微生物农药研发与应用第一章总论也许你们不禁要问，什么是生物农药？ 生物农药是指含非人工合成、具有杀虫杀菌或抗病能力的生物活性物质或生物制剂，包括生物杀虫剂，杀菌 生物农药 剂，农用抗生素，生态农药等。现在也包含这些天然产物的一些简单衍生物，即化学修饰产物，如甲氨基阿维菌 素、乙烯利等。生物农药的准确提法应该是生物源农药，早期的天然农药、植物农药、微生物农药等都归在其中。 生物源农药包括植物源、动物源农药和微生物源。 微生物农药是指应用生物活体及其代谢产物制成的防治作物病害、虫害、杂草的制剂。也包括生物活体的保 微生物农药 护剂、辅助剂和增效剂以及模拟某些杀虫毒素和抗生素的工合成的制剂。利用微生物防治害虫最早可追溯到100 年前．俄国人梅契尼可夫利用绿僵菌防治金龟子幼虫，但直到本世纪50年代“以菌治虫”的研究和生产才得到迅 速发展。近30年，微生物农药在农药生产上已广泛应用，特别是在化学农药污染环境的问题日益突出的今天，微 生物农药的研究和生产更加受到重视。目前，微生物农药主要包括微生物杀虫剂、农用抗生素和微生物除草剂等。 微生物杀虫剂的种类很多，已发现的有2 000多种，主要包括细菌、放线菌、真菌、病毒、立克攻氏体、线虫 和原生动物等。目前，国内外研究、利用的主要是细菌、真菌和病毒。 第二章 病毒杀虫剂第一节病毒杀虫剂研究与开发的现状及前景病毒杀虫剂是利用昆虫病毒的生命活动来控制那些直接和间接对人类和环境造成危害的昆虫。 病毒杀虫剂 一、 昆虫病毒的基本特性 一个病毒粒子的基本结构 （核酸、衣壳蛋白、有的有囊膜） ，有些病毒粒子被包埋在由蛋白质晶体构成的包 涵体内，称为包涵体病毒 包涵体病毒，包涵体病毒的形态多样，有呈多角形，称为多角体（所含病毒粒子从1-1000）大小约 包涵体病毒 为1—1.5um；有呈椭圆形或圆形的，称为颗粒体（1或2个病毒粒子）大小约为0.1-0.5um。有包涵体的病毒，由于 其外层的结晶排列的蛋白质对外界不良环境的抵抗力强。 二、 昆虫病毒的分类 早期昆虫病毒的分类主要是依据病毒有无包涵体、包涵体的形态、病毒粒子的形态和结构，在寄主的何种组 织内发育等。 依据这些特点， 将昆虫病毒分为5类： ①核型多角体病毒， 多角体于细胞核内形成②质型多角体病毒， 多角体于细胞质内形成③颗粒体病毒，包涵体存在于细胞核或细胞质内④昆虫痘病毒⑤非包涵体病毒（P4） 三、 感染途径 1、取食感染；2、经皮肤感染 四、 病毒杀虫剂的生产工艺（以棉铃虫核型多角体病毒制剂为例） 1、 棉铃虫幼虫的饲养繁殖；2、以人工方法使棉铃虫幼虫感染病毒；3、收集多角体；4、加工配制一定剂型的制 剂。 五、 病毒杀虫剂的优点 1、 宿主特异性高，能杀灭害虫而不影响害虫的天敌； 2、 不会污染环境； 3、 后效作用明显； 4、 昆虫病毒制剂生产容易、使用方便、成本低廉、适于推广。 六、 病毒杀虫剂的缺点 1. 杀虫范围太窄 2. 生产困难 3. 作用速度较慢 七、 病毒杀虫剂在害虫防治上的应用1-

    微生物农药研发与应用我国至1990年已从188种昆虫中分离到220多株病毒，其中110株为我国首次分离获得．迄今，在世界各国至步 有6O多种病毒进人大田进行防治农林害虫的试验，3O多种病毒杀虫剂进行了登记、注册和生产应用．目前研究较 多、应用较广的是核型多角体病毒(NPV)、颗粒体病毒(GV)和质型多角体病毒(CPV)．我国迄今已有20种病毒进人 大田试验。如斜纹夜蛾NPV、油桐尺蠖NPV（又名大尺蠖，茶树的一种致病昆虫）、松毛虫CPV均属“七五中试生产 研究内容，棉铃虫NPV杀虫剂已进人批量生产，其他的如茶毛虫NPV、茶小卷叶蛾GV、草原毛虫NPV、茶蚕GV等相继 进人大田试验．由于病毒杀虫剂具有致病力强、专一性强、抗逆性强和生产简便等优点，发展前景十分广阔，但 也还存在着许多问题，如病毒的工业化生产还有困难，病毒多角体在紫外光及日光 下易失活等，这都需要进一步的研究并加以解决。 注：松毛虫培养在采用林间围栏的方式进行培养时，受地域、温度、季节等的因素而影响产量。 八、 现阶段，病毒杀虫剂的研究方向 1、 昆虫病毒蛋白质祖学和功能基因组学。 2、 昆虫病毒的进化生物学研究。 3、 昆虫杆状病毒表达载体系统研究。 4、 基因工程病毒杀虫剂的构建。 通过从基因方面入手，实现病毒杀虫剂的工业化生产，提高病毒杀虫剂的产量和作用效果。第二节核型多角体病毒(NPV)核型多角体病毒是昆虫病毒中最常见的一种。已知可感染7个目中284种昆虫。 （一） 核型多角体病毒的概述 一、 核型多角体病毒的一般形态 具有较大的包涵体，称为多角体，外观呈四、五、六角型、不规则型等。如粘虫病毒为六角型，家蚕病毒为 十二面体。依据所包埋的病毒粒子的多少，可将核型多角体病毒分为多核衣壳核型多角体病毒（MNPV）和单核 衣壳核型多角体病毒（Ac MNPV） 。 核型多角体的直径为0.5—15um，病毒粒子的直径为20—70nm，长约200—400nm。粒子呈杆状，核心为双股 DNA。 二、 核型多角体病毒的理化性质 核型多角体病毒的主要成分是蛋白质，不同种的多角体所含氨基酸组分基本一致，核型多角体对于不同的化 学药剂具有相当高的抵抗力，不溶于水及多种有机溶剂（如乙醇、丙酮、乙醚等） ，不为细菌或细胞蛋白酶所分解， 但若以强酸或强碱溶液处理则会溶。多角体若被食入易感虫体内，能在中肠内碱性肠液中溶解并释放出粒子。 三、 昆虫感染核型多角体病毒后的表型 昆虫感染核型多角体病毒后，食欲减退、行动迟缓、躯体变软、组织液化，有些昆虫会爬往枝头，所以又称 为“梢头病”“树顶病” 、 。死后虫体腹足紧握枝头或枝叶，虫体下垂，倒挂枝条上，死虫皮肤脆弱，极易破裂，流 出白色或褐色稀糊状液体。 （二） 杀虫机理（自学或同学讲解） 病毒杀虫剂的机理在于利用其天然存在的致病性。 （三） 核型多角体病毒的改造 由于野生型病毒普遍存在杀虫速度慢、效力不高等缺陷，很难进行工业化生产。随着基因工程技术的发展， 人们开始尝试对野生型病毒进行各种改造，以构建性能优良的重组病毒杀虫剂。 1、 缺失核型多角体病毒非必需基因以增加杀虫效果 2、 插入昆虫自身存在和产生的激素和酶的基因以提高杀虫速度 3、 插入昆虫毒素基因和细菌毒素基因以提高杀虫速度2-

    微生物农药研发与应用4、 插入植物来源基因以提高杀虫速度 5、 修饰病毒本身基因以扩大杀虫谱第三节质型多角体病毒（CPV）质型多角体病毒也是包涵体病毒，这和核型多角体病毒一样，但它所含的核酸为RNA。质型多角体病毒可感 染的昆虫种类仅次于NPV，我国已发现的有家蚕和赤松毛虫，马尾松毛虫质型多角体病毒。 （一） 质型多角体病毒的概述 一、 质型多角体病毒的一般形态 质型多角体外观呈四、五、六角型、不规则型等。质型多角体的直径约为0.5—25um，因病毒种类、感染时间 长短、在细胞中形成的数量等而有很大的差异。一个多角体可包埋1—1000个病毒粒子。病毒粒子为正二十面体， 表面有由四节管组成的突起。病毒粒子的大小在60—70nm之间。 二、 质型多角体病毒的理化性质 质型多角体病毒不像核型多角体那样稳定，质型多角体虽不溶于水，但在水中经较长时间可被溶解。在碱液 中的溶解度比核型多角体病毒的溶解度小， 如以稀碳酸钠也处理能失去病毒粒子， 留下不溶解的多角体呈多孔状。 如溶解后，不像NPV那样留下膜。质型多角体也由蛋白质构成，除此之外还含有3%左右的硅。 三、 昆虫感染质型多角体病毒后的表型 昆虫感染核型多角体病毒后，表现活跃，急躁，肠道硬化、肿大并呈乳白色，大便石灰色。死后不倒挂，体 型缩小，头、胸、腹不呈正常比例，皮肤完好，不液化。 四、 质型多角体病毒的潜育期 核型多角体病毒的潜育期一般在5-7天，而质型多角体病毒的潜育期一般是7-20天，比NPV长得多。但对两种 病毒来说，潜育期长短的影响因素却是相同的，一般都与昆虫的种类、昆虫的发育阶段、病毒毒力、病毒数量、 和环境温度等条件有很大的关系。 五、 （二） 质型多角体病毒的研发与应用 对质型多角体病毒的最初研究，我国是从家蚕的病害研究开始，现以从30种昆虫中发现了质型多角体病毒， 如马尾松CPV、棉铃虫CPV等。我国利用质型多角体病毒防治害虫取得了较好的效果，如山东利用赤松毛虫CPV 大面积防治赤松毛虫， 广东和云南等地分别利用马尾松CPV和文山松毛虫CPV来防治松毛虫都取得了满意的效果。 在生产上采用直接感染宿主昆虫增殖病毒，最简便的方法是在病虫害大面积发生时将病毒喷洒在植物上，然 后收集病死虫。中科院武汉病毒所彭辉银等人成功研究“生物导弹”新技术，防治松毛虫获得可喜的成绩。第四节颗粒体病毒(GV）自从1926年法国的Paillot发现昆虫颗粒体病毒以来，至今至少有684种昆虫被描述患有颗粒体病毒病，我国已 发现有颗粒体病毒的昆虫寄主有黄地老虎、小菜蛾、菜粉蝶等。GV的感染途径和传播方式是昆虫病毒学研究的主 要内容之一，经卵传递、感病成虫的飞迁移，寄生蜂和捕食昆虫，以及食虫鸟类的传播；GV的离体传代一直是一 件困难的工作。起初，人们试图从颗粒体病毒复制的组织器官中去筛选具有感染性的细胞系，未成功。经过长期 探索较多成功的体外复制离体系统大多是在胚胎来源的细胞中建立的。 （一） 颗粒体病毒的概述 一、 颗粒体病毒的一般形态 颗粒体呈椭圆形，表面和边沿不甚整齐，中部稍凹陷，略弯曲，其大小为330～500×200－290nm。颗粒体包 含着一个杆状病毒粒子,大小为200－290×45－55nm。3-

