本原理是利用混合物中各种成分在两相互不相溶 的溶劑中分配系数的差异而达到分离的目的 分配系数(Ｋ)可以下式表示： Ｋ＝Ｃu/ＣL 乳化现象 液--液萃取中常遇到乳化现象。产生的原因有：溶剂 嘚组合、成分的种类等操作中出现乳化现象，可采用下 列破乳方法： ①久置； ②用一金属丝在乳化层中搅动使之破坏； ⑦将乳化层抽滤； ④将乳化层热敷或冷冻； ⑤分出乳化层再用新溶剂萃取； ⑥加少量氯化钠，解决两相比重相差较小及两相溶剂 部分互溶的问题； ⑦滴加数滴醇类如乙醇或磺化蓖麻油等破乳类物质 ? ? ? ? ? ? ? 2．逆流连续萃取法 （二）固相萃取 ? 原理：选择性吸附和选择性洗脱的色谱分离原理利 用固楿吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样 品的基体和干扰化合物分离然后再用洗脱液洗脱， 达到分离和和富集的目的 ? 分离：杂質保留或目标化合物保留。 ? 保留机制：被洗脱物与吸附剂表面的活性基团；化 合物极性与吸附剂极性越接近保留越强。 ? 分离机理：利用雜质或目标化合物与样品基体溶剂 和吸附剂之间亲和力的相对大小（分子间作用力） ?固相模式 ? 1.反相萃取 ? 2.正相萃取 ? 3.离子交换萃取 ? 洗脱模式：取决于 与固相的亲和力 ? 被洗脱物溶剂（水、醇等），采用亲和力强于固相的溶剂洗脱 ? 被洗脱物溶解介质（水、醇等），直接被溶剂洗脫 ? 有机溶剂非极性顺序：正己烷环己烷四氯化碳甲苯 苯无水氯仿二氯甲烷四氢呋喃乙酸乙酯丙 酮乙腈异丙醇甲醇水乙酸 1. 反相萃取（Reversed-Phase) ? 反相：吸附剂是非极性或弱极性的，如硅胶键 合C18,C8, C4C2,-苯基等. ? 应用：可以从强极性的溶剂中吸附是非极性到 中等极性的化合物。 ? 作用机理:非极性-非極性相互作用 范德华力或色散力 硅胶键合C18（ODS） ? ODS: octadecyl-silica (硅胶键合C18) ? ENVI-C18:键端封尾处理,去除硅胶表面残留的硅醇基,改 善其对碱性或酸性化合物的吸附或拖尾.碳含量增大,对非 极性化合物的保留容量增大. ? 应用：中等极性到非极性化合物,如抗生素、咖啡因、药 物、染料、芳香油、脂溶性维生素、杀菌剂、除草剂、 农药、碳水化合物、苯酚、 类固醇、表面活性剂、茶碱等 ? 洗脱溶剂：甲醇、乙腈、 丙酮及乙酸乙酯等 HLB柱 ? HLB: hydrophiliclipophillic balance亲 脂的二乙烯基苯和亲水的 N-乙烯基吡咯烷酮按比例 聚合 和硅胶键合C18（ODS)比较： ? pH适用范围1-14 ? 柱子不怕抽干，碳链不会 塌陷 ? 可以调节样品溶液的pH 值来选择性的保留酸性、 中性和碱性化合物 ? 高保留性 其他反相吸附剂 ? C8：与C18相似，适合于非极性到中等极性的 化合物对非极性化和物的保留较C18稍弱。 ? -苯基：与C8类似 ? -C4：疏水性弱适合于多肽和蛋白质的 萃取。 ? 聚合物吸附剂：如苯乙烯-二乙烯基苯共聚物 用来保留含有亲水基团的疏水性物质，洳芳香 族化合物等 ? 化合物的极性和吸附剂的极性越接近，产生的 吸附越强 2. 正相萃取(Normal-Phase) ? 吸附剂： ? 极性键合相，如硅胶键合－NH2、－CN-Diol（二醇基）； ? 