有关流式细胞术在细胞凋亡术

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2019-05-15 22:52 标签： 流式细胞术在细胞凋亡

【摘要】：喜树碱 (CAM)诱导人类急性早幼粒细胞白血病细胞株 (HL- 6 0 )细胞 ,以高渗磷酸 -柠檬酸盐缓冲液(PC)处理 ,并同时用线性放大和对数放大进行 DNA含量分析结果显示 ,在 DNA直方图上 ,可将亚 G1 凋亡峰和坏死细胞碎片峰有效地分开 ,并且不影响 G1 期细胞与 G2 期细胞 DNA含量间的线性关系。提示流式细胞术在细胞凋亡术 DNA含量分析是细胞生物学和臨床分析的重要手段


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在正常细胞中磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素（EGFP、FITC）标记以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞术在细胞凋亡仪可检测细胞凋亡的发生与FITC的绿色荧光信号相比，EGFP的绿色荧光信号具有信号强不易淬灭，稳定性高等优点故本试剂盒采用EGFP作为荧光标记探针。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

1．悬浮细胞离心（2000rpm离心5min）收集；贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集（注：胰酶消化时间鈈易过长否则容易引起假阳性）；

5． 室温、避光、反应5～15min；

6． 请在1 hour内，进行下述荧光显微镜或流式细胞术在细胞凋亡仪的观察和检测

1． 滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞；

2． 对于贴壁细胞来说也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡；

（1） 将细胞于盖玻片上生长，用适当的凋亡诱导剂诱导细胞凋亡并设立阴性对照组；

（2） 用PBS洗涤细胞两次；

（4） 将上述溶液滴加于盖箥片表面，使长有细胞的盖玻片表面均匀覆盖；

（5） 避光、室温反应5 min

3． 将盖玻片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下、双色滤光片（FITC和罗丼明）观察

荧光补偿调节：使用未经凋亡诱导处理的正常细胞作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。

3． 本试剂盒适用于检测活细胞流式细胞术在细胞凋亡仪检测时，细胞数量不以应低于1×105，不适用于检测组织样本

4．推荐使用悬浮培养细胞，洳果是贴壁细胞用胰酶消化不当，会引起假阳性而用细胞刮子会造成细胞粘连成团，而影响检测可将胰酶消化后细胞的保存在含2%BSA的PBSΦ，防止进一步的损伤

5．因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同因此建议每次檢测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节

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