    微生物农药研发与应用二、 颗粒体病毒的理化性质 不溶于水及多种有机溶剂（如乙醇、丙酮、乙醚等） ，遇强酸或强碱，包涵体会迅速溶解，并可使病毒粒子变 性而失去侵染力。完整的颗粒体病毒在70-75℃间能存活10min，高温条件、紫外或其他辐射线的照射也能使完整 的病毒失活。低温、干燥状态下对未提纯的颗粒体病毒保存4年以上仍有感染力。 （二） 颗粒体病毒的侵染后的表型 感染病虫的鳞翅目幼虫食欲不振、行动迟缓、体节肿胀，虫体腹面逐渐变色呈苍白色或乳黄色，这是由于在 脂肪体中产生了大量的病毒颗粒所致；皮肤上常见斑点，体色变为黄绿色，体壁常常变软或内含物液化，死虫表 皮脆软易破，流出乳黄色乳状液；死虫死时倒挂树枝，呈“八字”型，后期体色变黑。 （三） 颗粒体病毒的增效蛋白（En） 1、 颗粒体病毒增效蛋白的发现 美洲黏虫颗粒体病毒 美洲黏虫核型多角体病毒 1959年，Tanada 实验 活体 失活 致死率提高 活体 失活 对毒性无影响致死率提高 人们将在美洲黏虫颗粒体病毒中鉴定并纯化出一种蛋白质，并将这种蛋白质命名为增效蛋白 增效蛋白。 增效蛋白 2、 颗粒体病毒增效蛋白的相关性质 到目前为止，已通过活性生物测定发现了11种病毒中存在增效蛋白成分，这些蛋白均为糖蛋白，大小范围在 38-126ku，它们均为酸性氨基酸，并且均含有金属蛋白酶-锌结合域。所有的增效蛋白之间的空间结构比较相似。 3、 颗粒体病毒增效蛋白的作用机理 关于颗粒体病毒增效蛋白的增效机理，学术界有几种观点，现在比较认同的观点是认为颗粒体病毒增效蛋白 是破坏围食膜的一种蛋白水解酶。 围食膜是无脊椎动物所特有的一种半透性膜状结构，昆虫的围食膜是由中肠细胞分泌形成的，根据分泌细胞 在中肠所处的位置,可将围食膜分为Ⅰ型和Ⅱ型.由于围食膜紧贴中肠内壁,包裹着食物,因此具有保护中肠上皮细胞 和有助于食物消化吸收的功能。围食膜主要是由几丁质和蛋白组装而成，其中的黏蛋白IIM（通过二S键与围食膜 几丁质网状基质紧密相连）是颗粒体病毒增效蛋白的作用底物。由于增效蛋白能够降解黏蛋白IIM，增加了围食 膜的通透性，使病毒粒子更容易通过围食膜，从而提高了病毒的治病率。 4、 增效蛋白基因工程研究 今年来，人们致力于构建含有增效蛋白的重组型颗粒体病毒 ，可以有效提高杀虫效率。在构建工程菌的过程 中，出现多种问题：如，加入增效蛋白基因后，重组病毒的形成数目大为减少，且形态也减小。经过工作者的努 力，得到了既加入了增效蛋白基因又能形成正常病毒的重组体。除此之外，人们还将增效蛋白基因加入到一些工 程菌中，得到产增效蛋白的工程菌，或将增效蛋白的基因片段插入到植物基因中，得到转基因植物。 （四） 颗粒体病毒的应用 颗粒体病毒的应用不及NPV广泛，主要用于防治菜青虫、小菜蛾、及黄地老虎等。近年来，运用颗粒体病毒 来防治虫害的效果显著。如北京林业科学院生物防治研究所经过多年研究，批量生产了杨扇舟蛾颗粒体病毒，该 病毒对3龄以上的杨扇舟蛾幼虫治病力很高，从而控制了杨扇舟蛾害虫大面积发生；另外，中国新疆农业科学院微 生物研究所对黄地老虎颗粒体病毒进行了20年的研究，发现使 黄地老虎高频率死亡的颗粒体病毒。 除了单一的利用某一种颗粒体病毒来防治害虫之外，人们还将它与其它农药或多角体病毒复合使用以增加防4-

    微生物农药研发与应用治效果，如新疆一农科所就运用多种病毒混用来防治病害，大面积实验证明，对棉花、番茄、辣椒、豆类等作物 使用后棉铃虫等鳞翅目害虫的危害率控制在5%以下，经济效果显著。 第三章 细菌杀虫剂第一节 细菌杀虫剂的研究开发现状及应用前景 细菌杀虫剂(Bacterial inseeticide)是利用对某些昆虫有致病或致死作用的杀虫细菌所含有的活性成分或菌体本 身制成的，用于防治和杀死目标昆虫的生物杀虫制剂。杀虫细菌主要来自芽孢杆菌科(Bacteriaceae)、假单孢菌科 (Pseudomon． adaceae)、肠杆菌科(Enterobacterlaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)和微球菌科 (Micrococcaeeae)等细菌类群。 与其它类型的杀虫剂比较，细菌杀虫剂有独特的作用方式和杀虫机理：通过营养体、芽孢在虫体内的繁殖以 及通过产生生物活性蛋白毒素等途径来致死目标昆虫。另外，细菌杀虫剂还有如下一些特点：具有一定的特异性 及选择性的杀虫作用，对人、畜及非目标昆虫安全；由于杀虫活性蛋白的多样性，昆虫产生抗性较缓慢；通过发 酵法生产，具相对较低的生产成本及产品登记费用；可通过生物技术途径筛选或构建综合优良性能的菌株，从而 不断改善产品的性能。由于具有以上特点，细菌杀虫剂自问世以来发展较快，已成为生物农药家族中的主导产品。 全世界已商品化的生物农药约有30多种，到90年代初的销售额约1．2亿美元，其中细菌杀虫剂占90％以上。目前 细菌杀虫剂已发展成有一定规模的产业，全世界约有30多个国家的100多家公司共生产约150多个品种的细菌杀虫 剂，已逐渐应用于蔬菜、林业、园艺、卫生害虫及农业等领域的害虫防治中。 目前，对细菌杀虫剂的研究利用主要集中在几个方面：1、筛选自然界新的杀虫细菌菌株，以寻找更多、更新 的杀虫资源；2、应用分子生物学原理和技术，构建杀虫谱更广、毒力更强的生防菌株；3、将杀虫基因转入到多 种作物体内，形成抗虫的转基因作物。 应用细菌杀虫剂防治害虫虽然取得了一定的成功，但目前在世界杀虫剂市场中以苏云金芽孢杆菌杀虫剂为主 的整个细菌杀虫剂的销售份额仅占极小的比例，不足1%，且在应用上主要局限在棉花、蔬菜、水果以及林业等领 域的虫害防治，而在其他农作物上的使用较少。这主要是由于目前细菌杀虫剂产品还存在一些不足之处，如：杀 虫谱较窄，不能对在作物内部取食的害虫起作用，在水域作用效果差；在阳光照射等环境因素的影响下，杀虫活 性成分的有效期短；在土壤其他微生物的作用下容易失效等。这些方面客观上影响了细菌杀虫剂的应用范围和使 用效果，同时也为细菌杀虫剂今后的改进方面提供了方向。 已知的杀虫细菌约有100多种，但被研制出产品并投入使用的主要是其中的4种，即苏云金芽孢杆菌(Bacillus 们一般要在昆虫寄生体内才能生长并形成有侵袭力的芽孢。另外，也有少数其它芽孢杆菌及个别无芽孢的细菌发 展成产品。 第二节 苏云金芽孢杆菌一、发展历史 1、 世界发展历史 时间（年） 事件 石渡发现家蚕猝倒病 德国人 Berliner 命名5-

的共同研究下，成就了今天苏云金芽孢杆菌研究的“繁荣” ，关于研究苏云金芽孢杆菌方面文章的发表全世界是数 以万计。 2、 中国发展历史 蒲蛰龙教授是 蒲蛰龙 中山大学第一位中 国科学院院士（前 称科学院学部委 张履鸿（苏）刘崇乐（福建）捷克引进-玉米螟 员） 是我国著名的 ， 彭中允（苏） 昆虫学家，对我国 武汉、长沙生产（中国 Bt 城） 的生物科学和生态 “七五”公关、火炬、技改 农业，特别是害虫 生物防治、综合防治，为农田环境的改善和农业持续发展树立典范，誉称为中国生物防治之父，为生物科学技术 的发展做出了重要的贡献。刘崇乐 《中国苏云金杆菌的五十年》 ； 刘崇乐 3、 杀虫谱发展史 时间（年） 80s 对象 鳞翅目 （蝶、蛾） 双翅目（蚊子） 鞘翅目（甲壳虫） 、线虫 螨虫、原生动物 肿瘤癌细胞 随着深入的研 究，发现了Bt的广 泛运用。 二、形态特征及生 理生化 时间（年） 1941 解放初 61 事件 蒲蛰龙 菜青虫 孟雨 法国 曹骥 法国商品分离、Lab 杀虫1、 形态特征(P26) 周生鞭毛（无） +、H 抗原、O 抗原 、G 芽孢：石炭酸复红、孔雀绿（菌株保存方式） 芽晶：芽孢抗逆， 、晶体形态有菱形、圆形、方形、椭圆形、不规则形，有一个（几个） 毒素（能杀虫） 、无毒（能抗癌） 。 2、 生理生化 菌株对营养物质的要求不高，一般农业上的废弃物或普通的碳氮源都可用来作为培养基的组分，这使得发酵 生产的成本可有所降低。 碳源：葡萄糖、蔗糖、淀粉、糊精等； N 源：牛肉膏、蛋白胨、花生粉、玉米浆、鱼粉等； 无机盐：K2HPO4、MgSO4、CaCO3；主要元素有磷、硫、镁、铁、钾、钠、钙、微量元素有锌、硅、铁所需很少，6-

    微生物农药研发与应用水杂质即可满足需求，多了反而成为毒素。 温度：10-40℃，27-32℃适宜，35-40℃生长很快，但易衰老，温度太低则生长缓慢。 pH：最适值 7.5；≥8.5 或＜5 时，不能形成芽孢， O2：好 O2 紫外线、抗生素及化学物（放线菌素 D、氯霉素、红霉素、乳化剂）对菌株都有抑制作用，这些都与普通细菌的 特征相似。 三、生物活性物质 1、 作用机制 1) 内毒素的作用机理 其毒素的作用一般通过毒害胃肠组织，因此，必须由敏感昆虫通过吞食苏云金芽孢杆菌的晶体毒素和芽孢后 才能生效。它们感染的主要途径是：从口腔经食道、嗉囊而至中肠；破坏中肠后，细菌侵入体腔，使血液pH发生 变化；菌体进一步繁殖后就引起幼虫败血症及全身瘫痪而致死亡。 以ICP为例： ①感染型昆虫幼虫摄入孢子和ICP ②ICP在碱性中肠中解离 ③ICP被蛋白酶活化 ④活化了的ICP和C-端区域与中肠细胞膜的专化受体不可逆结合 ⑤活化的毒素的N-端区域插入到细胞膜中，肠膜中形成孔道，接下来上皮破坏，消化系统瘫痪 ⑥孢子萌发，虫体患败血病 ⑦幼虫因饥饿或败血病死亡 2) 外毒素的作用机理 外毒素（是RNA聚合酶的抑制剂，在各个生化过程中与ATP起竞争作用）的毒性比内毒素要低，而且它的作 用仅在昆虫蜕或变态是可以明显看到，这种毒素可杀死多种昆虫或使昆虫的幼虫发育不正常，虫体的某些部分发 育残缺不全等。据推理，外毒素的杀虫机理可能是通过它对昆虫体内DNA的合成，从而影响昆虫的生长发育，使 其不能蜕皮或羽化，造成昆虫的畸形或死亡。 2、 活性因子（P27） 胞外因子：几丁质酶、磷酸酯酶C、溶血素、VIP杀虫蛋白、双效菌素、苏云金素。 胞内因子：杀虫晶体蛋白、免疫抑制因子A、肠毒素，活芽孢。 1) 几丁质酶 几丁质酶是最早从苏云金芽孢杆菌中发现的可溶性胞外蛋白类杀虫活性物质。几丁质酶单独作用时对昆虫的 杀毒活力并不高，与晶体蛋白结合，降低昆虫中肠细胞对杀虫晶体蛋白的抵抗力，然后杀虫晶体蛋白进一步作用 形成中肠膜穿孔，从而导致昆虫的死亡。 2) 磷酸酯酶C 磷酸酯酶C对昆虫肠道均有破坏作用，有助于细菌侵入血腔并繁殖。但对人体和动物细胞有一定的杀伤作用， 因此限定了磷酸酯酶C的杀虫应用价值。 3) VIP杀虫蛋白（从对数期开始分泌，直到稳定前期达到最高峰） 是种广谱杀虫剂，它通过与敏感昆虫中肠上皮细胞受体结合，是中肠溃烂而产生昆虫致死现象。 4) 杀虫晶体蛋白（ICP） ICP是苏云金芽孢杆菌制剂的主要杀虫活性成分，又叫δ—内毒素或伴胞晶体，它的基因大多数位于质粒上， 少数存在与染色体上，一个质粒常常携带一个到多个ICP基因。自从1981年Schnepf克隆第一个ICP基因以来，新杀 虫剂晶体蛋白基因不断地被发现、克隆并得到应用。截止到2006年，这些基因按核苷酸序列的同源性已被分为53 类，373种，其中cry基因349种；cyt基因24种。这些基因的命名规则为：分别用阿拉伯数字、大写英文字母、小 写英文字母和阿拉伯数字来表示，并在前面加上cry后均为斜体书写，如：cry1Ac10 。现有的ICP对鳞翅目、双翅7-

