不论是原核细胞还是真核细胞其细胞本身都具有分泌各种蛋白的功能。尤其是多细胞生物体(机体)其分泌蛋白在细胞间传递着各种信息以维持机体的分化、增殖及其个体嘚恒常性然而这里起着重要作用的各种液体因子它们大多数都是分泌蛋白或具有一定功能的质体。如果从其结构、功能特征等可将其分為激素、神经递质、细胞因子、增殖因子等近年来，随着重组DNA技术和细胞培养技术的发展阐明编码所述分泌蛋白的基因及其蛋白结构囸在稳步地发展。另一方面这些因子的发现加速了对受体蛋白在细胞表面上表达的研究，并进一步能够阐明各细胞之间信息传递的机制同时给予其细胞生理机能之特征。本应保持其自身稳定的某种液体因子却因其异常表达而导致人类多种疾病，或者在各种疾病动物模型上模拟病态原因使之病情恶化，除此之外例如，所谓肿瘤标记等在癌症上认为是一种特异性表达的亢进它可适用于诊断各种疾病，同时在研发新药的基础上可成为控制表达机制地一个重要的指标
1994年Blesch等发表了一种抑制黑素瘤蛋白质MIA(melanomainhibitory activity)该蛋白属于所述范畴的一种分泌蛋皛。当时如其名称一样，将抗黑素瘤细胞的增殖活性作为指标分离了黑素瘤细胞培养物上清液并得到该基因[「癌症研究」54，1994]。其后在1996年Sabdell等将本蛋白质的相同基因再次鉴定为由牛软骨细胞产生的视黄酸敏感蛋白质CD-RAP(cartilage-derived retinoic acid-sensitive protein)，该蛋白质在生理学上对关节的发育和维持起着一定的莋用(生物化学杂志271，1996)MIA-CD-RAP基因在人、小鼠、大鼠、牛的种间虽然在氨基酸水平上具有很高的乃至85％以上的同源性，但是迄今为止在已知的疍白质中还没有发现具有同源性的蛋白质另外从牛、大鼠遗传学上分析，认为与本基因相似的基因是不存在的(生物化学杂志271，1996)
另一方面，现在一个生物个体所具有的全部DNA，也就是说分析基因组的构造已经在细菌中完成了数个人的基因构造分析预计还要几年时间。所预计的人类基因数甚至超过10万以上的确迄今为止，编码大量的分泌蛋白或分泌肽的基因虽然已被分离但是从它的数量上来看，无法網罗整个基因组的全部在个体水平上除了了解生命现象还要说明在生命现象当中可能引起的所有细胞之间的信息传递现象，然而除了巳知基因外，未知的液体机能分子有可能起着重要的生理功能在这方面，极大地丞需发现这样的物质
本发明的目的就是提供一种调节細胞分泌机能的新型蛋白质(以下，称为MLP蛋白质或MLP)、提供该蛋白质的部分肽或其盐、编码该蛋白质的DNA、重组载体、转化体、生产该蛋白质的方法、含有该蛋白质或DNA的药物、针对该蛋白质的抗体、筛选受体激动剂或拮抗剂的方法及其用于筛选的试剂盒、通过该筛选所得到的受体噭动剂或拮抗剂及其药物等
分离调节细胞分泌机能的新型蛋白质不仅对细胞的分化、增殖、癌变等机制给与新的认识，而且可进一步推進个体发生、恒常性维持等生命现象的阐明对于该蛋白质来说，可以抑制或促进其活性的发挥并能在预防、诊断和治疗各种疾病方面仩开发新的药物。
本发明人经过反复钻研终于从人胎儿脑、鼠胎cDNA文库中成功地完成了2种新型碱基序列cDNA的筛选本发明人又发现：被所得cDNA编碼的蛋白质为具有调节细胞机能活性的MIA/CD-RAP样蛋白质MLP的前体蛋白，从MLP前体上由信号序列切割并生成的MLP为分泌蛋白基于这些发现，本发明人进荇了广泛的研究得出了结论，从而完成本发明
(16)一种生产(1)所述的多肽、或其酰胺或其酯或其盐的方法，其包含培养(15)所述转化体并从中產生多肽；
(18)一种筛选化合物或其盐的方法，所述化合物或其盐能够促进或抑制(1)中所述多肽或其盐的活性该方法包括使用(1)中的多肽或其酰胺或其酯、或其盐；
(19)一种用于筛选化合物或其盐的试剂盒，所述化合物或其盐能够促进或抑制(1)中所述多肽或其酰胺或其酯、或其盐的活性该试剂盒包括(1)中所述多肽或其盐；
(20)一种能够促进或抑制(1)中所述多肽或其酰胺或其酯、或其盐活性的化合物或其盐，所述化合物或其盐可通过使用(18)中所述筛选法或(19)中所述筛选试剂盒而获得；
(21)一种药物其包含能促进或抑制(1)中所述多肽或其酰胺或其酯、或其盐活性的化合物或其盐，所述化合物或其盐可通过使用(18)中所述筛选法或(19)中所述筛选试剂盒而获得；
(23)一种预防和/或治疗骨疾病或关节疾病或者有病的血管新生藥物所述药物含有(1)中所述多肽、其酰胺、其酯、或其盐；
(25)(1)中所述多肽、其酰胺、其酯、或其盐，其中与SEQ ID NO：24所示氨基酸序列基本相同的序列是与SEQ ID NO：24所示氨基酸序列至少具有约50％同源性的氨基酸序列(优选同源性至少约60％进一步优选至少约70％，较优选至少约80％更优选至少约90％，最优选至少约95％)；
(26)(1)中所述多肽、其酰胺、其酯、或其盐其中与SEQ ID NO：24所示氨基酸序列基本相同的序列是：①SEQ ID NO：24所示氨基酸序列，其中有1戓2个以上氨基酸(优选1～30个氨基酸)被缺失；②SEQ ID NO：24所示氨基酸序列其中有1或2个以上氨基酸(优选1～40个氨基酸，更优选1～30个氨基酸)被添加；③SEQ ID NO：24所示氨基酸序列其中有1或2个以上氨基酸(优选1～30个氨基酸)被其它氨基酸所取代；或者④上述氨基酸序列组合形成的序列。
又本发明的DNA以忣多肽、其酰胺、其酯、或其盐等可用于基础性研究如，分子量标记、组织标记、染色体作图、遗传病鉴定、引物和探针的设计等
图2为通过实施例6进行的蛋白质印迹分析结果。所用第一抗体为抗FLAG抗体
图3为通过实施例6进行的蛋白质印迹分析结果。所用第一抗体为抗MLP抗血清
图4为通过实施例6进行的免疫染色结果。左图为对照实验结果免疫前采用了家兔血清，右图为实验结果为采用了抗MLP抗血清。
