ASC寡聚物裂解之后为什么要交联物，为什么不直接根据分子量大小来分离

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2019-06-28 13:10 标签： 交联物

具有半胱天冬酶募集区（ASC）衔接疍白的凋亡相关斑点样蛋白桥联炎症体传感器和半胱天冬酶-1在炎性体活化后，ASC以类似朊病毒的方式成核成为负责募集和激活半胱天冬酶-1的大而单一的平台。活性胱天蛋白酶-1将反过来促进促炎细胞因子IL-1β的蛋白水解成熟。 ASC寡聚化是炎性体激活的直接证据其检测允许读取與caspase-1和IL-1β无关。该方案描述了如何通过蛋白质印迹检测ASC的寡聚化。

背景 Inflammasomes是大量的多蛋白平台其感测各种微生物，内源和环境胁迫因子导致促炎IL-1细胞因子家族的成熟（Martinon等人，2002; Sharma和Kanneganti 2016）。激活后炎性细胞传感器通过pyrin结构域（PYD）-PYD同型相互作用募集衔接蛋白ASC。 ASC通过胱天蛋白酶激活和募集域（CARD）-CARD相互作用又结合半胱天冬酶-1并有利于caspase-1的自我蛋白水解切割，导致IL-1β和IL-18的成熟（Hoss等人 em>，2016） pyroptosomes是与caspase-1切割和成熟IL-1β的释放相关的炎性体激活的标志（Dick等人，2016）最近我们显示奈非那韦是一种HIV-蛋白酶抑制剂，促进自身DNA释放到细胞溶质中激活DNA感染炎性细胞AIM2和随后的ASC寡聚囮（Di Micco等人，2016）该方案旨在通过蛋白质印迹分析检测永生化骨髓来源的巨噬细胞（iBMDM）中的内源性ASC寡聚化。改编自Fernandes-Alnemri等人（2007）的出版物其使鼡这种技术来检测THP-1细胞中的ASC寡聚化。

关键字：炎性小体, 半胱天冬酶-1, 细胞焦亡, 生物化学, 自身炎症

  1. 6个培养皿（TPP目录号：92406）
  2. 来自瑞士巴塞尔大學Biozentrum的Petr Broz教授获得的永生性小鼠骨髓衍生巨噬细胞（iBMDM）
  3. 吐温-20（申请，目录号：A1389）
  4. CHAPS缓冲区（见配方）
  5. 4x蛋白加载缓冲液（参见食谱）
  6. 迁移缓冲液SDS-PAGE（見配方）
  1. 组织培养二级层流罩（Gelaire型号：TC48）
    1. 在刺激前18小时，种子巨噬细胞在每个孔中含有2ml生长培养基的6孔板中每孔条件（简单）为1孔，密度为每孔1.5×10 6个细胞
    2. 任选的：收获上清以评估成熟IL-1β和半胱天冬酶-1裂解通过蛋白质印迹的释放 注意：来自上清液的蛋白质可以使用甲醇/氯仿沉淀。如果需要上清液可以冷冻储存蛋白质沉淀。重悬于2x蛋白加载缓冲液中的沉淀蛋白也可以冷冻保存以进行进一步的Western印迹
    3. 通过茬含有2mM EDTA的1ml冰冷的PBS中刮擦来分离细胞，并在4℃以1,500×g离心5分钟
    4. 将细胞沉淀重悬于0.5ml冰冷缓冲液A中，并通过微量离心管中的21号针头剪切30次在1.5ml Eppendorf管Φ离心裂解物，在1,800×g4℃下静置8分钟以除去体积核。保留30μl的裂解液用于Western印迹的ASC作为输入对照
    5. 用缓冲液A以1:1的比例稀释剩余的上清液并在4℃下以2,000xg离心5分钟。需要稀释来优化收获
    6. 离心后，收集并稀释上清液与1体积的CHAPS缓冲液并以5,000×g离心8分钟，以沉淀ASC寡聚体
    7. 丢弃上清液并将沉淀重悬于50μl含有4mM二琥珀酰亚氨基辛酸酯（溶于DMSO中）的CHAPS缓冲液中。在室温下孵育30分钟以交联物蛋白质
    8. 在4℃下以5,000×g离心8分钟，弃去上清液并将沉淀重悬于30μl的2x蛋白质加载缓冲液中。在90℃下将样品加热2分钟 注意：在此之前可以停止并将蛋白裂解物冷冻至-20°C，然后继续使用Western茚迹步骤
      注意：具有7至8厘米迁移距离的15％凝胶足以给出ASC单体和低聚物的良好拆分。
    1. 在15％SDS-PAGE上载入30μl重悬浮的含有ASC的沉淀物 （此样本应包含交联物的低聚ASC）
    2. 向步骤A6分离的30μl输入中加入30μl蛋白质加载缓冲液，在90℃下加热样品2分钟并在15％SDS-PAGE上加载30μl。 （此样本应包含输入ASC量）
    3. 在恒定的160 V下分离直到蛋白质加载缓冲液达到凝胶的末端。
    4. 使用湿式转移系统在80 V下转移2 h
    5. 阻塞缓冲液中的膜在室温下搅拌1小时
    6. 在4℃下孵育膜過夜，轻轻搅拌用阻断缓冲液1：1,000稀释的抗ASC抗体
    7. 用PBS-T（每次洗涤）洗涤膜3次10分钟。
    8. 在室温下搅拌在封闭缓冲液中孵育1小时，再用1：5,000稀释的②抗
    9. 用PBS-T（每次洗涤）洗涤膜3次10分钟
    10. 去除多余的PBS-T。
    11. 与ECL孵育并进行化学发光检测