    微生物农药研发与应用目、鞘翅目等10个目的节肢动物门昆虫具有不同程度的生物活性； 5) 芽孢 芽孢是苏云金芽孢杆菌生长到一定阶段形成的特殊的休眠体结构，芽孢的外层芽孢衣富含二硫键，可抵抗溶 菌酶的消化，起保护作用。已发现对鳞翅目幼虫有毒性的芽孢类型有活芽孢、死芽孢、芽孢衣和芽孢外套。单独 的芽孢毒力很低，需要有杀虫剂体蛋白协同作用 3、 活性谱 苏云金芽孢杆菌的杀虫活性谱非常广，现已发现至少有节肢动物门10个目和原生动物门、扁形动物门、线形 动物门等有害生物具有毒杀活性。杀蚊子基因：cry4A、cry4B、cylLA，这些是77年以后发现的一系列杀蚊子的基 因；杀线虫和原虫基因：cry5、cry6、cry7、 cry8，目前中国的南开大学从800多株菌中发现了8株株菌有杀线虫 活性，特别是对松、蚕的线虫很有效；因此，这成为我国未来的研究课题；很多的基因运用于转基因植物，并且 相当的成功。抗虫棉，中国是即美国以后第二个具有知识产权的产抗虫棉国家，我们将基因转到棉花上，通过棉 花杀死棉铃虫，从而使原来由于棉铃虫而引起的经济损失大大减少；除此之外，Bt抗虫基因还被转基因到玉米、 林业等植物基因中，从而起到防治害虫的作用。 四、分类鉴定及命名 1、 鉴定及分类 ① 生理生化：碳源、氮源、酶、代谢物（共23个指标） ② 酯酶电泳（看电泳图谱） ③ H抗原 ④ PCR 前三种是20年前的方法，前两种缺陷：不同亚种的生理生化指标可能是相同的，而同一亚种的反而不同，这 造成了一个假象。 PCR技术的发明人一般公认为是Mullis,他也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。PCR是体外酶促合成特异 DNA片段的方法，主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成： 即在高温（95℃）下， 待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～55℃）情况下，两条人工合成的寡核苷 酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点， 以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退 火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一 次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形 式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。 鉴定从形态、生理生化指标、免疫学、分子生物学等方面进行。 五、菌种选育 （1） 高毒力 （2） 良好的发酵和生产性能（产量高、耗能低） （3） 对原材料的要求 （4） 生产稳定性 （5） 退化 手段：现有菌株 育种技术8-

    微生物农药研发与应用六、生产 1、 液体深层发酵 1) 生产工艺流程液体深层发酵工艺流程砂土管菌斜面种子罐 无菌空气 培养基发酵液含晶体及芽孢 的浓缩液体 展着剂、粘 着剂、防腐剂 乳剂 液剂填充罐加轻质碳酸钙板框过滤弃去滤液滤饼烘干粉碎调浆罐粉剂菌浆加展着剂 喷雾干燥可湿性粉剂 工艺条件 砂土管菌种2) a.9-

    微生物农药研发与应用茄瓶斜面菌种 将砂土管内的菌种移接到牛肉膏蛋白胨培养基的茄瓶斜面上，在 28℃—30℃中培养 2—3 天，使芽孢从休眠状 态活化，并取得制备种子用的菌体。 茄瓶斜面菌种必须保证纯度，经涂片镜检，有 95%以上的菌体的芽孢和晶体已脱落，且形态正常。 c. 种子罐培养 接种与培养：在无菌条件下，将 30mL 无菌水加入茄瓶斜面菌种中，制成菌悬液，再将菌悬液转入灭菌的血清 瓶。在酒精灯火焰下，以减压接种法将血清瓶悬液吸入种子灌，然后进行发酵。经 6—8h，营养体生长至对数期， 检查无菌即为合格种子。 d. 发酵罐培养 发酵罐培养是细菌大量繁殖并形成晶体和芽孢的阶段， 种子质量、 发酵培养基成分和发酵条件是影响这阶段产 量的重量因素。 发酵条件及管理：培养温度控制在 30±1℃,整个发酵过程应定时取样检查，测定糖、碳、氮、磷的含量和 pH 值，若有过高过低现象，须采取补料等措施加以调整。培养 20—22h，经检查无杂菌，有 80%—90%的菌体明显 形成芽孢和晶体，其中有 8%—10%左右的芽孢和晶体已脱落，即可放出发酵液。 e. 发酵液的后处理 培养好的发酵液，可根据成品剂型采用不同的方法进行处理。例如，成品为粉剂或可湿性粉剂，则发酵液可按 其体积加 8%—10%的填充剂（轻质碳酸钙） ，混匀后经板框过滤获得滤饼。滤饼经烘干粉碎即为粉剂；若将粉饼 调浆后加入展着剂，通过喷雾干燥成为可湿性粉剂。如果成品为液剂或乳剂则将发酵液经离心或真空减压浓缩后 加入乳化剂，即为乳剂；加入一定量的展着剂、粘着剂、和防腐剂，就成为液剂。 2、 半固体发酵 1) 生产工艺流程 砂土管菌种 斜面菌种 液体种子扩大培养 半固体浅盘发酵 干燥 粉碎包装 2) 工艺条件 a. 种子扩大培养 在无菌操作条件下， 每支斜面菌种加入 3—5mL 无菌水， 用接种环把菌苔刮下制成菌悬液， 接入种子培养液内， 每瓶约接种菌悬液 1mL。在 28℃—30℃连续振荡培养 6—8h。 b. 半固体浅盘发酵—“压力脉动固态发酵反应器” 接种前，两手及可能接触到培养基的用具均需用 75%酒精或 2%漂白粉水洗消毒。接种时，将生长正常的种子 液按培养料干重的 20%—50%均匀地倒入培养料中充分拌匀，平铺在浅木盘上，料厚约 1.5—3cm，上覆一层灭菌 的纱布或湿报纸，以减少水分散失。 发酵初期，室温应保持 28℃—30℃，培养 10—20h 后，料温可上升达 37℃以上，菌量也大量的提高。此时， 应降低室温或翻拌培养物以加速品温下降，使品温控制在 32℃以内。36h 后，含菌量已不再明显增长，芽孢也已 逐步形成，这时可将培养料搅拌翻动 1—2 次，并适当提高室温以促进菌体迅速老熟。一般经 2—3d，大部分菌体 已形成芽孢囊，并有 20%左右的芽孢、晶体脱落时，即可终止培养。一般具有豆鼓气味。如有酸馊或臭味、或变 稀等现象，则产品已严重污染或完全失败。正常产品镜检时，可见大部分菌体为芽孢囊及脱落的芽孢和晶体。营 养体较少，无杂菌或只有少量杂菌。 c. 干燥和包装 培养好的半固体培养物，除即时使用外，必须迅速进行干燥处理，可在不高于 60℃的烘房内通气干燥，也可 用无色塑料薄膜架空遮盖，在干燥后产品含水量应在 5%以下。粉碎后装入塑料袋或其它防潮的容器内，置阴凉 干燥处保存备用。合格的成品一般每克应含有 50—100 亿活芽孢。 3、 生产中存在的问题 （1） 噬菌体的危害 在杀虫细菌生产过程中，噬菌体的侵染是影响产品的主要问题之一。往往使工业生产连续倒罐，有时甚至被迫 b.10 -

    微生物农药研发与应用停产。在发酵罐中，噬菌体的感染一般在细菌生长对数期表现最为突出，此时会出现 pH 上升，温度增高，镜检 有长形菌体，且有畸形状如中部膨大或局部出现缺刻等。2—3h 后，菌数骤降，甚至全部自溶。如做菌落培养则 可在培养皿中出现呈透明的圆形或针点状的噬菌体斑。 噬菌体来源：一、菌种本身原来就有；二、来自生产环境设备安装不合理 措施：一是纯化菌种，二是加强卫生管理，三是选育抗噬菌体的菌株 （2） 产品的标准化 毒力测定无统一标准，产品的质量不稳定，这给实验研究和防治实践都带来一些困难，甚至影响到进一步的推 广应用。 毒力测定方法 a) 生物测定法（国际标准法） 以敏感昆虫为试虫，同时测定供试样品和标准样品对昆虫的 LC50 值，并计算待测样品的毒力效价。 试虫、地域差别、生测不同 鳞翅目：混合饲食法、浸液喂法 鞘翅目：无统一方法 缺点：耗时长、费用大、受昆虫的虫龄、环境条件影响。 b) HPLC 法 先用蛋白酶解晶体，酶解后的片段用 HPLC 分析，制成肽图 c) 免疫分析法 利用抗原与抗体之间高特异性反应实现对抗体、抗原或相关物质进行检测的分析方法（缺点是其测得的 是半孢晶体的数量，而不是实际杀虫效力，并不能区别有无毒性的半孢晶体。 ） d) 质谱分析法 e) 电泳法 （3） 提高菌剂质量和降低成本问题 当前的生产工艺水平总体偏低，表现在产品质量不稳定，原料来源、生产效率和产品贮藏也都有问题，这使得 这类杀虫剂的推广应用受到影响。 七、应用 分子生物学 a) 基因鉴定（cry） b) 克隆、表达（研究结构基因组学和功能基因组学之间的关系） c) 构建工程菌（是解决单一Bt的杀虫不过关问题，把不同的Bt基因组合在一块，甚至把其它细菌的基因也 组合进去，细胞工程、基因工程） d) 转基因植物（烟草、水稻） 杀虫工程菌的构建 基因在土壤中不稳定，难防治土壤病害，并且寿命短，需重复使用 荧光假单孢菌：植物根圈和土壤中常见的有益细菌，对环境适应性强、同植物亲和性好，对人畜安全，不少菌 株还防病增产。 杆状病毒：将 Bt 与杆状病毒重组，能够解决杆状病毒杀虫慢的特性，并且能够利用杆状病毒的垂直传播的特性。 （武汉大学和中山大学研究这方面） 蓝细菌：Bt 在野外杀蚊子的效果不如实验室，人们一般是将药物直接加入水体中，由于 Bt 的比重比水大，会沉 入水底，从而降低效率。而蓝细菌是生活在水面，并且，蚊子幼虫很喜欢吃蓝细菌，提高药效，如今很多国家都 在做这方面的研究。 面临的问题11 -