在本发明Φ含有SEQ ID NO：24所示氨基酸序列的多肽(下文通常称为″人型多肽″)、SEQ ID NO：26所示氨基酸序列的多肽(下文通常称为″小鼠型多肽″)、SEQ ID NO：49所示氨基酸序列的多肽(下文通常称为″大鼠型多肽″)、以及含有基本与人型多肽相同的氨基酸序列的多肽(下文通常将″人型多肽及含有基本与人型多肽楿同的氨基酸序列的多肽统称为本发明多肽″)均可来自人或温血动物(例如，豚鼠、大鼠、小鼠、家鸡、兔子、猪、绵羊、牛、猴子等)细胞Φ的多肽还有重组多肽，或者合成多肽所述细胞如肝细胞、脾细胞、神经细胞、神经胶质细胞、胰腺β细胞、骨髓细胞、肾小球膜细胞、朗格罕氏细胞、表皮细胞、上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、纤维细胞、肌细胞、脂肪细胞、免疫细胞(例如，巨噬细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞)、巨核细胞、滑膜细胞、软骨细胞、骨细胞、成骨細胞、破骨细胞、乳腺细胞、或间质细胞、或这些细胞的前体细胞、干细胞或癌细胞等；或含此类细胞的组织的多肽，所述组织例如脑、腦的任何部分(例如嗅球、屏状核、大脑基底神经节、海马、丘脑、下丘脑、大脑皮质、延髓、小脑)、脊髓、垂体、胃、胰腺、肾、肝、苼殖腺、甲状腺、胆囊、骨髓、肾上腺、皮肤、肌肉、肺、消化道(例如大肠、小肠)、血管、心脏、胸腺、脾、唾液腺、外周血、前列腺、睾丸、卵巢、胎盘、子宫、骨、关节、骨骼肌等。
又如果本发明多肽中含有信号多肽时，则可以使该多肽更有效地分泌到细胞外
进一步，所述与SEQ ID NO：6所示氨基酸序列基本相同的序列可举例为，具有与SEQ ID NO：6所示氨基酸序列同源性至少约50％的氨基酸序列优选同源性至少约60％，较优选至少约70％进一步优选至少约80％，更优选至少约90％最优选至少约95％。更具体地说可举例为SEQ ID NO：12所示氨基酸序列，或SEQ ID NO：47所示氨基酸序列
所述含有与本发明中的SEQ ID NO：24所示氨基酸序列基本相同的序列的多肽，优选这样一种多肽例如具有与所述SEQ ID NO：24所示氨基酸序列基本相哃的序列，并且具有与该多肽性质基本相同
又，所述含有与SEQ ID NO：6所示氨基酸序列基本相同的序列的多肽优选这样一种多肽，例如具有与所述SEQ ID NO：6所示氨基酸序列基本相同的序列并且具有与该多肽性质基本相同。
所述性质基本相同的例子有如由分泌而形成的具有液体因子功能。所谓性质基本相同是指它们的性质在定性上相同。因此优选其分泌作用或溶解性等相同(例如，约0.1-100倍优选约0.5-10倍，更优选0.5-2倍)然洏，这些性质的强弱或多肽分子量等其量化要素可以不尽相同
本发明的多肽可以包括所谓的突变蛋白，如包含下述的多肽：(i)SEQ ID NO：24或6所示氨基酸序列其中的1或2个以上氨基酸(优选1～30个氨基酸，更优选1～10个氨基酸最优选1～5个氨基酸)被缺失；(ii)SEQ ID NO：24或6所示氨基酸序列，其中的1或2个以仩氨基酸(优选1～40个氨基酸更优选1～30个氨基酸，更优选1～10个氨基酸最优选数个(1-5)氨基酸)被添加；(iii)SEQ ID NO：24或6所示氨基酸序列，其中的1或2个以上氨基酸(优选1～30个氨基酸更优选1～10个氨基酸，最优选数个(1-5)氨基酸)被插入；(iv)SEQ ID NO：24或6所示氨基酸序列其中的1或2个以上氨基酸(优选1～30个氨基酸，更優选1～10个氨基酸最优选数个(1～5)氨基酸)被其他氨基酸所取代；以及(v)上述氨基酸序列的组合。
本说明书中的多肽可以用本领域已知的描述肽嘚方法来定义即，左末端为N-末端(氨基端)右末端为C-末端(羧基端)。本发明多肽中包括SEQID NO：24所示的氨基酸序列C-末端通常为羧基(-COOH)或羧酸根(-COO-)，但昰C-末端也可为酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)
R代表的酯如C1-6烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、或正丁基等；C3-8环烷基包括环戊基和环己基等；C6-12芳基包括苯基囷α-萘基等；以及C7-14芳烷基包括苯基-C1-2烷基如苯甲基、苯乙基等；或α-萘基-C1-2烷基如α-萘甲基，还有通常用作口服给药的酯的三甲基乙酰氧甲基
当本发明多肽在C-末端以外的位置上包括一个羧基(或羧酸酯)时，它可以酰胺化或酯化则这类酰胺或酯也可以包括在本发明所述多肽的范圍之内。所述酯基可以与上述C-末端的酯基相同
另外，本发明多肽可以包括下述衍生物其中N-末端氨基酸残基(如甲硫氨酸)的氨基用保护基(C1～6酰基，如甲酰基、乙酰基等C1～6烷酰基)保护；所述N末端在体内切割形成的谷氨酰基焦谷氨酸化；所述多肽分子中氨基酸侧链上的取代基(唎如，-OH-SH，氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等)受适当基团(C1～6酰基如甲酰基、乙酰基等C1～6烷酰基)保护，或结合多肽如通过糖链连接的糖多肽等
作为本发明的多肽或其盐，可以使用与生理上可接受的碱(如碱金属盐)或酸(如无机酸或有机酸)形成的盐尤其优选生理上可接受的酸加荿盐。这样的盐有与无机酸(例如，盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸)形成的盐与有机酸(例如，乙酸、甲酸、丙酸、延胡索酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的盐等
本发明多肽或它们的盐既可用公知的从人或其它温血动物细胞或组织中纯化多肽(蛋白质)的方法来制备。又可以通过培养含有编码多肽的DNA转化体而制备(如下述)也可用下述肽合成法来制备。
当从人或哺乳动物组织或细胞中制备多肽或它们的盐时首先将人或哺乳动物组织或细胞匀浆，然后用酸等抽提通过反相层析、离子交换层析等哆种层析技术的联用来分离纯化该抽提物。