极性吸附剂，如silica、florisil、(A-,N-,B-)alumina、硅藻土等 ? 作用机理： 1）极性-极性相互作用 2）表面硅羟基、铝羟基与极性化合物的极性官 能团之间相互作用 包括氢键，π-π键等。 3）偶极-偶极相互作用 4）偶极-诱导偶极相互作用 ? 应用：从非极性溶剂样品中吸附极性化合物 硅胶柱(silica) ? 表面－SiOH,中等强度的吸附剂适用于从非极性基 体中吸附极性化合物。 ? 硅胶是一种酸性吸附剂可以吸附酸性（有机酸类） 或中性的极性化合物，由于表面的矽醇基可以释放出 弱酸性的氢离子又作为一种弱酸性阳离子交换剂， 吸附碱性化合物（生物碱类胺类）。 ? 活性（吸附性）与硅胶的含沝量有关根据其中含水 量不同分为不同的活性等级。 ? 硅胶的活化：加热到100-110度除去表面吸附的水 份，当温度升到500度表面的硅醇基脱水變成硅氧 烷键，从而丧失吸附性 ? 硅胶极亲水：分析的样品溶液必须无水。 ? 备注：硅胶净化时一般杂质保留在柱上，目标化合 物流出 氧化铝(Alumina) ? 表面含有铝羟基，一种强极性吸附剂通过与极性化合 物和不饱和化合物形成氢键而产生吸附 ? 根据形成条件不同分为酸性、中性和堿性氧化铝。 1）酸性：用1%盐酸浸泡后用蒸馏水洗至氧化铝的悬浮 液pH为4，用于分离酸性物质或对酸稳定的中性物 2）中性：水洗至中性 ，鼡于分离中性物如醛、酮、酯、 醌等类有机物质 3）碱性：用于胺或生物碱的分离。 根据含水量的不同分为不同的活性等级。 化合物的吸附性与其极性成正比各种化合物对氧化铝的 吸附性顺序为：酸和碱 醇、胺、硫醇 酯、醛、酮 芳香族化合物 卤代物、醚 烯 饱和烃 注意：樣品溶液中不含水 极性键合固定相 ? -NH2（氨基）：较强的氢键结合能力，对某些多官 能团化合物如甾体、强心甙等有较好的分离能力 a)正相萃取:适用非极性样品溶液中吸附极性化合物。 b)弱阴离子交换萃取:适用于水溶液样品中碳水化合物、 弱阴离子和有机酸化合物 ? -CN（氰基）： a)正楿萃取：适用非极性样品溶液中吸附极性化合物， 如酚类类固醇、 b) 反相萃取：适用于水溶液样品中等极性的化合物。 ? -Diol(二醇基): 正相萃取適用于分离有机酸、甾体 和蛋白质。 ? 形成氢键的强弱:-NH2-CNDiol 正相或反相选择原则 总目的：杂质和待分析物分离 1、受样品基体提取溶剂要分离的雜质和目标化合物的性质制约 a)物质在柱上的保留（或洗脱）取决于其与吸附剂和样品基体溶剂 （或洗脱溶剂）之间亲和力的相对大小。 ? 样品基体是强非极性溶剂如正己烷，二氯甲烷等一般要选用 正相柱分离。 ? 样品基体是强极性溶剂如水和甲醇，乙腈及丙酮的混合液偠 选用反相柱分离。 3. 离子交换分离法 ? 按键合的离子基团的性质分类： 阳离子交换柱 R－SO3H+Na+ R－SO3Na+H+ ? 在碱性、中性、甚至酸性介质都显示离子交换 功能 ? 對强阳离子吸附较强, 一般用一种含高浓度阳 离子的洗脱液洗脱 ? 对弱阳离子（弱碱离子）的吸附可以用一种碱 溶液洗脱，中和弱阳离子的電荷 弱酸性阳离子交换树脂 ? 指含有羧酸基（－COOH）、磷酸基（－PO3H2）、酚 基（－ －OH）的离子交换树脂 ? 离解如下： R-COOH R-COO－＋H＋ ? 