    微生物农药研发与应用1、 工程植物的安全性 1) Bt 杀虫晶体蛋白的抗虫谱较窄，而限制了其抗虫基因工程中的应用，虽然已分离到众多的 Bt 毒蛋白基因， 其抗虫谱几乎覆盖了所有的鳞翅目害虫，但具体而言，每一种 Bt 毒蛋白基因的抗虫谱却十分有限，或只对某个种 或某些种有抗性。 2) 由于转基因植物给昆虫提供了—个连续恒定的选择压，使昆虫在群体水平上产生了耐药性。Van montage 博 士指出：“转 Bt 毒蛋白基因植物如欲取得实用价值，则必须解决害虫易对其产生耐药性的问题”。 转 Bt 毒蛋白基因植物注： a) 取食时间明显缩短，爬行、静息时间明显延长 b) 3 龄幼虫后期对转 Bt 基因棉花组织的选择顺序和特点不同于对无毒植株的选择（通常的顺序是 叶—蕾—花 瓣—幼铃；转基因的顺序是 蕾—花瓣—幼铃—叶 c) 在较低剂量下，对棉铃虫初孵幼虫产生很强的拒食作用 d) 对棉铃虫 1 龄幼虫的生长抑制及死亡率明显大于 2 龄、3 龄 3) Bt 毒蛋白基因在植物体内的沉默与甲基化、转基因的拷贝数、插入受体植物位点及转基因是否与受体植物中 有同源基因等有关。使其表达水平低。 4) Bt 毒蛋白可能成为转 Bt 毒蛋白基因植物最严重的生态危机。这方面的研究已成为热点，有关转基因植物对 生态环境和食物安全性的影响已进行了不少研究， 积累了一大批有价值的资料。 但目前已商品化的转 Bt 杀虫晶体 蛋白基因植物对生态环境产生危险性还末见报道。 5) 不少文献报道了转基因植物会产生一系列性状变异。吴刚等研究发现，转 cryⅠA(b)，cryⅠA(c)Bt 毒蛋白基 因的水稻株系在株高、穗长、单粒重、面粒重和结实率等方面都显著降低，而单株有效分数增多，生育进程推迟， 落粒性增强。所以, 选择优质表型且具较强杀虫作用的转基因植物，对于创造优良性状的抗虫植物至关重要。 2、 基因的定位表达（如植物，我们希望它在叶片表达，而其在根部表达） 3、 昆虫的抗性 注昆虫产生抗性的机理： a) Bt 毒素的溶解性： 原毒素晶状体的不完全溶解或转基因作物表达产生的一些不溶解的毒素的混合物 b) 毒素与细胞膜上受体的结合（Bt 的受体氨基肽酶 N 特异性结合） 竞争性抑制作用 一级结构的改变 二级结构的饰变 c) 细胞膜上孔洞的形成 形成受阻及孔洞的阻塞 d) 中肠上皮的缺失修复作用 针对毒素剂量较低或转基因作物中毒素的表达量较低 e) 行为机理 停食反应（实夜蛾属昆虫的幼虫能区分含有毒素的饲料） 4、 施用时的缺点 注： a) Bt 是一种胃毒剂，害虫吃了才有效，因此施药时要喷洒均匀 b) 只对植物体表的未成年阶段有效，因而对钻蛀到植物体内的昆虫没有什么效果 c) 缺乏传播扩散工具，只能象化学药剂一样施用 d) 不会引发害虫流行病，除非在封闭的或拥挤的环境中如蜂巢、养虫室或储粮箱内 e) 药效短，施药比化学药剂频繁，光照下易分解，大多数剂型在叶面的效果不到一周，有的菌系药效期不到一 天。 f) 专化性强，当几种害虫同时发生时对不感染性害虫不能兼治12 -

    微生物农药研发与应用g) 储藏期短，要在干冷、无阳光直射的环境中储藏时间最长 第四章 真菌杀虫剂 第一节 总论 真菌杀虫剂的两个优点：①许多分离菌具有较宽的寄主范围②通过角质层侵染来感染寄主。 1、 杀虫真菌制剂 美国环保署批准 EcoScience 绿僵菌产品 Bio-Path、Bio-Blast 用于防治蟑螂、白蚁 2、 植病生防真菌制剂 欧美多家公司已经登记注册了 Rootshield 等 9 种导致植物病害的木霉生物防治制剂。 3、 真菌除草剂 像 Casst（美国）等产品可用于防治旱地杂草。ABG5003（美国）和轮枝菌可用于防治水花生等外来杂草。 一、 真菌农药的发展趋势 真菌农药在植物病虫草害的持续控制中具有巨大潜力，近年来对这方面的研究已成为生防制剂研究的热点。 1、 高效菌株选育 研究真菌的杀虫抑菌机理，研究真菌侵染治病的相关功能基因，有目的地进行菌株选育和改造，不断培育高 毒力、高生产力、适合各种不同对象、不同环境使用的优良生防菌株。 2、 发酵生产工艺的改进 3、 农药制剂的研究 真菌生防制剂应用范围受到限制的一个重要影响因素是真菌制剂作用慢、效果不够稳定、产品货架期短，剂 型优化研究可以在很大程度上改进或克服这些缺陷。例如，添加抗紫外线剂、稳定剂、等助剂 第二节 绿僵菌 绿僵菌是最早用于防治害虫的一种有效的杀虫真菌，利用它来防治害虫的研究与实践已愈百年。 从防治规模看，绿僵菌已发展成为仅次于白僵菌的真菌杀虫剂。 一、 绿僵菌的分类及特性 绿僵菌属目前国际上被广泛接受的分类观点是 Tulloch 建立的，将该属分为 3 个种，分别是①金龟子绿僵菌 ②白色绿僵菌③黄绿绿僵菌。绿僵菌在分类地位上与青霉属很相近，在马铃薯培养基上发育良好，先形成白色菌 落，2—3d 后菌丝分枝互相交织，形成分生孢子梗，孢子梗上着生着青霉菌状的成串分生孢子，分生孢子初为白 色，慢慢到成熟时即绿色或暗绿色。分生孢子大小变异较大，但一般为 5—7×2—3μm 左右。 绿僵菌发育的最适温度约 24—26℃之间，在 10—30℃之间仍可正常发育，分生孢子一般在 60℃左右即能丧 失发芽能力。此菌在 pH4.7—10 之间可以正常发育，但最适 pH6.7—7.4。虽然绿僵菌可以在无极培养基上生长， 但培养基中含有机氮比含无机氮源对它的生长更为适宜；绿僵菌对碳源则无特殊要求。在干燥情况下绿僵菌的分 生孢子可以保存 3 年以上。 二、 绿僵菌致病机理与杀虫毒力 1、 入侵机理（①粘附—有两种力，一为非特异性的静电力：与孢子、寄主表皮电荷有关，由于表皮部位所带电 荷不同，故孢子只在表皮的某些部位粘附；另一为特异性的联结键②孢子萌发③穿透虫体④体内发育和致死） 通常，绿僵菌的分生孢子首先附着于寄主体表。绿僵菌孢子是疏水性的干燥孢子，其表面被几层交织在一起 的疏水物质所覆盖。静电力促使孢子与寄主表皮开始接触，通过外源凝集素进行特异性位点识别作用。另外，病 菌孢子常常从昆虫的口器、节间膜褶皱或气门等柔软高湿部位直接侵入，这些高湿部位都可以促进孢子萌发，软 化表皮易于被分生孢子的侵入结构降解并穿透。 分生孢子附着在寄主昆虫的表面是侵染过程的第一步，入侵的整个过程还需一些特殊结构以及分泌各种相应 的酶。13 -

    微生物农药研发与应用a.附着胞 绿僵菌分生孢子附着在寄主表皮上萌发后形成芽管，芽管在穿透表皮前先分化形成附着胞，附着胞（内含大 量的线粒体、高尔基体、内质网和核糖体，附着胞代谢活动旺盛，可使菌体在寄主表皮上一个小的范围内集中机 械和溶解能量，以利于菌体的入侵）经过一段时间的膨大后就会形成与感染密切相关的结构—侵染钉，体壁的穿 透便可发生。 b. 酶 昆虫表皮是一层结构致密的防御屏障，成分主要为几丁质和蛋白质。几丁质构成了昆虫表皮的骨架，蛋白质 镶嵌和覆盖在几丁质骨架上，将几丁质包裹起来。因此，绿僵菌在产生侵染钉的同时要分泌一些昆虫表皮降解酶 类。在这些酶的共同作用下将虫体局部体壁溶解，穿透钉依靠机械压力穿透昆虫表皮，伸入体腔内进行繁殖。分 泌的降解酶有几丁质酶、蛋白酶、脂酶、酯酶等。 表皮降解酶的作用除降解阻碍病原菌入侵的寄主表皮蛋白外，还可利用寄主蛋白作为营养，破坏寄主的抗真 菌蛋白，释放氨基酸并生成胺以调节 pH。表皮降解酶的出现存在一定顺序，24h 之内首先检测出的是蛋白酶和酯 酶，其次是几丁质酶和脂酶。 蛋白酶在降解过程中起重要作用，其活力高低是决定绿僵菌侵染力的首要因素。绿僵菌内切蛋白酶有 Pr1、 Pr2、Pr3 三类。凝乳弹性蛋白酶 Pr1 是一组碱性蛋白酶同工酶，它们能降解昆虫的表皮，该酶与附着胞的生长关 系较大，并且 Pr1 与菌株的毒力密切相关。Pr2（丝氨酸类胰蛋白酶）也是一组碱性蛋白酶同工酶，其对表皮无活 性，可能参与细胞控制机制，催化特定的蛋白酶水解和失活过程，控制入侵机构的分化。Pr1 和 Pr2 仅在碱性条件 下生成，因此侵染表皮呈碱性是毒性因子产生的一个生理信号。Pr2、Pr3 的降解产物诱导 Pr1 的产生，并控制 Pr1 产生的速度和数量。 2、 入侵后杀虫机理 a. 吸收营养 病菌突破昆虫表皮之后，在血腔中大量繁殖，并从昆虫体内不断吸收维持自身生长、繁殖是、必需的营养物 质，降低昆虫生活能力，最终导致昆虫死亡。 b. 分泌毒素 Kodaira 在培养金龟子绿僵菌的滤液中分离到一种具有很高杀虫活性物质—破坏素 A。破坏素对免疫压力、 肌 肉麻痹的功能。另外，Aldridge 等从金龟子绿僵菌中分离出细胞松弛素，这种物质对哺乳动物有急性毒性，可抑 制血细胞的运动，降低血细胞的吞噬能力。 3、 致病基因克隆 近年来，人们开始致力于研究虫生真菌的有关基因，以便发现有价值的基因，从而增强虫生真菌的致病力， 加快杀虫时间，以便更好地利用这一有效制剂。当前的研究重点基因主要是涉及降解昆虫表皮蛋白酶基因、几丁 质酶基因等。另一个重点是毒素基因。绿僵菌的信号传递基因也是克隆研究的热点，这类基因和致病作用关系不 大，但与病原菌对寄主的直接或间接识别有关。三、 遗传改良与菌种选育 目前，主要利用有性循环、原生质体融合和遗传工程途径来完成菌株改良。 低温菌株的选择：绿僵菌是防治地下害虫最有利的病原菌，但温度是发生与否的关键。一般绿僵菌的最适生 长温度为 25—28℃， 温带地区的土壤温度除夏季外大都低于 25℃， 所以筛选在低温条件下能生长侵染菌株是提高 防治效果的重要途径。Rath 等从土壤中分离得到 1 株可在 2—25℃萌发的菌株。 抗药菌株的选择：用绿僵菌防治害虫时，绿僵菌会与防治真菌害虫的杀菌剂接触，并被大量杀死，降低了防 治效果。 四、 绿僵菌制剂研制与生产 1、 绿僵菌生产工艺的研究14 -