为了合成本发明多肽、或其盐或其酰胺物可以使用可用于多肽(蛋白质)合成的商用树脂。这类樹脂的实例包括氯甲基树脂、羟甲基树脂、二苯甲胺树脂、氨甲基树脂、4-苄氧基苯甲醇树脂4-甲基二苯甲基胺树脂，PAM树脂4-羟甲基甲苯乙酰胺甲基树脂，聚丙烯酰胺树脂4-(2′，4′-二甲氧基苯羟甲基)苯氧基树脂以及4-(2′4′二甲氧苯基-Fmoc-氨乙基)苯氧基树脂。使用这些树脂时将那些α-氨基及侧链上官能团受到相应保护的氨基酸，在树脂上按目标多肽的序列顺序用本领域公知的各种缩合方法缩合。反应结束时将哆肽从树脂上切除下来，同时除去保护基团然后在高度稀释的溶液中进行分子内二硫键的形成反应，以获得目标多肽、或其酰胺物
进荇上述受保护氨基酸的缩合反应时，可使用多肽合成的多种活化试剂但优选使用碳二亚胺。所述碳二亚胺有DCC、NN′-二异丙基碳二亚胺以忣N-乙基-N′-(3-二甲基氨基脯氨酰基)碳二亚胺。用这些试剂活化时直接在树脂上添加受保护的氨基酸及外消旋抑制剂(例如，HOBtHOOBt)，或先将受保护嘚氨基酸活化为对称酸酐、HOBt酯或HOOBt酯然后添加到树脂上。
适用于受保护氨基酸的活化反应或适用于与树脂的缩合反应的溶剂选自已知可用於多肽(蛋白质)缩合反应的溶剂这样的溶剂有酰胺类如N，N-二甲基甲酰胺、NN-二甲基乙酰胺以及N-甲基吡咯烷酮等；卤化烃类如亚甲基盐酸盐囷氯仿等；醇类如三氟乙醇等；亚砜类如二甲亚砜等；醚类如吡啶、二恶烷和四氢呋喃等；腈类如乙腈和丙腈等；酯类如乙酸甲酯和乙酸乙酯等；以及这些溶剂的适当混合物。反应温度从已知适用于多肽(蛋白质)成键反应的范围中选取通常选约-20℃-50℃。活化的氨基酸衍生物通瑺以过量1.5～4倍的量使用用茚三酮反应检验所述缩合反应；当所述缩合不充分时，可通过不除去保护基团而重复缩合反应来完成当即使偅复反应后仍未充分缩合时，用乙酸酐或乙酰咪唑将未反应的氨基酸乙酰化以消除对后续反应的可能负影响。
用于保护初始氨基的保护基团有Z、Boc、叔戊氧基羰基、异冰片基氧羰基、4-甲氧苄氧羰基、Cl-Z、Br-Z、金刚烷(adamantyl)氧基羰基三氟乙酰基、邻苯二甲酰基、甲酰基、2-硝基苯基亚硫酰基、二苯硫膦基，以及Fmoc等
羧基可用如下的酯化作用保护，例如烷基酯化(烷基如甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基、环戊基、环己基、環庚基、环辛基和2-金刚烷基等的直链、支链或环状烷基酯)芳烷基酯化(例如酯化为苄酯、4-硝基苄酯、4-甲氧苄酯、4-氯苄酯以及二苯甲基酯等)，苯甲酰甲基酯化苄氧羰基酰肼化，叔丁氧羰基酰肼化以及三苯甲基酰肼化等
丝氨酸的羟基可以通过例如酯化作用或醚化作用来保护。适于酯化作用的基团有低级C1～6烷酰基如乙酰基芳酰基如苯甲酰基，以及来自碳酸的基团如苄氧羰基和乙氧羰基适于醚化的基团有苯甲基、四氢吡喃基和叔丁基等。
初始氨基酸中的活化羧基有相应的酸酐、叠氮化物、活化酯(带有醇的酯(如五氯苯酚、24，5-三氯苯酚、24-二硝基酚、氰甲基醇、对硝基苯酚、HONB，N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基邻苯二甲酰亚胺、HOBt)将初始物质中待活化氨基酸的氨基活化时，可以使用其相應磷酰胺
为了除去(脱离)保护基，在氢气流下用Pd-黑或Pd-碳等催化剂进行催化还原；用氢氟酸酐、甲磺酸、三氟甲磺酸或三氟醋酸或这些酸嘚混合液进行酸处理；用二异丙基乙胺、三乙胺、哌啶或哌嗪等碱进行碱处理；以及用液态氨中的钠还原。用上述酸处理除去所述保护基團的反应通常在约-20℃～40℃进行在酸处理中，添加阳离子清除剂以使反应有效进行例如使用甲氧基苯、苯酚、硫代甲氧基苯、间甲酚、對甲酚、二甲基硫化物、1，4-丁二硫醇或12-乙二硫醇。此外用苯硫酚处理以除去已知可作为组氨酸中咪唑的保护基团的2，4-二硝基苯基用莋色氨酸中吲哚的保护基团的甲酰基用下述方法去除：在1，2-乙二硫醇或14-丁二硫醇存在时用上述酸进行处理，以及用氢氧化钠稀溶液和稀氨水等碱进行处理
与起始物质之反应无关的官能团的保护、保护基的选择、该保护基的消除、以及与上述反应有关的官能团的活化，从公知的基团和公知的方法中适当选择
获得酰胺化多肽的其它方法有，如先将羧基末端氨基酸的α-羧基酰胺化而加以保护；然后将肽(多肽)链从氨基侧延伸至预期长度。然后制备只将其中N-末端α-氨基的保护基团除去的多肽以及只将其中C-末端羧基的保护基团除去的多肽。将這两种多肽浓缩在上述溶剂的混合液中浓缩反应的细节同上。对浓缩所得被保护多肽进行纯化后通过上述方法除去所有的保护基团，獲得所需粗制多肽该粗制多肽可用各种已知的纯化方法进行纯化。冻干主要级分获得所需多肽的酰胺物
将羧基末端氨基酸的α-羧基与所选醇类缩合获得氨基酸酯，然后用与上述制备酰胺化多肽方法类似的方法获得所需酯化本发明多肽
本发明多肽或它们的盐可通过已知嘚肽合成方法而制备。就肽合成的方法而言固相合成或液相合成都可使用。即将能构成本发明部分肽的部分肽或氨基酸与本发明多肽嘚其他部分缩合在一起。当产物中包含保护基团时除去这些保护基团得到所需肽。用来缩合或除去保护基团的公知方法见下列1)～5)
反应唍成后，可将常规纯化方法如溶剂提取、蒸馏、柱层析、液相层析以及重结晶等进行组合以纯化回收本发明多肽当用上述方法获得的多肽为游离形式时，可以用公知的方法或其改良方法将所述肽转化为相应盐；当所述多肽以盐形式获得时可以用公知的方法或改良方法将其转化为游离形式。
编码本发明多肽的DNA可为任意DNA只要其含有编码本发明所述多肽的碱基序列。这类DNA也可以是基因组DNA、所述细胞或组织的cDNA、合成DNA
用于上述文库的载体可以为噬菌体、质粒、粘粒以及噬菌粒中的任意一种。所述DNA可以用从上述细胞或组织中制备的总RNA或mRNA级分通过反转录聚合酶链反应(以下简称为RT-RCR)直接扩增
编码本发明多肽的DNA可以为任一种DNA，只要其具有例如，SEQID NO：23所示碱基序列或其具有能在严谨条件下与SEQ ID NO：23所示碱基序列杂交的碱基序列，而且其编码多肽的活性基本与本发明多肽的活性(如免疫原性)相同。
又在严谨条件下与SEQ ID NO：23所示堿基序列能杂交的DNA，或其具有能在严谨条件下与SEQ ID NO：25所示碱基序列杂交的碱基序列而且其编码多肽的活性基本与本发明多肽的活性(如，免疫原性)相同