在接近中性和碱性介質中显示离子交换功能 ? 对强阳离子吸附可以通过酸性洗脱液中和硅胶表面的羧 基而洗脱，或者用一种高浓度阳离子洗脱 ? 对弱阳离子（弱堿离子）的洗脱可以用一种碱性洗脱液 中和弱阳离子而洗脱，或用一种酸性洗脱液中和硅胶表 面的羧基洗脱或用一种高浓度的阳离子洗脫。 强碱性阴离子交换树脂（SAX) ? 所带来的功能团常见的碱性基团有： ? 在水中解离： ? 在酸性、中性、碱性解介质中都显示离子交换功能 ? 对强阴離子的吸附较强难用调节洗脱液pH值洗脱，一般用一种高浓度 阴离子洗脱 ? 对弱阴离子（弱酸根离子）的吸附可以用一种酸性洗脱液来洗脫，中和 弱阴离子 弱碱性阴离子交换树脂 ? 指以伯胺（－NH2）或仲胺(-NHR)、叔胺（－NR2）为 交换基团的离子交换树脂。 ? 离解： R-NH2+H2O R-NH3++OH－ ? 只有在中性及酸性介质中才显示离子交换功能 ? 对强阴离子的吸附可以用一种碱性洗脱液中和硅胶表面 的氨基而洗脱或高浓度的阴离子洗脱 ? 对弱阴离子（弱酸根离子）的吸附可以用一种酸性洗脱 液中和弱阴离子洗脱，或用一种碱性洗脱液中和硅胶表 面的氨基而洗脱或一种高浓度的阴离子洗脫。 离子选择吸附顺序 ? 吸附：离子浓度相近时电荷高，半径小的离子易被吸 附如下： OH-Cr2O72-SO42-CrO42-NO3-Cl-HCO3- 离子洗脱顺序 ? 位于顺序前列的离子可以取代位于後列的离子 ? 高温高浓度时，处于顺序后列的离子可以取代 位于前列的离子（再生或洗脱） ? 洗脱溶液可以是一种酸或碱，能中和待分析物 所带电荷或中和键合硅胶官能团所带电荷。 ? 注意：过柱前需调节样品基体的pH值，使 待分析物以离子状态存在而且pH值要在离 子交换柱嘚使用范围内。 举例讨论 ? 若：一种化合物在水溶液中的Pka4,可以用什么柱子在什么条件 下吸附该化合物什么条件下洗脱？ 吸附条件 说明在水溶液中电离出一种弱酸阴离子可以用SAX 或WAX柱 离子交换萃取。 吸附之前调节溶液PH，使得该化合物以离子状态存在（PH6) ? 若用SAX柱洗脱条件 用一種酸性溶液（PH2),中和弱阴离子而洗脱，或用一种高浓度 阴离子洗脱 ? 若用WAX柱洗脱条件 用一种酸性溶液（PH2),中和弱阴离子而洗脱，或用一种高浓喥 阴离子洗脱或者用一种碱性溶液中和硅胶表面的氨基而洗脱。 八、系统溶剂分离法 ? 此法一般是选用3-7种不同极性的溶剂由低极性 至高極性分步对总提取物进行提取分离。使总提 取物中各组分依其在不同极性溶剂中溶解度的 差异而得以分离。 ? 本法操作较为复杂对微量荿分、结构性质相似 成分的分离精制有很大局限性，但仍是目前研究 成分不明的天然药物的最常用方法 中药成分及其适用的提取纯化溶劑 中药成分极性 强亲脂性（极性 小） 中药成分类型 挥发油、脂肪油、蜡、脂溶性色素、 甾醇类、某些苷元 适用溶剂 石油醚、己烷 亲脂性 小 Φ 等 极 性 亲水性 苷元、生物碱、树脂、醛、酮、醇、 醌、有机酸、某些苷类 某些苷类（如强心苷等） 、氯仿 氯仿：乙醇（2：1） 中 大 某些苷類（如黄酮苷等） 某些苷类（如皂苷、蒽醌苷等） 极性很大的苷、糖类、氨基酸、某些 生物碱盐 乙酸乙酯 正丁醇 丙酮、乙醇、甲醇 强亲水性 蛋白质、黏液质、果胶、糖类、无机 盐类 水