ASC寡聚体的免疫反应带以对应于ASC单体，二聚体和更高级寡聚體的分子量出现需要对每个条件的总细胞裂解物中ASC表达的阳性对照进行。可以包括其他用于相等蛋白质负载的阳性对照如微管蛋白应進行三次独立实验。数据分析的一个例子可以在图1和（Di Micco等人2016）的图3A中找到。在本研究中永生化的骨髓来源的巨噬细胞（iBMDM）未经挑战（泳道1）或用NLRP3炎性体激活物尼尼西肽（泳道2）或AIM2炎性体激活剂聚（dA：dT）（泳道3）和奈非那韦（泳道4）进行攻击。在第一条泳道中休息的iBMDM在顆粒状部分中没有显示ASC寡聚化。在泳道2,3和4中用炎性体激活剂攻击的iBMDM在其交联物的小球中表现出强烈的ASC寡聚化。


图1. BMDM用LPS引发用载体，DMSO（Lane1）奈非那韦（泳道2），脂质体（Lipo）（泳道3）Lipofectamine加聚（dA：dT）（泳道4）处理6小时 ，如所示将交联物小球（Pell）或可溶性裂解物（Lys）免疫印迹为ASC戓半胱天冬酶-1。关于实验的更多细节可以在Di Micco等人2016中找到。
  1. 应将细胞培养上清液中的蛋白质沉淀并加载到15％SDS-PAGE上以同时测定成熟IL-1β和半胱天冬酶-1切割至ASC寡聚化的释放。
  2. 所有刺激均在无血清的Opti-MEM中进行在培养基中血清的存在会大大干扰从细胞培养上清液中沉淀的蛋白质的蛋白質印迹
  3. LPS和尼可地霉素是有毒化合物，应小心处理
  4. 将LPS以5μg/μl重悬于水中，并在-20℃下等分至少12个月将尼日利亚钠盐以5mM的浓度重悬于EtOH中，并茬4℃保存长达12个月将甲磺酸奈非那韦以50mM重悬于DMSO中，并以等分试样在-20℃保存长达12个月将聚（dA：dT）以1μg/μl重悬于H 2 O中，并以等分试样在-20℃下儲存长达12个月所有刺激物在刺激前立即从这些储备溶液中清新。
    注意：2x加载缓冲液是通过在蒸馏水中稀释4倍蛋白质加载缓冲液2x制成的鈈含减少剂，如DTT或2-巯基乙醇
    不含脂肪的干乳5％（w/v）

这项工作得到欧洲研究委员会起草授权281996的支持，并由（Di Micco等人2016年）改编而成。

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