在研究结核病中,为什么要电转耻垢结核分枝杆菌rpob

复旦大学 博士学位论文 耐药结核結核分枝杆菌rpob的多维分析 姓名:乐军 申请学位级别:博士 专业:微生物学 指导教师:王洪海 复旦大学博士学位论文 耐药结核结核分枝杆菌rpob嘚多维分析 研究生 乐军 导师 王洪海 教授 复旦大学微生物学系 上海 摘 要 结核病仍然是威胁人类健康的主要杀手耐药结核结核分枝杆菌rpob数量嘚日益增 加和结核合并HIV感染是造成近年来结核病死灰复燃,卷土重来的主要原因我 国不仅是全球结核病的第二大重灾区,也是WHO确定耐多藥结核病的高发瘸率地 区研究结核结核分枝杆菌rpob耐药机制对于抗结核新药的开发和耐多药结核诊断试剂研 制具有重大的意义。 为了解中國耐多药结核杆菌的利福平耐药基因rpoB突变特征我们应用 DNA测序技术分析86株结核结核分枝杆菌rpob临床分离株ropB基因利福平抗药性决定区 resistance 域(rifampin determining 耐药分離株中的65个菌株中的rpoB基因的RRDR内发现22种不同类型突变,21 lo%耐药分离株末发现突变新发现RRDR内六个新的等位基因,以及RRDR外部 五个新的突变所囿分离菌株均不包含V175突变。其结果有助于发展耐多药结 核病快速分子诊断方法和确定我国的耐多药结核病高发热点地区从而采取有效 结核病控制策略。 DNA微阵列代表聚合酶链反应产物诊断测序发展方向由于高密度微阵列 价格昂贵,分析操作复杂和结果难予锵释、限制其臨床实验室垦广泛地运用。 我们试图建立一种中等的密度阵列方法可快速地鉴定结核结核分枝杆菌rpob利福平耐药 菌株。这种方法根据rpoB基因利福平抗药性决定区域内点突变及其他重排的检 ;}j{}和福平抗药性通过便荧光标记扩增遗传物质与微阵列杂交测定。研究检测 53株利福平耐藥结核分支杆菌和15株利福平敏感结核结核分枝杆菌rpob结果与药物敏 感性试验和DNA测序结果一致。PCR扩增仅仅1.5小时可硷出刹福平耐药临床分 离株寡核苷酸微微阵列是高效方法,可作为检测利福平抗药性的快速方法以弥 复旦大学博士学位论文 补标准培养物方法不足 我们首次应鼡高效液相色谱结合MALDI—MS质谱分析INH而@药和敏感菌株的 分泌蛋白的差异,通过DEAE亲和色谱去除培养基上清液牛血清白蛋白后从异烟 肼耐药结核杆菌培养上清液中鉴定一种特征性分泌蛋白,海藻糖磷酸磷酸酶 (Trehalose—phosphate 报道从结核结核分枝杆菌rpob的分泌蛋白发现存在TPP由于海藻糖是结核分枝杆菌rpob细胞壁的 结构完整性所必需的分子,涉及海藻糖糖脂生物合成酶TPP代表潜在抗结核药物 靶位在一般生物体内,TPP一般存在细胞胞浆中洏且TPP与异烟肼耐药相关。 从而为血清学水平上快速诊断异烟肼耐药结核病提供一种新的途径 为了鉴定异烟肼耐药结核结核分枝杆菌rpob特异嘚蛋白,我们应用双向电泳和 MALDI—MS质谱蛋白质组学技术比较分析2株异烟肼耐药结核结核分枝杆菌rpob,}112株敏感 结核结核分枝杆菌rpob发现异烟肼耐药結核结核分枝杆菌rpob有26个特征斑点,对其中6个蛋白

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