血常规白细胞结果白细胞11.4x10^9/L血红蛋白86g/L血小板36x10^9/LPh

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内容提示：实验性糖尿病对大鼠胸腺的影响多糖、脂类和酶组织化学研究

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四川大学 博士学位论文 可变盐单胞菌中草甘膦抗性EPSP合酶新基因克隆、大肠杆菌表 达及其抗性机制的研究 姓名：刘柱 申请学位级别：博士 专业：遗传学 指导教师：杨志荣 四〣大学博士学位论文 可变盐单胞菌中草甘嶙抗性EPSP合酶 新基因克隆、大肠杆菌表达及其抗性机制的研究 遗传学 专业 研究生:刘柱 指导教师:杨志榮 林敏 从被草甘磷极度污染的土壤中分离到一株极端抗草甘磷菌HTG7它 能在900mmol/L草甘麟的限制性培养基Mops上生长。表型及16SrDNA鉴 定其为可变盐单胞菌 從可变盐单胞菌HTG7构建的粘粒基因组文库中克隆到一个完整的基 因，能恢复EPSP合酶缺陷型菌株E.coliER2799在限制性培养基中的生 长能力并能在草甘麟浓喥为80mmol/L的Mops液体培养基中良好生长。 基因全长 1350个碱基对核若酸序列与目前已报导的编码 EPSP合酶的 aro月基因几乎没有任何同源性，氨基酸序列与草咁麟抗性相关的美国专 利所涉及的22种微生物EPSP合酶的同源性在46%以下利用生物信息学 方法，对编码产物进行亚细胞定位还对其保守结构域、蛋白水解酶的切 害」位点、蛋白的二级结构、疏水区及跨膜区进行分析预测，所有结果表明 我们所克隆的是一个结构新颖、功能明确并高抗草甘麟的新基因本基因 已在GenBank中注册，登录号为AY573186a 新基因与PET-28a(+)构建了N_端带有His-Tag和T7-Tag的融合蛋 白表达载体转化大肠杆菌 EcoliBL21(DE3),30℃能诱导可溶表达。 SDS显礻表达物分子量为51kD:蛋白通过镍离子鳌合柱得到了纯化 WesternBlot表明经纯化的蛋白可以与检测试剂盒中的抗体特异结合。 酶活实验证明表达产物有EPSP匼酶的活性 为了寻找EPSP合酶中某些与草甘磷抗性相关的位点，利用错误倾向 PCR技术对可变盐单胞菌HTG7的EPSP合酶基因进行随机PCR扩增，通 过EPSP合酶缺陷型菌株E.cotiER2799的互补筛选获得了2个不具有 VI 四川大学博士学位论文 草甘麟抗性的EPSP合酶突变体。1号突变体EPSP合酶编码区与突变前基 因相比核营酸346T變为 6“G，导致氨基酸残基’2V(密码GTG)变为3G‘ (密码GGG);核营酸49‘3丁变为493‘6氨基酸残基 "‘V没发生改变2号突 变体EPSP合酶编码区与突变前基因相比，核普酸179A變为了‘G，导致66Q (密码CAA)变为 'R‘(密码CGA):核昔酸992A变为.03T导致氨基酸’66T (密码ACC)变为’689(密码TCC);核昔酸’72T变为”2A，导致氨基酸’"V (密码GTT)变为291D(密码GAT):核营酸6696变为669A,氨基酸残基223L 没发生改变:核昔酸’W4T变为"0‘A,氨基酸残基37犯没发生改变 对突变前后的EPSP合酶进行比较预测，发现突变前后氨基酸位点肤 平面和N原子の间形成的扭转角度存在一定的差别这些结果表明酶的功 能主要由中心骨架决定，而肤平面和N原子之间角度的变化造成高级结 构构象細微的差别，致使草甘麟抗性功能的丢失 关键词:可变盐单胞菌，草甘麟抗性EPSP合酶，aroA基因 原核表达错误倾向PGR突变，结构预测 四川大學博士学位论文 Cloning a novel 5-enolp

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