    微生物农药研发与应用真菌杀虫剂产品必须是活的菌体，并具有毒力高、抗逆性强、寄主谱广且贮藏期长的特点。真菌杀虫剂的生 产工艺以固体发酵、半固体发酵及双相发酵为主要途径。 绿僵菌主要以气生分生孢子、液生分生孢子和干菌丝为田间害虫防治的制剂成分。目前，许多国家用液固两 相法培养生产孢子 （在塑料袋内大米培养基上产孢） 我国重庆大学基因工程中心在绿僵菌孢子制剂生产工艺研究 。 上处于世界领先水平。 缺陷：在工艺方面，单纯的液体发酵生产的孢子或菌体，因活性和耐储藏性降低而受到限制。主要采用传统 的液固双相发酵生产工艺生产真菌孢子粉，固相发酵阶段存在搅拌不匀、通透性差、发酵周期长等问题。国内多 采用浅盘、窗纱或无纺布开发式生产模式，空间利用率低，容易感染杂菌，产品质量不稳定，成为阻碍因素。 2、 制剂的开发研究 现有剂型有：可湿性粉剂、乳剂、油剂（与水剂相比，在低的相对湿度下更有利于孢子的萌发，同时在高温 下也更能延长孢子的寿命， 还有利于孢子对疏水基质的吸附。 油剂在 17℃下贮藏 2～3 年后的孢子萌发率为 60%。、 ） 干菌丝、微胶囊，其中大面积应用的剂型为粉剂、干菌丝和油剂。研制与应用绿僵菌农药最成功的范例是利用它 控制沙漠蝗的国际蝗虫生物防治合作研究项目。该项目首次将绿僵菌制成高浓度孢子油悬浮剂，在施药前用油稀 释混合，从而成功地解决了真菌农药在干燥条件下的应用难题，为扩大真菌农药的应用范围提供了新的方法。 五、 绿僵菌的生物防治应用 1、 防治蝗虫 2、 防治蛴螬（金龟子幼虫） 3、 防治天牛 4、 防治其他害虫（白蚁、枇杷天牛等） 六、 绿僵菌产品 蝗虫生物防治制剂。 七、 存在问题和发展方向 附着胞形成条件的研究较少 防虫信息技术的发展 第三节 白僵菌 长期以来，白僵菌作为害虫生物防治的重要因子受到广泛关注和深入研究。 一、 白僵菌的分类及生物学特性 1、 白僵菌的分类 白僵菌属隶属于半知菌亚门、丝孢纲、丛梗孢目、丛梗孢科、白僵菌属，是一种广谱昆虫病原真菌。 2、 白僵菌的生物学特性 a. 白僵菌的生长繁殖 白僵菌可通过分生孢子、芽生孢子、内生孢子和菌丝体的断裂等多种方式进行无性繁殖，生活史的类型属多 孢型。 b. 白僵菌的侵染机制 侵染过程 i. 附着：吸附和固化 吸附过程是非特异性和被动的，这个过程既没有物质的合成，也没有物质的释放。有研究发现，多种病原性 真菌的分生孢子表面有一层排列整齐、具有很强疏水性的“小杆”层，它对酶、多种变性剂、去污剂和有机溶剂有 抵抗作用。吸附后，分生孢子会产生一些酶和粘性物质，使其进一步固着在体壁上。 ii. 萌发 昆虫的表皮成分不仅提供孢子萌发、生长所需的营养，而且对孢子形成芽管有刺激作用。实验表明，N-乙酰 氨基葡萄糖、几丁质、长链脂肪酸等都能刺激分生孢子的萌发，除了体表有充足的营养可满足分生孢子的萌发和15 -

    微生物农药研发与应用菌丝有限生长的需要，还需要克服寄主昆虫表皮中抑制真菌物质的作用。分生孢子萌发后，一般都形成长短各异、 分支或不分支的芽管，在适宜的条件下会长出一种能黏附于寄主体壁上的黏性物质-附着胞。 iii. 穿透 分生孢子萌发所形成的芽管可直接穿透表皮，在有些情况下也可先形成附着胞。菌丝表面的半乳糖残基能够 有效地解除昆虫血球凝集素的活性，从而大大降低白僵菌菌丝对昆虫血淋巴细胞的吞食作用或其他保卫细胞的敏 感性。真菌的固有特性和寄主表皮的生理状态会影响穿透的过程，骨化的较难穿透，一般穿透家蚕幼虫表皮约 16-40h。 iv. 菌丝生长 芽管在穿透表皮后就在血腔内产生酵母状的虫菌体或延长形成菌丝后再产生酵母状的虫菌体；昆虫的血细胞 有识别、捕获、包囊和破坏菌丝的功能，菌丝以数量取胜，通过大量繁殖，在体内不断增值，侵入器官，充满体 腔，使血细胞失去吞噬作用，使正常的体液循环受到阻碍，造成生理饥饿，并会引起组织细胞的机械破坏。同时， 菌丝在生长过程中分泌的毒素和代谢产物（如白僵菌素和草酸盐类等）会使血液的理化性质发生变化，从而使寄 主正常的代谢机能和形态结构发生变化，最终因此不能维持正常的生命活动而死亡。 v. 毒素的产生 目前， 在白僵菌中已发现了多种毒素， 其中最重要的有 3 种： 白僵菌素 （是一种环状的缩羧肽， 对多种昆虫(如 蚊子等)具毒杀作用，会影响离子的运载；白僵交酯（作用于围心细胞的毒素） ；球孢交酯（使核变性） 。 c 昆虫僵病的病状 发病初期，昆虫运动呆滞，食欲减退，静止时或全身倾侧或头胸俯状，呈萎靡乏力的状态。皮肤失去光泽， 有些病虫的体皮上有大小不一黑褐色的病斑，个别的胸腹足上环绕一条黑色带状的病斑。随着病势的发展，患病 昆虫身体转侧，有时吐出黄水或排泄软粪，不久即死。 刚死的虫体，皮肉很松弛，身体柔软，过 2 至 3 小时后开始变硬，常变成粉红色。硬化后尸体 1 到 2d 后，先 在气门、口器及各环节间生出绵状白毛，死后 3 到 4d 白毛布满全身，而且白毛上又逐渐长满石灰状白粉，几周后 白粉渐变为黄色，上而又生出许多针状结晶。 3. 白僵菌的致病性及菌病流行条件 1) 白僵菌的专化性：专一性不强，但如长期侵染一种害虫，就会或多或少地对寄主产生较强的喜嗜性。 2) 害虫的敏感性：生理状况（如幼虫越冬前侵染率为 10%，羽化是侵染为 30%至 50%，越冬幼虫放在室内饲养 侵染率为 100%。 ） 3) T、湿度：高温干燥（不长出白色菌丝和分生孢子，病菌不易蔓延） 低温潮湿（只要温度在短期上升则可形成不同程度的流行病） 适温高湿（病菌最易流行，蔓延范围也广） 白僵菌不仅能寄生在农业害虫上，也能寄生于家蚕、蜜蜂等益虫。因此，受白僵菌寄生的昆虫，通过分生孢 子的飞散，又可到处传染，造成其他昆虫致病。白僵菌致病性主要取决于菌株、害虫、虫态及环境条件等因素； 若长期侵染一种害虫，就会对该害虫产生喜嗜性。相对湿度对白僵菌的侵染来源来说很重要，只有相对湿度高于 90%以上时，白僵菌的孢子才能萌发并侵入虫体。 总之，白僵菌致病机理不像化学农药那样依靠自身毒力杀伤杀死害虫，而是通过吸取虫体内水分和养分进行 自身菌丝生长，致使虫体内生理代谢紊乱或代谢发生障碍而死亡。白僵菌不仅对幼虫、蛹、成虫等各种虫态均能 侵染，而且对下一代还有持效作用。 二、 白僵菌的生产 1、 菌种分离 a. 僵虫法： b. 土壤分离 c. 大蜡螟诱饵法 d. 活虫体 2、

    微生物农药研发与应用a. b. c. d.诱变处理 单孢分离（异核现象、重组） 原生质体融合 基因克隆三、 发酵工艺 1、 液体发酵 由于芽生孢子生活力低下，芽生孢子孢壁薄，不耐贮藏，难以应用于实际。20 世纪 80 年代，加拿大、中国、 美国相继开展了液体深层发酵生产白僵菌分生孢子的研究，结果表明，它虽相对于芽生孢子的贮藏性能好一些， 但毒力、生产量等都不尽人意。 2、 固体发酵 固体发酵是白僵菌工业生产采用的主要方式。当前，比较有特色的方法是加拿大的尼龙高压灭菌袋培养法： 将麦麸培养料装入金属浅盘内，上方覆以半透膜性玻璃纸，然后放入尼龙高压灭菌袋内，灭菌后用注射器向袋内 玻璃纸上注射液体菌种，培养两周后可获得不带培养基的纯菌体与分生孢子的混合物。 3、 液固双相发酵 该方法首先经几级液体发酵制得大量白僵菌芽生孢子或菌丝体，再将其接种于固体料上继续培养，以获得分 生孢子，然后经旋风分离收集纯孢粉。 四、 剂型研究及其应用 1、 原粉与粉剂 利用真菌杀虫剂固体发酵产品，连同固体培养基一起粉碎，便成为原粉 若利用旋风分离等分离方法将固体培养基表面生长的真菌孢子分离提纯，便得到含孢量很高的高孢粉。高孢 粉加入一些填充料（如滑石粉、白炭黑、高岭土、硅藻土、抗紫外剂等）进行进一步加工，制成粉剂。 2、 可湿性粉剂、乳剂和油剂 可湿性粉剂是以孢子粉加入湿润剂（也叫展着剂，常用的有有机硅）和载体（如上白炭黑等）混合而成的一 种剂型；乳剂是利用乳化剂（也叫表面活性剂，常用的有脂肪醇聚氧乙烯类、烷基苯酚聚氧乙烯醚类、磺酸盐类、 磺酸酯类、酰胺类等）将分生孢子制成水悬液的一种制剂形式；油剂就是以油为稀释剂。 与粉剂相比，可湿性粉剂、乳剂和油剂更有利于孢子的分散与附着，且三者均在使用前才稀释，以确保其稳 定性与防治效果。 3、 微胶囊剂 是人们利用可溶性淀粉、明胶、氯化钙等为囊壁材料，对菌丝或孢子进行胶囊化包被，这样处理，可以延长 真菌杀虫剂的菌丝或孢子在暴露的环境中存活时间增加和增强侵染效果。 4、 混合剂 人们将化学杀虫剂、植物源杀虫剂及其他生物杀虫剂与真菌杀虫剂进行混合制剂，已取得更快的杀虫效果。 汤坚等在研制永久性混合剂方面做出了有益的探索，他们不但研究了白僵菌混合粉剂的最佳配方（20%的紫外保 护剂 OF、4%的“灭幼脲 3 号”原粉、25%的凹凸棒上及 51%的高孢粉） ，且对产品所要达到的技术指标、包装标 准均进行了规定。 5、 干菌丝 Rombach 等（1988）利用白僵菌的液体发酵产物，将其制成干菌丝颗粒，该颗粒在田间应用时可在作物上产 孢，侵染害虫。 6、 无纺布菌条 这是日本东电公司发明的一种真菌杀虫剂新剂型，它是利用无纺布为培养基的载体，是昆虫病原菌在其上生 长，害虫接触上面的孢子后受到侵染，从而达到控制害虫的目的。现在，我国已开始广泛利用无纺布菌条防治各 种天牛。并且，我国已开始尝试无纺布菌条和引诱剂结合对众多林业害虫进行防治。17 -