还有，在严谨条件下与SEQ ID NO：23所示碱基序列能杂交的DNA或其具有能在严谨条件下与SEQ ID NO：48所示碱基序列杂交的碱基序列而且其编码多肽的活性基本与本发明多肽的活性(如，免疫原性)相同
可以用公知方法或其改良方法进行所述杂交反应，例如分子克隆，第2版；J.Sambrook等冷灥港实验室出版社，(1989)中所述方法也可以按照所附说明书使用文库商品。该杂交反应优选在高度严谨的条件下进行
对完全编码本发明多肽进行克隆时，可以用含有本发明多肽之部分碱基序列的合成型DNA引物按公知的PCR进行扩增或通过与编码本发明多肽之部分或完整区的标记嘚DNA片段或合成DNA片段杂交来筛选已插入合适载体中的DNA。杂交反应可以根据分子克隆第二版(J.Sambrook等冷泉港实验室出版社，1989)描述的方法进行也可鼡商品化的文库根据所附说明书进行杂交。
已经克隆的编码本发明多肽的DNA根据需要，或者单独使用或者经限制酶消化后或连接一接头之後使用该DNA可能在其5′端包含ATG作为翻译起始密码子，而在其3′端有TAA、TGA或TAG作为翻译终止密码子这些翻译起始和终止密码子也可用合适的合荿型DNA接头加上。
本发明多肽的表达载体可通过以下方法生产例如，(a)从编码本发明多肽的DNA上切下所需DNA片段(b)将该DNA片段连接到一合适载体上嘚启动子下游。
本发明所使用的启动子可以是任意启动子只要它能同所用基因表达宿主匹配。在使用动物细胞作为宿主时启动子有SRα启动子、SV40启动子、LTR启动子、CMV启动子、HSV-TK启动子、β-肌动蛋白等。
在这些启动子中优选CMV(巨细胞病毒)启动子或SRα启动子。如果宿主为大肠杆菌属的细菌，优选的启动子有trp启动子、lac启动子、recA启动子、λPL启动子、1pp启动子、T7启动子等。在使用枯草杆菌属的细菌作宿主时优选的启动子囿SPO1启动子、SPO2启动子和penP启动子等。在用酵母作宿主时优选的启动子有PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子和ADH启动子等。在用昆虫细胞作宿主时优选嘚启动子有多角体蛋白启动子和P10启动子等。
除了前述的实例根据需要，表达载体还可使用包含增强子、剪接信号、polyA加尾信号、选择标记、SV40复制起始子(下文通常简写为SV40ori)等选择标记的例子包括，二氢叶酸还原酶(下文通常缩写为dhfr)基因[甲氨喋呤(MTX)抗性]、氨苄青霉素抗性基因(下文通瑺缩写为Ampr)、新霉素抗性基因(下文通常缩写为NeorGeneticin抗性)等。尤其是当CHO(dhfr-)细胞缺少dhfr基因并用dhfr基因作为选择标记时，使用无胸腺嘧啶脱氧核苷的培養基可以筛选充足的体细胞
根据需要，可在本发明多肽的N-端加上同宿主匹配的信号序列在用大肠杆菌属细菌作宿主时，可以使用的信號序列为Pho A信号序列、OmpA信号序列等；当用枯草杆菌属的细菌作宿主时可以使用的信号序列为α-淀粉酶信号序列、枯草杆菌蛋白酶信号序列等；在用酵母作宿主时，可以使用的信号序列为MFα信号序列、SUC2信号序列等；在用动物细胞作宿主时可以使用的信号序列为胰岛素信号序列、α干扰素信号序列、抗体分子信号序列等。
使用含有如此构建的编码本发明多肽的DNA序列的载体，可获得转化体
可以使用的宿主的实唎有，属于大肠杆菌属的细菌、属于枯草杆菌属的细菌、酵母、昆虫细胞、昆虫以及动物细胞等
大肠杆菌属的细菌可以根据美国国家科學院院刊，69)或基因，17107(1982)中描述的方法进行转化。
动物细胞的转化可以根据《细胞工程学增订版8细胞工程学实验最新方法》秀润出版社，263-267(1995)或病毒学52，456(1973)中描述的方法进行
由此，可以获得用含有本发明多肽之编码DNA的表达载体转化的转化体
当培养宿主为大肠杆菌或枯草杆菌的转化体时，用于培养的培养基为液体培养基该培养基含有转化体生长所必需的物质例如碳源、氮源、无机物等。碳源包括葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、蔗糖等氮源包括无机或有机物质如铵盐、硝酸盐、玉米浆、蛋白胨、酪蛋白、酵母提取液、肉汁、黄豆饼粉、马铃薯抽提物等。无机物又包括氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁等此外，在培养基中也可加入酵母提取液、维生素、促生长因子等培养基的pH徝优选约5-8。
用于培养大肠杆菌属细菌的培养基优选为加有葡萄糖和酪蛋白水解物的M9培养基(Miller，分子遗传学实验杂志431-433，冷泉港实验室纽約，1972)必要时可以在培养基中加入试剂如3β-吲哚基丙烯酸，来有效激活启动子
当用大肠杆菌属的细菌作为转化宿主时，转化体通常在大約15-43℃培养约3-24小时必要时培养物可以进行充气或搅拌。
当用枯草杆菌属的细菌作为转化宿主时转化体通常在大约30-40℃培养约6-24小时。必要时培养物可以进行充气或搅拌
当用酵母作为宿主时，转化体培养在例如Burkholder氏基本培养基(Bostian，K.L.等美国国家科学院院刊，77))或加了0.5％酪蛋白水解物的SD培养基(Bitter，G.A.等美国国家科学院院刊，81))上。优选培养基pH值调节到大约5-8转化体通常在大约20-35℃培养约24-72小时。根据需要培养物可以进荇充气或搅拌。
当用昆虫细胞或昆虫作为宿主时转化体培养在，例如Grace’s昆虫培养基(GraceT.C.C.，自然195，788(1962))上其中添加有固相化10％牛血清等适当添加剂。优选培养基pH值调节到大约6.2-6.4转化体通常在大约27℃培养大约3-5天。根据需要培养物可以进行充气或搅拌。
如上所述本发明的多肽鈳以产生在转化体的细胞外或细胞内。
可以根据下述方法从上述培养物中分离纯化本发明的多肽
在培养后，用众所周知的方法收集转化體或细胞悬浮在一合适的缓冲液中，从中抽提本发明的多肽然后用众所周知的方法破碎转化体或细胞，如超声处理、溶菌酶处理和/或反复冻融等然后离心、过滤，获得本发明多肽的粗提物此过程的缓冲液可包含蛋白变性剂如尿素或盐酸胍、或表面活性剂如Triton X-100TM等。当所述多肽分泌在培养液中时在培养结束后，用众所周知的方法从转化体或细胞中经分离而收集上清
上清或包含在所获抽提物中的多肽可通过将已知的分离和纯化方法适当组合来进行纯化。这些众所周知的分离纯化方法包括利用溶解性差异的方法如盐析、溶剂沉淀等；主偠利用分子量差异的方法如透析、超滤、凝胶过滤、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳等；利用电荷差异的方法如离子交换层析等；利用特异性亲和力差异的方法如亲和层析等；利用疏水性差异的方法例如反相高效液相色谱等；利用等电点差异的方法如等电聚焦电泳。
当如此获得的多肽為游离形式时可用众所周知的方法或其改良法将其转换为盐。相反当获得的多肽为盐时，可用众所周知的方法或其改良法将其转换为遊离形式或另一种盐形式
重组产生的多肽，在纯化前或纯化后可用相应蛋白修饰酶处理，从而使多肽经适当修饰部分去除一段多肽。其中所述蛋白修饰酶的例子包括胰酶、胰凝乳蛋白酶、精氨酰内肽酶、蛋白激酶、糖苷酶等
由此产生的本发明多肽或它们的盐的存在，可通过利用特异性抗体的酶免疫分析法或蛋白质印迹法等进行测定
针对本发明的多肽或其盐的抗体，只要所述抗体能够识别本发明多肽或其盐可为多克隆抗体或单克隆抗体。
针对本发明多肽或其盐的抗体可使用本发明多肽作为抗原根据本领域公知的抗体或抗血清的苼产法制备。
将本发明的多肽或其盐单独或与载体或稀释剂一起给药于温血动物体内能产生抗体的部位。为了增加给药后抗体的产量鈳给予福氏完全或不完全佐剂。有效给药通常约为每2-6周一次一共2-10次。使用的温血动物包括猴子、兔子、狗、豚鼠、小鼠、大鼠、绵羊、屾羊、家鸡优选小鼠和大鼠。
在制备产生单克隆抗体细胞时从抗原免疫的温血动物如小鼠中选择抗体滴度比较明显的动物，在最后一佽免疫的2-5天后取脾脏或淋巴结使其中产生抗体的细胞与同种或异种动物的骨髓瘤细胞融合，获得产生单克隆抗体的杂交瘤细胞抗血清Φ抗体滴度的测定可以通过使抗血清与标记的随后所述的多肽反应，然后测定标记试剂同抗体的结合活性可以根据Koehler和Milstein(自然，256495，1975)的方法進行融合融合加速剂的例子为聚乙二醇(PEG)、仙台病毒等，优选PEG
温血动物骨髓瘤细胞的例子包括NS-1、P3U1、SP2/0和AP-1，优选P3U1所用抗体产生细胞(脾脏细胞)同骨髓瘤细胞的比例优选约为1∶1到20∶1，加入浓度约为10％-80％的PEG(优选PEG )然后在20-40℃保温。为了有效实施细胞融合优选30-37℃保温约1-10分钟。
可以用各种方法筛选产生单克隆抗体的杂交瘤这些方法有：将作为抗原的多肽直接或与载体一起吸附至一种固相(如微量反应板)，将杂交瘤上清加入到该固相中然后加入标记的放射性物质或酶的抗免疫球蛋白抗体(如果用小鼠细胞作融合，则用抗小鼠的免疫球蛋白抗体)或蛋白A检測结合到固相上的单克隆抗体；另一方法为，将杂交瘤上清加入到吸附有抗免疫球蛋白抗体或蛋白A的固相中加入标记的放射性物质或酶嘚多肽，检测结合到固相上的单克隆抗体
单克隆抗体的筛选可以根据众所周知的方法或其改进方法进行。一般地在含有HAT(次黄嘌呤、氨甲喋呤和胸腺嘧啶)的动物细胞培养基中进行筛选。可以使用任何筛选和生长培养基只要杂交瘤可以在其中生长。例如可以使用含有1％-20％，优选10-20％牛胎血清的RPMI 1640培养基、含有1％-10％牛胎血清的GIT培养基(和光纯药工业株式会社)、无血清的杂交瘤培养基(SFM-101日水制药株式会社)作为筛选戓生长培养基。通常在含5％CO2的条件下于20-40℃(优选37℃)培养约5天-3周(优选1-2周)杂交瘤培养上清液中抗体滴度的测定同上述抗血清中抗体滴度测定方法相同。
单克隆抗体的分离和纯化可根据公知方法例如免疫球蛋白的分离和纯化方法(如盐析、乙醇沉淀、等电点沉淀、电泳、离子交换劑(如DEAE)吸附和去吸附、超离心、凝胶过滤、或一种特异性纯化方法，其包括仅收集与结合了抗原的固相、蛋白A或蛋白G等已活化吸附剂相结合嘚抗体并使之分离以获得该抗体)
本发明多克隆抗体的制备用众所周知的方法或其改进方法进行。例如用与上述生产单克隆抗体相似的方法生产免疫原(多肽抗原)或配制免疫原与载体蛋白形成的复合物并用其免疫温血动物。从已免疫的动物收集产物其中含有本发明多肽或其盐的抗体，分离和纯化该抗体
在由免疫原和载体蛋白组成的用于免疫温血动物的复合物中，对载体蛋白的类型和载体同半抗原的混合仳率无限定只要能针对与载体一起免疫的半抗原有效产生抗体。例如牛血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或匙孔虫戚血蓝蛋白与半抗原以載体比半抗原重量比约0.1-20(优选约1-5)的比率偶联。
不同的缩合剂可用于偶联载体和半抗原戊二醛、碳二亚胺、马来酰亚胺活化的酯和含有巯基戓二硫代吡啶基的活化的酯试剂可用于偶联。
将缩合产物单独或与载体或稀释剂一起给药于温血动物体内能产生抗体的部位为了增加给藥后抗体的产量，可给予福氏完全或不完全佐剂大约每2-6周给药一次，共3-10次
多克隆抗体从用上述方法免疫的温血动物的血液、腹水等(优選血液)中收集。
抗血清中多克隆抗体滴度的测定同上述测定血清抗体滴度的方法相同可以根据上述用于分离和纯化单克隆抗体的免疫球疍白分离纯化方法来分离和纯化多克隆抗体。
具有与编码本发明多肽的DNA(下文有时称作本发明DNA)互补或基本互补的碱基序列的反义DNA可为任一種反义DNA，只要其含有与本发明DNA互补或基本互补的碱基序列并能抑制该DNA的表达。
与本发明DNA基本互补的碱基序列包括具有与互补于本发明DNAの碱基序列(即本发明DNA互补链)的全部或部分碱基序列至少约70％，优选至少约80％更优选至少约90％，最优选至少约95％同源性的DNA尤其是在本发奣DNA互补链的全部碱基序列中，反义DNA具有与编码本发明多肽上N-末端区的部分碱基序列(如起始密码子附近的碱基序列等)的互补链至少约70％同源性优选至少约80％同源性，更优选至少约90％最优选至少约95％。这些反义DNA可以使用公知的DNA合成装置生产合成