    微生物农药研发与应用五、 生物防治应用 1、 地下害虫防治 2、 食叶及刺吸害虫的防治 3、 蛀干害虫的防治 六、 白僵菌制剂的使用 白僵菌是一种具有活性的微生物杀虫剂，它的孢子萌发、生长、繁殖都要受到外界环境的影响。温度 温度对孢子 温度 萌发、菌丝侵入及病情的发展有影响，以 20-30 度为宜；相对湿度 相对湿度对分生孢子的萌发和菌丝的发育很重要；日光 相对湿度 （T、湿度） 、紫外都有破坏作用，应选择傍晚施药。 1、 喷雾法（先将菌粉配成菌液，再加入 0.05%洗衣粉液） 2、 喷粉法 3、 土壤处理法 4、 与其他杀虫剂混合使用 5、 与其他微生物杀虫剂混合使用 七、 应用前景及展望 第四节 虫霉一、 虫霉的概况 1、 虫霉的生物学特性 多数虫霉在生活史中同时具有分生孢子和休眠孢子两个循环，一般包括原生质体、菌丝段、菌丝、分生孢子梗、 分生孢子及休眠孢子等阶段。 a. 原生质体 原生质体是分生孢子产生芽管穿透寄主之后在血腔中形成的，它们通过出芽方式在血淋巴中迅速繁殖，并能在寄 主的固体组织上生长。原生质体不具细胞壁，其形态为丝状、卵状、变形虫状、球状或不规则形状。 b. 菌丝段与菌丝 具原生质体阶段的虫霉，当原生质体充满寄主血腔后，便开始发育出细胞壁，形成菌丝段，即发生所谓壁的“再 生” ；不产生原生质体的虫霉，其穿透寄主体壁的不分支的芽管先产生隔膜，然后断裂成菌丝段(或虫菌体)，这些 短菌丝不仅在寄主血腔中，有些也可体外培养，菌丝段在寄主血腔里通过出芽迅速繁殖，并生长变长，有时也产 生隔膜，即成为菌丝，它们主要起营养作用，即吸收寄主血淋巴和组织中的养分供其本身生长、繁殖。 c. 假囊状体 是一种穿透器官，它率先穿透表皮使之破裂，从而有助于分生孢子梗破壁而出；但它也可能会改变虫尸体表的相 对湿度，从而为分生孢子梗的形成或产孢创造条件。 d. 假根 和假囊状体一样，也是一种特化的菌丝，其作用在于将虫尸固定在基物（如树叶）上而不致于掉落到地面，从而 有助于疾病的传播。虫霉的假根有 3 种形态：单菌丝假根、假菌索和类假菌索结构。 e. 分生孢子梗 在伸出寄主体外的菌丝中，多数分化成直立、粗壮、稍呈棒状、多核的分生孢子梗，其顶部都由一隔膜形成单核 或多核的产孢细胞。产孢细胞上部膨大、缢缩，并产生隔膜。将分生孢子梗的原生质体逐步移到上部，形成初生 分生孢子；初生分生孢子发芽后产生芽管，芽管（也叫次生分生孢子梗）将会像分生孢子梗一样产生次生分生孢 子。 f. 分生孢子 是虫霉的无性繁殖体，是侵染单元。它们在分生孢子梗上成熟后就要从梗上释放出去(被动脱离和主动弹射)，如18 -

    微生物农药研发与应用果初生分生孢子没有落在寄主体壁上，它便会在潮湿的环境里萌发而产生芽管，芽管端部形成次生分生孢子。在 初生分生孢子将所有原生质都转移到次生分生孢子后，次生分生孢子梗同样会将次生分生孢子弹射出去，而初生 分生孢子只剩下一层空壳。次生分生孢子仍具有侵染性，有的甚至是主要侵染单元，在潮湿的环境里也可以在基 质上继续萌发，具有重复产孢的特征。 g. 休眠孢子 休眠孢子是虫霉生活史中具有厚细胞壁且借以保护整个细胞度过不良环境条件而延续下去的阶段。虫霉有 4 种类 型的休眠孢子：厚垣孢子、结合孢子、假结合孢子和柔毛孢子。多数种类的虫霉易形成形状不规则的厚垣孢子， 它是由菌丝段向内分泌一层厚壁而形成的。 二、 虫霉的侵染过程 虫霉对昆虫寄主的侵染始于分生孢子在寄主体表的附着。在适宜的环境条件下，孢子萌发形成芽管，穿透昆 虫体壁(有些虫霉，如根虫瘟霉，芽管在穿透寄主体壁前可形成附着胞，再形成芽管)。菌体进入寄主血腔后，立 即脱去细胞壁，避免寄主的非特异性免疫反应；同时，大量增殖以消耗寄主养分，导致寄主衰竭而死。虫霉在寄 主临近死亡时，重新产生细胞壁，形成菌丝段，并进一步分化形成假根、假囊状体和分生孢子梗，在条件适宜时 产生并弹射出分生孢子。 初生孢子的传播途径多样，通常自虫尸上主动弹射，有些真菌（如蓟马虫霉可以在活的虫体上生长和弹射分 生孢子。专性寄生于蝉的团孢霉属，只侵染寄主的后腹部，并不影响寄主的正常飞行，产孢结构在寄主的腹部大 量形成，并随寄主的移动而散布分生孢子；斯魏霉属的真菌是虫霉目中最进化的种类，其高度组织化的产孢结构 在寄主血腔中形成，分生孢子通过寄主腹部侧板上一个非常巧妙的缝隙孔射出，却不影响寄主的正常行为，孢子 可随寄主的移动而进行活体传播。 弹出的分生孢子表面一般有黏液成分，使其易黏附到新的寄主体表，能很快萌发。当主动弹出的分生孢子没 有落到新寄主体上时，会继续产生次生分生孢子或三生分生孢子、四生分生孢子等重复分生孢子，或直到孢子内 的原生质营养消耗殆尽，这增加了虫霉感染寄主的机会。 在极端温度、湿度等不利的环境条件下或缺少寄主存在的情况下，虫霉可以产生大量休眠孢子，或在干燥的 虫尸中以休眠菌丝的形式存活。 三、 虫霉病的流行及影响因子 虫霉病的发生是病原物、寄主和环境相互适应、相互作用的结果，加之人类的活动，使得研究虫霉病的流行， 必须综合考虑寄主、虫霉、环境因子和人类活动的作用。 1、 寄主种群 寄主是虫霉的侵染对象，寄主的种群遗传学、生物学和生态学关系到病害发生与否及发生程度。由于不同寄 主的遗传背景不同，导致它们在生物学特性和生态适应性方面存在的差异，表现为对同一虫霉的敏感性不同。就 寄主而言，其易感性、种群密度、动态趋势和空间分布等因素都影响着流行病的发生。 a. 易感性 寄主对虫霉的敏感性与寄主的遗传性状关系很大，寄主种内差异会对虫霉的侵入力产生显著影响；而且同一寄主 不同龄期也可能表现不同的感病性，如微叶蝉 2-5 龄若虫感染率可达 55%，而成虫感染率不超过 19%；在成虫期 随昆虫种类不同受感染的程度变化也大，如同翅目的蚜虫、叶蝉类成虫易被感染，而鳞翅目的成虫一般不受感染。 此外，不适宜的营养或环境条件影响昆虫的正常代谢，也造成虫体生长不良等而易受真菌感染。 b. 种群密度 寄主种群密度是流行病发生的关键因子。种群密度和寄主感染率之间的关系有时表现为典型的捕食者与被捕食者 的跟随效应，即一旦寄主高度密集（有个最低值） ，林间带菌量将迅速增加，便可在短期内引起大规模流行病控制 害虫种群；但也有研究表明两者呈负相关或相关性不显著等结果。 c. 空间分布 寄主的空间分布情况及寄主的活动能力也对虫霉流行的程度有十分重要的影响，如在叶心处集群或活动能力较弱19 -

    微生物农药研发与应用的蚜虫往往受虫霉的感染程度较低。 2、 病原菌 虫霉本身对流行病的影响主要表现在寄主专化性、初始侵染原的时空分布、数量动态等几个方面。 a. 寄主专化性 寄主专化性是在病原菌与寄主长期协同进化过程中形成的，有的专化性较高，有的较低。如：舞毒蛾噬虫霉和灯 蛾噬虫霉分别侵染舞毒蛾和山毛榉褐灰舟蛾， 即使在同时同地也互不侵染另一种寄主； 而根虫瘟霉能侵染同翅目、 鳞翅目、双翅目等种类繁多的寄主。 b. 侵染体时空分布 不同时间和地点的侵染体的侵染能力是不同的。如：埋于地面枯叶中的与树干暴露部位虫尸休眠孢子萌发产生的 分生孢子的侵染力比较，前者明显高于后者；而且有些侵染体的休眠孢子萌发需要一定的温度、光度、湿度等条 件，而这些条件的分布又有时空性，因此就会影响该类侵染体的分布及侵染力。 c. 侵染体数量 侵染体的数量动态是虫霉流行病学分析中一个不可忽视的因素。 3、 环境因子 虫霉和寄主的相互作用离不开所处的环境。环境既深刻地影响着寄主种群的生理生态、发育及其时空分布和 密度，也影响着虫霉的活性、毒力、扩散传播及存活等。 a. 温度 不同真菌具有不同的适宜生长温度，环境温度的适宜度是决定流行病是否发生的重要条件之一，也是流行病之所 以表现季节性的原因。虫霉产孢、侵染和大规模流行的最适温度范围一般为 15-25℃，一般而言，10℃以下产孢 量显著降低，分生孢子侵染力减弱，0℃以下分生孢子一般不能存活。季节性温度变化还是休眠孢子产生和萌发的 一个重要物候信号。低温一般有利于虫霉休眠孢子的产生和萌发。 b. 湿度 分生孢子的产生、萌发是虫霉成功侵染寄主的必要前提，决定着侵染循环的开启，并维系着季节流行。虫霉分生 孢子的产生和弹射要求饱和或近饱和的相对湿度，萌发和侵入也要求接近或超过 90%的相对湿度。在许多关于流 行病的研究报道中，降雨量与流行病的发生密切相关。有研究发现，舞毒蛾噬虫霉在舞毒蛾种群中的流行与 5 月 份的降雨及湿度有关，如 5 月份的降雨量多、湿度高，则 6 月份发病率可在 40%以上。而人为提高湿度也可增强 虫霉的流行。通过长期进化，许多虫霉可以利用低温露点所形成的饱和湿度完成对寄主的侵入，如染病虫尸多在 下午至傍晚时死去，在晚间至次日凌晨大量产孢，分生孢子也正是在晚间至次日凌晨迅速完成对寄主的侵入，这 或许是虫霉对环境的一种适应性。分生孢子和休眠孢子在高湿度环境下的存活时间较长，而菌丝段则在低湿度下 保存更久。 c. 光照 光照对虫霉流行的影响主要表现在两个方面：一方面，光周期作为一种信号刺激和调节虫霉的生命现象；虫霉在 夜间至凌晨产孢的节律是由光周期所决定的。另一方面，阳光中紫外线成分对虫霉孢子具有很强的杀伤力。虫霉 的分生孢子在自然光照下存活时间相当短，连续光照会导致孢子迅速失活。 4、 人类活动 由于人类活动的介入，使得虫霉流行病中三角关系变得更为复杂。对于生物防治来说，可以通过异地引种和 放菌来防治。由于耕作制度的不同，栽培管理措施的不同，导致虫霉流行病的发生呈现较大的差异。 a. 化学防治 虫霉对化学农药的敏感性因菌株不同而有所差异，与化学农药的类型密切相关。施用杀菌剂防治植物病害对虫霉 的流行产生不利影响，若长期施用杀菌剂的地块内害虫种群更易爆发成灾。因此，若以虫霉流行病来进行生防， 则必须选择使用与虫霉生物学相容的化学药剂，并且在使用时间上与虫霉流行的敏感阶段分开，以尽可能发挥虫 霉流行病控制虫害的作用。 b. 信息激素 害虫信息激素对虫霉流行的影响，主要表现在通过对害虫行为的调节而增强虫霉在害虫种群中的扩散，从而使流20 -