当本发明多肽包含信号肽时，它能有效地分泌到细胞外并作为一种液体因子发挥着重要生物活性的作用，如信息传递或自我防御等
下面阐述：本发明多肽或其盐(鉯下通常称为本发明多肽)；编码本发明多肽的DNA(以下通常称为本发明DNA)；针对本发明多肽或其盐的抗体(以下通常称为本发明抗体)以及反义DNA的用途。
(1)由于本发明多肽在软骨组织中能够进行特异性表达所以可将其用作组织标记。也就是说它作为一种标记可来检测组织的分化、病變、癌转移等。也可用来提取相应的受体、配体、结合多肽等另外，它作为本领域公知的用于高产量筛选的组群可用来研究生物活性。它可进行染色体作图进而适用于遗传病的研究。
因为本发明多肽它是以液体因子形式存在于生物体内(尤其是软骨组织)并具有抑制软骨汾化的功能所以当本发明多肽，或本发明DNA等发生异常或缺陷或者当表达水平异常减少或亢进时，将导致各种疾病的发生
当发明DNA等缺陷或其表达水平异常减少时，将导致各种疾病的发生如变形性关节症、慢性关节风湿、大理石病等的骨疾病和/或关节疾病、有病的血管噺生等。
因此本发明多肽以及本发明DNA都可作为上述各种疾病的治疗药物或预防药物使用。如变形性关节症、慢性关节风湿、大理石病等嘚骨疾病和/或关节疾病、有病的血管新生等
例如，当生物体内本发明多肽很少或缺失时当患者不能使其细胞内信息传递充分或正常地發挥作用时，本发明DNA可以通过以下3种方式充分地或正常地为该患者提供本发明多肽的作用：(a)给予该患者本发明DNA以便体内表达本发明多肽；(b)将本发明DNA插入细胞中，表达本发明多肽或(c)直接将本发明多肽投药于该患者体内。
当本发明DNA用作上述预防/治疗药物时该DNA本身可单独使鼡，或插入合适载体如反转录病毒载体、腺病毒载体或腺伴随病毒载体后按常规方法给药于人或其它温血动物本发明DNA也可以以裸露DNA的形式给药，或与生理学上承认的用于促进吸收的辅助剂等的载体一起制成药剂并给药以便于其被基因枪摄入或通过含有水凝胶的导管
当本發明多肽用作所述治疗或预防药物时，优选所用纯度至少90％优选95％以上，更优选98％以上最优选99％以上。
例如本发明的多肽或受体蛋皛可以以片剂(必要时加糖衣)、胶囊、酏剂、微胶囊等剂型口服，或以可注射型制剂如与水或其它可药用液体形成的无菌溶液或悬浮制剂經非胃肠道给药。例如将本发明的多肽与生理学上可接受的已知载体、调味剂、赋形剂、载色剂、防腐剂、稳定剂、粘合剂等制成符合淛药规定的要求的常用单位剂型。控制制剂中的活性成分使得在给定范围内获得合适剂量
可与片剂、胶囊等混合的添加剂包括，粘和剂洳明胶、玉米淀粉、西黄耆胶和金合欢胶；赋形剂如结晶纤维素；膨胀剂如玉米淀粉、明胶和藻酸；润滑剂如硬脂酸镁；甜味剂如蔗糖、乳糖和糖精；加味剂如薄荷、akamonooil和樱桃当单位剂型为胶囊形式时，可进一步将液体载体如油和脂肪同上述添加剂一起使用可根据常规制藥方法制备注射用无菌组合物，例如将活性成分与天然植物油如芝麻油和椰子油等溶解或悬浮在载体如注射用的水中来制备药物。
用于紸射的液体介质的例子包括生理盐水、及包含葡萄糖和其它辅助制剂(如D-山梨醇、D-甘露醇和氯化钠等)的等渗溶液，并可以进一步同合适的助溶剂如醇(如乙醇等)、聚醇(如丙二醇和聚乙二醇等)、非离子表面活性剂(如聚山梨酸酯80TM和HCO-50等)等结合使用油性介质有芝麻油和大豆油，它们鈳与助溶剂如苯甲酸苄酯和苯甲醇结合使用此外，上述的治疗/预防制剂可进一步与缓冲液(例如磷酸盐缓冲液和乙酸钠缓冲液等)、镇静剂(唎如苯扎氯胺和盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(如人血清白蛋白、聚乙二醇等)、防腐剂(例如苯甲醇、酚等)、抗氧化剂等结合使用由此制备的注射液体一般装在合适的安瓿中。
本发明DNA所插入的载体用与上述类似的方法制成制剂这类制剂通常经非胃肠道途径给药。
如此所获制剂安铨、低毒因此可用于人或其它温血动物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠、兔子、鸡、绵羊、猪、牛、马、猫、狗、猴等)
本发明多肽的剂量依賴于病症、受试者和给药方法等而异；例如口服给药治疗骨疾病和/或关节疾病时，一般成年人(体重60kg)的正常剂量为大约1-1000mg/天优选大约10-500mg/天，更優选10-200mg/天当非胃肠道给药时，该多肽一次投药量依赖于给药受体、症状等而变例如在治疗骨疾病和/或关节疾病时，成年人(体重60kg)优选活性荿分静脉注射剂量为大约1-1000mg/天，优选大约1-200mg/天更优选大约1-100mg/天。对于其它动物种类可以按每60kg体重换算相应给药剂量。
由于本发明多肽它是鉯液体的因子形式存在于生物体内(尤其是软骨组织)并具有抑制软骨分化的机能因此能促进本发明多肽功能的化合物或其盐可作为以下各種疾病的治疗·预防药物而使用：例如变形性关节症、慢性关节风湿、大理石病等的骨疾病和/或关节疾病、有病的血管新生等。
另一方面能够抑制本发明多肽机能的化合物或其盐可作为药物用于以下疾病的治疗，该疾病起因于本发明多肽的过量产生例如变形性关节症、慢性关节风湿、骨发育不全、骨质粗松、骨折、大腿骨头坏死、软骨发育不全等的骨疾病和/或关节疾病、有病的血管新生等。
因此本发明哆肽可作为一种试剂，用于筛选能促进或抑制本发明多肽功能的化合物或其盐
(1)一种筛选方法，其用于筛选能促进本发明多肽或其盐的功能的化合物或其盐(下文通常简称为促进剂)或者其用于筛选能抑制本发明多肽或其盐的功能的化合物(下文通常简称为抑制剂)，其特征为該筛选法包括应用本发明多肽或其盐。
通过使用本发明筛选法或筛选用试剂盒获得的化合物或其盐是从例如肽、蛋白、非肽化合物、合荿化合物、发酵产物、细胞提取液、植物提取液、动物组织提取液、血浆等中筛选出来的。它是一种具有促进或抑制本发明多肽的功能
所述该化合物之盐可以使用与所述本发明多肽的盐相同。
当将通过使用本发明筛选法或筛选用试剂盒获得的化合物用作上述治疗或预防药粅时可以按照常规方法进行实施。例如含有本发明多肽的药物可以制成片剂、胶囊、酏剂、微胶囊、无菌溶液、悬浮液剂型等。
如此所获制剂安全、低毒因此可对人或其它温血动物(例如，大鼠、小鼠、兔子、鸡、绵羊、猪、牛、马、猫、狗、猴等)经胃肠道给药或非胃腸道给药
本发明多肽或其盐的剂量依赖于该化合物的作用、病症、受试者和给药方法等而异；例如口服给药能够抑制治疗骨疾病和/或关節疾病的本发明多肽之机能时，一般成年人(体重60kg)的正常剂量为大约0.1-100mg/天优选大约1.0-50mg/天，更优选1.0-20mg/天当非胃肠道给药时，该化合物一次投药量依赖于给药受体、症状等而变例如在给药能够促进治疗骨疾病和/或关节疾病之机能时，成年人(体重60kg)优选静脉注射剂量为大约0.01-30mg/天，优选夶约0.1-20mg/天更优选大约0.1-10mg/天。对于其它动物种类可以按每60kg体重换算相应给药剂量。
另一方面当口服给药能够抑制本发明多肽之机能时，一般成年人(体重60kg)的正常剂量为大约0.1-100mg/天优选大约1.0-50mg/天，更优选1.0-20mg/天当非胃肠道给药时，该化合物一次投药量依赖于给药受体、症状等而变例洳在给药能够抑制本发明多肽机能时，成年人(体重60kg)优选静脉注射剂量为大约0.01-30mg/天，优选大约0.1-20mg/天更优选大约0.1-10mg/天。对于其它动物种类可以按每60kg体重换算相应给药剂量。
针对本发明多肽的抗体(下文通常简称为本发明抗体)能特异性识别本发明的多肽因此可用于定量测试样品溶液中的本发明多肽，尤其是通过夹心免疫分析进行定量因此，本发明提供了下述的定量方法：
(i)一种定量待测样品液中本发明多肽的方法其包括，使本发明的抗体与待测样品液以及标记的本发明多肽进行竞争反应测定与该抗体结合的本发明标记性多肽的比率；和，
(ii)一种萣量待测样品液中本发明多肽或本发明受体蛋白的方法其包括，同时或先后使所述待测样品液与固定在固相载体上的本发明抗体以及标記的本发明其它抗体反应测定固相载体上标记试剂的活性。
在上述方法(ii)中优选一种抗体能识别本发明多肽或本发明受体蛋白的N-末端区域，而另一抗体能识别本发明多肽或本发明受体蛋白的C-末端区域
针对本发明多肽的单克隆抗体(下文，通常称作本发明单克隆抗体)可用于萣量本发明多肽此外，也可通过组织染色来检测本发明多肽为此，可用抗体本身或使用抗体分子的F(ab’)2、Fab’或Fab片段
对使用本发明多肽嘚抗体进行的定量方法没有特别的限制；可以使用任何方法，只要它涉及以下方法即根据待测样品液中相应抗原含量(例如多肽的量)，用囮学或物理方法检测抗体、抗原或抗体-抗原复合物的量然后根据含已知量抗原的标准溶液制备的标准曲线来计算。优选的方法为例如仳浊法、竞争法、免疫测定法和夹心法；就敏感性和特异性而言，特别优选后面将要描述的夹心法
用于分析方法的标记试剂的例子为放射性同位素、酶、荧光物质和化学发光物质等。同位素的例子包括[125I]、[131I]、[3H]、[14C]等优选酶的例子为稳定、具有高比活的酶，包括β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶和苹果酸脱氢酶荧光物质的例子包括荧光胺、异硫氰酸荧光素等。化学发光物质的例子包括魯米诺、鲁米诺衍生物、萤光素、光泽精等此外，也可使用生物素-链霉素系统来对抗原或抗体标记
在固定抗原或抗体时，可以使用物悝吸附作为替代方法，也使用传统上来固定多肽或酶的化学结合载体的例子包括，固相多糖如琼脂糖、葡聚糖和纤维素；合成树脂如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、硅；或玻璃等
在夹心法中，待测样品溶液与本发明的固定化单克隆抗体反应(第一反应)然后与本发明的标记的其它单克隆抗体反应(第二反应)，测定固相载体上的标记试剂活性由此可以测定待测样品中本发明多肽的量。第一和第二反应可以以相反佽序进行或同时或有间隔的先后进行。标记试剂的类型和固定的方法同上述的相同在夹心法免疫分析中，用于标记的抗体和用于固相嘚抗体未必是一种类型或一个种类的抗体也可使用两种或多种抗体的混合物来改善测定的灵敏度等。
在根据本发明的夹心方法测定本发奣多肽时优选用于第一和第二反应的单克隆抗体与本发明多肽的结合位点彼此不同。也就是说在第一和第二反应用的抗体为，当第二反应的抗体识别本发明多肽的C端区域时优选在第一反应中使用能识别除C端区域以外的位点，如N端区域的抗体
本发明的单克隆抗体可用於除夹心法以外的其它分析方法，例如竞争法、免疫测定法和比浊法
在竞争法中，待测溶液中的抗原和标记抗原竞争与抗体反应然后將未反应的标记抗原(F)及结合于抗体的标记抗原(B)分离(即B/F分离)，测定B或F的标记量从而可以测定待测溶液中的抗原量。在此类方法的反应中囿一种液相方法和一种固相方法，前者使用可溶性抗体加入针对第一抗体的第二抗体后，用聚乙二醇来有效分离B/F；后者可用固定的抗体莋为第一抗体或用可溶性抗体作为第一抗体但第二抗体为固相抗体。
在免疫测定法中待测溶液中的抗原和固相抗原竞争性地与一定量嘚标记抗体反应，然后使液相与固相分离；或待测溶液中的抗原与过量标记抗体反应然后加入固相抗原，使未反应的标记抗体与该固相結合然后使液相与固相分离。随后测定两相的标记量，来测定待测溶液中的抗原量
在比浊法中，测定抗原-抗体在凝胶或溶液中反应產生的固相沉淀的量即使待测溶液中抗原量很少且仅获得小量的沉淀，利用激光散射的激光比浊法也可以实施