    微生物农药研发与应用行病提前或加剧发生。例如，将小菜蛾的雄蛾用人工合成的雌蛾激素引诱到诱集器中，让它们粘染上根虫瘟霉分 生孢子后再飞回到大田中去，可起到在种群中扩散病原的作用。因此，昆虫性激素可用于帮助虫霉侵染体的扩散 和传播，而侵染体在诱集器内可免受紫外线辐射和其他非生物环境的不利影响，有利于流行病的发生。 c. 引入天敌 虫霉的寄主范围较窄，通常不会感染寄主的天敌。即使有些虫霉与害虫天敌间产生不利的互作关系，但由于虫霉 和害虫天敌所适宜的天气条件明显不同，因此两者能在时间和空间上错开。 d. 耕作制度 在季节性作物系统中，作物收获和土壤翻耕等措施都会使环境中的虫霉侵染体大受影响，若在田边保留一定的灌 丛或植被则对虫霉的延续与早期增殖具有十分重要的意义。通过灌溉及提高植物冠层郁闭度来调节田间小气候， 可促进虫霉流行病的发生。 四、 虫霉制剂的研制 三个阶段 a. 分生孢子 虫霉分生孢子生产技术虽然简单，但要得到质量均一的产品并不容易；此外，人们对于刺激分生孢子形成的因子 和分生孢子的保藏技术也缺乏了解。 b. 休眠孢子 20 世纪 70 年代，人们将视线投向虫霉休眠孢子杀虫剂的开发，随着研究的深入，人们发现，休眠孢子发芽率低、 发芽同步性差。并且，休眠孢子本身并非侵染单元，需萌发产生芽生分生孢子才能侵染昆虫。但休眠孢子萌发最 多的时候往往是田间气候及寄主状况不利于侵染循环反复出现的时候，而且生产成本也高。 c. 菌丝 菌丝生产技术是从根虫瘟霉开始的，并得到一定程度的推广。然而其中也存在一些重要的问题：一、菌丝和休眠 孢子一样不是侵染单元；二、体外生产的菌丝贮藏期很短，冷冻贮藏和机械粉碎对菌丝的活力影响很大。更重要 的是，田间应用菌丝剂尚未获得稳定效果。 五、 虫霉侵染体的繁殖与应用 大多数虫霉为专性昆虫病原真菌，对营养要求很高甚至苛刻，人工分离培养的难度很大。这使得虫霉菌种在 应用方面一直受到限制。 1、 虫霉分离培养 基于营养要求和分离培养的难易，虫霉大致可分为 4 类：一是新月霉科的耳霉，它们最容易分离培养，在普 通培养基上即可生长良好；二是巴科霉、虫疫霉、虫瘟霉等，这些需加入如蛋黄、牛奶等特殊的营养才能正常生 长；三是虫霉、噬虫霉、新接霉，它们需用昆虫组织培养的方法进行分离和有限繁殖；四是斯魏霉，它们不能进 行人工分离培养。 蝇虫霉和实蝇虫霉是蝇类的重要生防因子，目前只是采用活体接种的方法，得到受感染的活蝇或蝇尸，捣碎 后再释放到环境中防治蝇类和实蝇类。 虽然虫霉的分生孢子也可以作为侵染体释放，但由于主动弹射和对环境敏感等原因，不可能大量直接生产分 生孢子，也很难以水悬液的形式释放。到目前为止，虫霉应用技术的研究主要针对菌丝和休眠孢子。 2、 休眠孢子生产 虫霉休眠孢子曾是 20 世纪 70、80 年代研究的热点，休眠孢子的优点是抗逆性强，保存时间长久。目前，只 有为数不多的虫霉（耳霉）能通过离体培养产生休眠孢子，并且条件相当苛刻。研究表明，一些化学物质可以促 进休眠孢子萌发；超声波处理后会显著提高萌发率。人们对休眠孢子的贮存也有研究，发现在 4℃下干燥保存不 会影响其萌发率。 人们首先实现了块状耳霉休眠孢子的规模化生产，但研究发现工业生产的休眠孢子对蚜虫无致病力。于是， 人们将注意力转移到暗孢耳霉的生产，并取得一定成果。但是，休眠孢子的萌发需要在 4℃度过至少 3 个月的成 熟期，萌发困难且不整齐的问题未能解决，并且，利用休眠孢子进行一系列蚜虫防治实验也未取得成功。21 -

    微生物农药研发与应用3、 菌丝体生产 培养基： 培养基： 新蚜虫疬霉、根虫瘟霉、安徽虫瘟霉等常见虫霉可以在含蛋黄的培养基上培养生产，萨氏培养基（酵母膏、 葡萄糖、蛋白胨）中需添加一些植物油，才能作为虫霉的液体培养基。 贮存： 贮存： 在尸体体内，菌丝体可以在 4℃下存活得很好，人工培养的菌丝脆弱，保存期不超过 1 个月，且致病性也差。 枯存法（干燥保存前，先用 10%的麦芽糖处理菌丝，这样可明显提高菌丝产孢活性） 。现如今采用海藻酸盐（保 湿）包埋法，同时加入糖类、淀粉类或几丁质等成分，这样有助于孢子弹射。 注枯存法： 将培养液用清水洗涤数次，抽滤得豆皮状“菌皮” 。随后将菌皮置于室温下自然干燥 2h 左右，喷 10%麦芽 糖至饱和。移入 4℃低温高湿的冰箱中冷藏 18 至 20h 取出于室温下干燥至碎，于-20℃冰箱中保存。 4、 虫霉的应用 1) 自然流行病利用 通过研究流行病的自然发生规模，了解和掌握控制病害流行的主要环境因子，结合田间栽培管理措施，创造有 利于害虫流行病发生和发展的条件，最大限度地发挥其对害虫的自然控制。 2) 接种式放菌 指在害虫造成危害之前就引入病原物，使之可以提前累积至诱发流行病所需的量。 3) 引种定殖 指将病原物引入其非自然发生区使之一劳永逸或至少很长时期的自我维持下去， 或多或少地将虫口抑制在低 水平。 4) 淹没式放菌 制成真菌杀虫剂，通过大量放菌，使害虫口下降。 六、 存在问题与发展方向 1、 存在问题 a. 制剂干燥 一方面是虫霉制剂的干燥技术尚未突破， 制剂在冻干过程中往往很容易失活 （在常温下自然干燥其活力还长久些， 正在研究的是冷冻干燥和自然干燥过程中理化特性的变化） ；另一方面是凝胶颗粒作为杀虫剂在使用上不太方便， b. 液体培养 目前的培养基使虫霉难以正常生长 c. 菌株保存 —80℃液氮环境是长期保存虫霉菌株的唯一办法 2、 研制和应用前景 第五章 昆虫病原线虫一、 生物学特性 昆虫病原线虫一生可分为卵、幼虫、成虫 3 个虫态。幼虫期共 4 个龄期，其中只有第 3 龄期幼虫可存活于寄 主体外，也是唯一具有侵染能力的虫态，又称侵染期线虫。昆虫病原线虫主要包含异小杆线虫属（发光杆菌）和 斯氏线虫属（嗜线虫杆菌） ，它们具有不同的生活史，斯氏线虫的 3 龄幼虫侵入寄主后发育 4 龄后变为成虫，成虫 进行两性繁殖，后代既有雌性，也有雄性；但异小杆线虫则出现雌雄同体的成虫，只有到了第二代时，才出现雌 雄异体的两性生殖。 侵染期线虫肠道细胞内携带有共生菌，在遇到合适的寄主昆虫后，线虫便可通过昆虫的自然孔口（如气门、 肛门、伤口等）或节间膜进入昆虫的肠道和血腔，然后在昆虫血腔中释放出共生菌并快速增殖，导致寄主死亡。 线虫则取食共生菌和液化的寄主组织并发育成熟，完成交配、繁殖，最后又释放出大量的 3 龄幼虫，继续侵染其 他寄主。22 -

    微生物农药研发与应用昆虫病原线虫与其共生菌是密不可分的互惠共生关系：昆虫病原线虫帮助共生菌来抑制昆虫的免疫系统的活 性，而共生菌则通过降解寄主组织为线虫提供营养需求。并且，共生菌还会分泌一些抗生素，使昆虫尸体不会被 其他微生物分解利用，以使线虫充分利用寄主的营养。 线虫与共生菌的关系： 1) 信息作用 在共生体系中，信号物质广泛地调节着二者之间的关系，不同的信号物质控制着线虫不同时期的生长发育， 主要包括使线虫由侵染期恢复发育和在食物匮乏时进入侵染期虫态的信号物质。有研究表明，线虫大量繁殖主要 是受细菌分泌到培养中的食物信号的诱导。因此，为获得最大产量和缩短培养时间，在液体培养基未接入线虫之 前，先用共生菌孵育，以提高侵染期线虫的产量（对数生长后期） 。 2) 营养作用 线虫和细菌的共生关系存在着高度的营养作用。有的共生体系非常严格，如异小杆线虫属和发光杆菌属的对 应关系相对比较松。即一种共生菌体，能匹配不同种属的线虫。线虫在侵染期以外的其它阶段，一方面以共生菌 为食，另一方面共生菌在对数生长后期产生不同的蛋白酶、脂肪酶、几丁质酶和磷脂酶，转化虫尸，提供营养， 并产生一些抗菌素。 3) 媒介作用 共生菌不能单独在土壤中存活，携带专化性不一。 二、 共生菌 嗜线虫杆菌和发光杆菌两属几乎全部种类都是昆虫病原线虫的共生菌。两属线虫的共生菌在肠腔内存在的位 置不同，嗜线虫杆菌属存在于肠腔内的一种泡囊中，发光杆菌属分布在线虫的整个肠道内。两者的共同特征是均 为 G-、周身鞭毛、兼性厌氧、能运动的杆状细菌。 这些共生菌均具有两型现象，在指示培养基平板上呈现两种菌落形态：初生型和次生型共生菌。初生型细菌 能支持线虫的大量繁殖，而次生型则不能；初生型可从感染期线虫肠腔中分离得到，也可以从被线虫侵染的昆虫 血淋巴中得到。初生型和次生型菌的鉴别可通过菌落的形态、色素、是否吸收溴百里酚蓝、抗菌作用、从麦康凯 琼脂中吸收中性红卵磷脂等几个方面加以区分（初+、次—） 。初生型菌体具有凸起的、圆形不规则的边缘，不透 明；而次生型菌落平坦、半透明、菌落直径较初生型大许多。所有初生型菌均具有抗菌性，能抑制其他细菌的生 长，而次生型菌不能产生抗菌素。 共生菌中已经发现有多种物质参与共生菌对昆虫的致死作用，包括脂多糖类物质、高分子量蛋白毒素、蛋白 酶、抗生素类等。 三、 致病过程 病原菌线虫在潮湿环境中可借助水膜作垂直运动和水平运动自主地寻找合适的寄主（线虫通过寄主本身的化 学物质或排泄物等来选择寄主） ，通过寄主的一些自然孔口（如口、肛门和气门） 、伤口或节间膜等进入寄主血腔 中，并从肛门释放共生菌于血腔，引起寄主患败血症而死。 线虫与共生菌躲过寄主的免疫系统的方法多样：1、共生菌能忍受或破坏寄主的体液包被，其最初未能避免被 昆虫体液包被，但随后能分泌一些酶使血细胞失去活性，并在血淋巴中迅速繁殖，使寄主很快死亡，而线虫能避 开血细胞的识别而不被包被；2、线虫能产生诱导酶抑制因子，该因子对共生菌具有保护作用。 四、 培养技术 1931 年 Glaser 首先用琼脂牛肉浸出液、面包酵母成功培养了格氏线虫，并用于田间防治日本丽金龟，这是昆 病原线虫首次人工培养成功到今天工业化生产已有 70 多年的历史。培养技术的历程：活体培养法到离体培养法， 从无菌培养法到单菌培养法，从固体培养法到液体培养法。 1981 年，Bedding 以猪肾、鸡什等廉价动物内脏为培养基的主要成分，绵碎块为培养基载体的固体培养技术 成功地生产了斯氏线虫和异小杆线虫。液体无菌培养的最早尝试是 1940 年 Glaser 用小鼠肝匀浆培养线虫，随后 人们一直在进行对工艺和培养基的配方进行改善（肝粗体液、气泡通气法） 。单菌培养技术的发展得益于共生菌的23 -

    微生物农药研发与应用发现，由于共生菌能产生大量的蛋白酶，使线虫可以在廉价的蛋白培养基上生长。共生菌还可以刺激侵染期线虫 脱鞘，加快线虫发育速度，有利于缩短线虫的培养时间。 五、 大规模生产技术 固体和液体培养法均可进行大规模生产昆虫病原线虫：两者在技术上稍有不同，如培养容器、培养基配比、培养 过程、清洗过程均有不同，但两种培养过程的参数（如 T、t、d）基本相同。 线虫的固体单体培养是通过无菌操作技术在加入共生菌的人工培养基中引入一级种线虫完成的；液体单菌培 养则是在线虫液体培养基中加入共生细菌和线虫一级种得到的。 条件： 1、 单菌 单菌培养要求仅携带一种共生菌，否则则会导致线虫产量大幅度降低。 方法：0.1%硫柳汞和 7000U/mL 的青霉素及链霉素消毒线虫卵，或用碱液处理 2、 培养基 动物组织匀浆（花费大、难以保藏） 、豆粉玉米油培养基、豆粉蛋类培养基和以面粉、蛋类、玉米粉、植物油等干 粉物质（廉价、室温下易保藏）做成的培养基 3、 培养系统 防污染、通气 4、 温度 25℃、 5、 接种量 在一定范围内，最终产量与接种量是成正比的 6、 培养时间 培养基营养耗尽且感染期线虫产量最大时 收集方法： 将培养物浸泡于自来水中，让线虫通过筛网，留下海绵等杂质，95%左右的感染期线虫从培养物中爬出，通 气振荡海绵可提高线虫收获率。浸泡的过程是分级进行的，包括几次的浸泡、沉淀、换水，如浸泡过夜，则需要 空气压缩机供氧。若是液体培养的则采用离心法。 贮存方法： 吸附物质（活性炭、藻酸、凝胶、或黏土等）保存法和干燥脱水（蒸发胁迫、高渗液胁迫）保存法 在生物防治中的应用 六、 在生物防治中的应用 昆虫病原线虫对钻蛀性害虫及地下害虫具有特定的防治效果。如山东省果树研究所与广东省昆虫研究所合作 将斯氏线虫释放到山东寿光、淄博、泰安苹果园防治桃小食心虫，使桃小食心虫的卵果控制在 1%以下。 昆虫病原线虫的侵染期幼虫对农药等化学药剂具有较高的抵抗能力，而且，低浓度的药剂能使线虫兴奋。因 此昆虫病原线虫和农药混合使用，一方面农药可以使害虫的抵抗力降低，便于线虫进入寄主；另一方面线虫可以 搅乱寄主的耐药性，是药效得到更好的发挥。 七、 高活性昆虫病原线虫的改造 由于昆虫病原线虫对环境的要求较高，特别对温度、湿度、紫外线的要求比较严格，主动寻找寄主的能力不 是特别强，因而限定了它的应用。因此，应用现代生物工程技术对昆虫病原线虫进行遗传改良，使线虫及其共生 菌的某些特性向更有利于其对害虫生物防治的方向发展。 1、 昆虫病原线虫的选育和改良 从昆虫病原线虫本身出发，通过杂交育种或别的措施筛选对特定害虫的高毒力、抗低湿品系；改进线虫产业化培 养方法，降低培养成本 2、 昆虫病原线虫共生菌的遗传改造24 -

    微生物农药研发与应用从共生菌出发，进行各种遗传改良，提高病原线虫的毒力和寄主范围。 抗病微生物的研究、 中篇总论 抗病微生物的研究、开发与应用 在农业生产中，每年由病原菌引起的植物病害和果蔬采后病害都会造成巨大的损失。目前，植物病害的控制 主要是依赖化学杀菌剂途径来实现，但由于化学杀菌剂对环境的污染问题越加严重，公众对限制化学杀菌剂使用 的呼声越来越强烈。我国加入 WTO 后，对化学杀菌剂的使用控制将越来越严格，因此，探求新的防治植物病害 的方法势在必行。为了寻求有可能替代化学杀菌剂的新方法，人们把目光转向了生物防治，而且许多研究结果都 表明生物防治方法的应用前景十分广阔。因此，开发低毒、高效、无残留的生物杀菌剂已经是一项紧迫的任务。 生物杀菌剂包括农用抗生素、抗病微生物等。其中，抗病微生物 抗病微生物是指能够通过寄生、抗生、竞争、溶菌等作 抗病微生物 用来抑制另一种微生物的生长，甚至杀灭另一种微生物的一类微生物。由于抗病微生物来源与自然界，对环境的 影响小，毒副作用低，因而得到了广泛的研究。一些抗病微生物及其制剂也已经登记注册：防治根癌的发根农杆 菌、防治细菌性斑点病的荧光假单胞菌、防治苗床病害的荧光假单胞菌、防治根白腐病、防治腐霉的寡雄腐霉等。 一、 抗病微生物在植物病害防治中的应用 1、 植物内生抗病微生物 植物是一个复杂的微生态系统，不仅在体表存在大量的细菌，在其内部组织也存在大量的细菌。有些内生细 菌虽然存在于植物体内，但对植物不造成危害，而且可以抑制植物病原菌的生长，长期发挥生物学作用，是植物 病害防治的天然资源菌。 一些植物内生抗病细菌不但可以抑制病原物的生长，而且可以促进寄主的生长。目前，已经从棉花、水稻、 马铃薯等多种植物中分离筛选到对植物病害具有生物防治作用的植物内生抗病细菌，这些抗病菌主要以芽孢杆菌 为主。 2、 植物外生抗病微生物 a. 直接作用于植物表面的抗病微生物 研究直接作用于植物表面抗病微生物是目前抗病微生物研究中较为成熟的一个方向， 尽管它存在于植物表面， 在防治植物病害时易受外界环境的影响，但是它施用较为方便，容易实现商品化，种类也较多，因此受到广泛的 重要。 在作物表面，抗病微生物可以通过分泌抗性物质、产生溶菌代谢物等方式来抑制植物表层的病原菌感染，从 而达到防治植物病害的目的。 b. 根部病害的抗病微生物 利用抗病微生物防治植物根部病害，就是抗病微生物防治植物根部病害，即将培养好的抗病微生物以一定方 式施入土壤中，或是通过在土壤中加入有机物等措施提高原有的抗病微生物的活性，从而降低土壤中病原菌的密 度，抑制病原菌的活动，减轻病害的发生。 根围抗病微生物从土壤中及植物的根部很容易分离到，从病害已经开始衰退的土壤或抑制病害发生的土壤分 离到抗病微生物的可能性更大。 二、 抗病微生物在果蔬防腐中的应用 自 1953 年首次报道枯草芽孢杆菌对柑橘果实病原菌有抗菌作用以来， 国内外学者就抗病菌引入果实表面防治 果蔬采后病害进行了广泛的研究。国内外不少学者筛选出对果品采后贮藏期病害有抑制作用的抗病微生物，如木 霉、芽孢杆菌、假单胞菌、酵母等，并用于防治试验。有研究者在显微镜观察到抗病细菌能够引起水果病原菌丝 异常，如菌丝扭曲，菌丝细胞畸形、菌丝颜色变淡、菌丝断裂离解等，这些表现可能就是抗病菌防腐的微观表征。 在蔬菜防腐方面，目前研究和使用的抗病菌主要是酵母类，这些抗病菌可以通过诱导蔬菜产生抗病性、营养 或空间竞争、在病原菌上寄生等作用方式来保证蔬菜的防腐。 三、 抗病微生物的生物防治机制 1、

    微生物农药研发与应用3、 竞争 4、 捕食 5、 溶菌 6、 其他机制 7、 弱毒株系 四、 抗病微生物的商业化开发 一方面，通过提取次级代谢产物，制成农用抗生素，以逐步取代化学农药。农用抗生素的研究始于 20 世纪 50 年代， 是随医用抗生素之后发展起来的， 早期筛选到的农用抗生素为放线酮、 抗霉素 A 以及一些多烯类抗生素， 随后又相继开发成功并已投入生产应用的有井冈毒素、公主岭毒素、农抗 120、农用链霉素等。防治对象已发展 到粮、棉、油、果、瓜等几十种作物病害。 另一方面，抗病生物活体的商业化应用，目前抗病微生物的商品还不多，但发展潜力巨大，目前主要集中在 芽孢杆菌对植物病害防治的应用上。 第六章 农用抗生素 第一节 农用抗生素概述 要了解农用抗生素不得不从抗生素开始，我们都离不开抗生素，列举常用抗生素。抗生素的发现是人们研 究微生物拮抗关系的结果，微生物在其生活环境中常分泌一些物质，与其它微生物发生寄生作用、竞争作用和抗 生作用。目前，虽然已有人工化学合成的抗生素和从高等动植物组织中提取的抗生素，但是抗生素的最主要来源 仍然是微生物。细菌、放线菌和真菌都是能产生抗生素，其中尤以放线菌最为突出，它所产生的抗生素种类最多， 实用价值也最大。随着抗生素事业的不断扩大，除了医疗用途外，抗生素在农业上的应用也获得迅速发展，特别 是 50 年代以来，由于公共卫生和环境保护的要求，使高效、低毒、无残毒的农用抗生素，作为植物保护剂的要求 不断增长，受到世界各国的普遍重视，成为当代微生物农药研究工作中迅速发展的一个重要方面。 一、农用抗生素的概念 抗生素 antibiotics 在日常生活中早已为人们所熟知，它是青霉素、链霉素、土霉素、卡那霉素等一类物质 的总称。它是由微生物生命活动过程中所产生的一类特殊的次生代谢产物。微生物产生的次生代谢产物实际上包 括很多小分子化合物，如抗生素、色素、生物碱、毒素等。而抗生素是其中具有特异性抗菌作用的一类次级代谢 产物，即在有效浓度很低的情况下，通过生物化学的作用，能够选择性地抑制某些生物的生长和代谢活动，甚至 杀死它们，而对产生菌本身则没有或很少有影响的一种化学物质。 在不同的研究时期，不同的学科，抗生素有不同的含义。早在 1942 年，美国学者 Waksman 曾给抗生素 抗生素下过这 抗生素 样的定义： “抗生素是微生物在新陈代谢过程中产生的、具有抑制它种微生物生长或代谢作用的化学物质。 ”但是 随着抗生素研究工作的进展和领域的日益扩大，上述抗生素的定义显然就很难确切地概括抗生素这个名词的含义 了。所以，随着对抗生素认识逐步深化，人们对抗生素这个术语也曾一再做过补充和修改，但是，由于抗生素牵 涉到很多学科和领域，所以它的定义应该从各种角度来考虑。 关于农用抗生素，最初的含义主要是将抗生素用于抑制植物病原微生物作为杀菌剂的。但是，后来发现抗生 素对农业害虫、杂草等也有极强的抑制作用和杀灭作用，从而使农用抗生素的概念也大大地扩大一步。因此，农 农 用抗生素的概念概括为：把由微生物生命活动过程中产生的对植物病原微生物、害虫、螨类、线虫、有害植物（杂 用抗生素 草）等其它生物能在很低浓度下显示特异性药理作用的天然有机物统称为农用抗生素 农用抗生素。 农用抗生素 二、抗生素的分类 目前从自然界中发现真正具有独特结构的天然抗生素种类很多， 约有 6500 种以上， 其中绝大部分 （约有 5000 种）抗生素是由微生物代谢产生的。随着新抗生素的不断出现，迫切需要将抗生素进行分类。但是，不同领域的 科学家提出了不同的分类方法。微生物学家习惯于按抗生素的来源分类；医生按照多数重要的临床抗生素的作用 进行分类；药理学家则按照作用机理分类；化学家按结构等。 按抗生素的来源分类：在现有的抗生素中约有 80%是由微生物产生的，细菌、放线菌和真菌都能产生抗生素。 1、按抗生素的来源分类26 -

    微生物农药研发与应用细菌产生的抗生素：多粘菌素、杆菌肽、枯草菌素、短杆菌肽等多肽类抗生素。 真菌产生的抗生素：青霉素、头孢霉素等。 放线菌产生的抗生素：阿维菌素、多杀菌素、链霉素、多氧霉素、春雷霉素、浏阳霉素、井冈霉素、四抗霉素、 灭瘟素 S（保米霉素） 、农抗 120 等。及许多医用抗生素：链霉素、卡那霉素、新霉素、四环素、土霉素、庆大霉 素等。 植物产生的抗生素：大蒜素等。 农用抗生素主要由放线菌 放线菌产生的。放线菌(actinomyces)在土壤中分布广泛，其数量仅次于细菌。许多放线 放线菌 菌可以产生抗生素，在目前已知的抗生素中，三分之二是由放线菌产生的，而在放线菌产生的抗生素中又有很多 是对植物病原菌和害虫有效的。放线菌在分类学上是一个独立的目，其形态有别于细菌和真菌，