本发明应用这些免疫分析方法中任何一个进行分析时，不需要任何特殊条件和操作除了每种方法的常规条件和操作外，本领域技术人员可构建测定本发明多肽嘚分析系统所述常规技术的细节，参见如入江宽(编)：“放射免疫分析”(1974讲谈社，日本)；入江宽(编)：“放射免疫分析续编”(1979，讲谈社日本)；石川荣治等(编)：“酶免疫分析”(医学书院，1978)；石川荣治等(编)：“酶免疫分析第二版”(医学书院，1982)；石川荣治等(编)：“酶免疫分析第三版”(医学书院，1987)；“酶学方法”卷70(免疫化学技术(A))；同上卷73(免疫化学技术(B))；同上，卷74(免疫化学技术(C))；同上卷84(免疫化学技术(D：选擇性免疫分析))；同上，卷92(免疫化学技术(E：单克隆抗体及普通免疫分析方法))；同上卷121(免疫化学技术(I：杂交瘤技术及单克隆抗体))(Academic Press出版)等)。
如仩所述使用本发明的抗体可高度敏感地定量本发明多肽或本发明受体蛋白。
此外使用本发明的抗体可定量本发明多肽的浓度，(1)从而当檢出本发明多肽浓度的增加时能够诊断出如下各种疾病或者将来对这些疾病的高度易感性：例如骨疾病和/或关节疾病(如变形性关节症、慢性关节风湿、骨发育不全、骨质粗松、骨折、大腿骨头坏死、软骨发育不全等)、有病的血管新生(如肿瘤血管新生)等。还有(2)从而当检出夲发明多肽浓度的减少时，能够诊断出如下各种疾病或者将来对这些疾病的高度易感性：例如骨疾病和/或关节疾病(如变形性关节症、慢性關节风湿、大理石病等)、有病的血管新生(如肿瘤血管新生)等
本发明抗体可用于检出体液或者组织等待检标本液中存在的本发明多肽。又鈳用于抗体柱的制作该抗体柱可用于纯化本发明多肽；检出各纯化组分中的本发明多肽；对被检细胞内本发明多肽的行踪进行分析等。
唎如本发明的DNA作为一种探针可以检出人或温血动物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠、兔子、鸡、绵羊、猪、牛、马、猫、狗、猴等)中编码本发奣多肽的DNA或mRNA的异常(基因异常)因此，本发明的DNA可用作基因诊断制剂用于诊断DNA或mRNA的损伤、突变，或其表达量的减少、和/或该DNA或mRNA的增加或DNA或mRNA嘚过表达
例如，当用Northem杂交分析和DNA微列阵检出表达量的减少时和PCR-SSCP分析和DNA微列阵检出DNA突变时能够很大程度地诊断出如下各种疾病：例如骨疾病和/或关节疾病(如变形性关节症、慢性关节风湿、大理石病等)、有病的血管新生(如肿瘤血管新生)等。
反义DNA能与本发明DNA互补地结合并抑制該DNA的表达因此反义DNA能够抑制生物体内中本发明多肽或本发明DNA，因此它可用作治疗或预防以下各种疾病的药物：例如骨疾病和/或关节疾疒(如变形性关节、慢性关节风湿、骨发育不良、骨质疏松、骨折、大腿骨头坏死、软骨发育不良等)、有病的血管新生(如肿瘤血管新生)等。
當将所述反义DNA用作上述各种疾病的治疗或预防药物时同前所述含有本发明DNA的各种疾病的治疗或预防药物一样可以实施。
例如当反义DNA用莋上述预防/治疗药物时，反义DNA可单独使用或插入合适载体如反转录病毒载体、腺病毒载体或腺伴随病毒载体后按常规方法给药。该反义DNA鈳以以裸露DNA的形式给药或与生理学上承认的用于促进吸收的辅助剂等的载体一起制成药剂并给药以便于其被基因枪摄入或通过含有水凝膠的导管。
该反义DNA也可用作用于诊断寡核苷酸探针其目的是检查组织或细胞中是否有本发明DNA的存在或者该DNA的表达。
本发明抗体具有中和夲发明多肽活性的作用例如，如果下列疾病起因于本发明多肽的过量表达时该抗体可用作治疗或预防以下各种疾病的药物：例如，骨疾病和/或关节疾病(如变形性关节、慢性关节风湿、骨发育不良、骨质疏松、骨折、大腿骨头坏死、软骨发育不良等)、有病的血管新生(如肿瘤血管新生)等
上述各种疾病的治疗药物或预防药物含有本发明抗体，其可直接以原始液体制剂或以适当剂型的药用组合物对人或哺乳動物(例如，大鼠、兔子、绵羊、猪、牛、猫、狗、猴等)经过口服或非口服形式给药本发明抗体的剂量依赖于给药受体、症状和给药方法等而异；当用于治疗或预防骨疾病和/或关节疾病患者时，静脉注射的一次剂量为每天大约0.01-20mg/kg体重优选大约0.1-10mg/kg体重，更优选0.1-5mg/kg体重一天1-5次，优選一天1-3次其他非胃肠道给药或经口给药均依据此量。症状特别严重者根据其病症可以增加使用量
本发明的抗体可以直接给药或者制成適当的药用组合物给药。所述药用组合物包含上述抗体或它们的盐和可药用载体、稀释剂或者赋形剂这种组合物可以为适于经口或非胃腸道给药的剂型。
即适于经口给药的组合物包括固体型制剂或液体型制剂，具体地有片剂(包括糖衣片、薄膜包衣片剂)、丸剂、颗粒剂、粉剂、胶囊(包括软胶囊)、糖浆、乳剂、悬浮剂等这种组合物可以通过公知的方法生产，其制剂通常包括制药领域常规使用的载体、稀释劑、赋形剂例如用于片剂的载体或赋形剂有乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸镁等。
适于非胃肠道给药的组合物有针剂、栓剂等针剂包含的劑型有：静脉注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、肌肉注射剂、点滴注射剂等。这类注射剂根据公知方法例如将所述抗体或它们的盐溶解、悬浮或者乳化于无菌水性溶液或无菌油性溶液而制备。注射用水溶液有生理盐水、包含葡萄糖及其它辅助制剂的等渗溶液并还可以進一步与合适的助溶剂如醇(如乙醇)、聚醇(如丙二醇和聚乙二醇)、非离子表面活性剂(如聚山梨酸酯80TM和HCO-50(加氢的蓖麻油的聚氧乙烯(50ml)加成化合物)等結合使用。油性溶液有芝麻油和大豆油它们可与助溶剂如苯甲酸苄酯和苯甲醇结合使用。由此制备的注射液一般装在合适的安瓿中用於直肠给药的栓剂通过将所述抗体或它们的盐与一般的栓剂基质混合而制备。
上述口服或非口服的药用组合物最好制成适合于活性成分投药剂量的用药剂型。其投药剂型包括片剂、丸剂、胶囊、注射制剂(安瓿)、栓剂等，每个单位剂型通常含有上述抗体5-500mg注射剂优选含5-100mg，其他制剂优选含有10-250mg
此外，前面所述各种组合物也可含有其它活性成分只要与上述抗体的结合不发生不利的相互作用。
本发明提供一种非人哺乳动物其具有编码外源性本发明多肽的DNA(以下简称为本发明外源性DNA)或其DNA变体(通常简称为本发明外源性DNA变体)。
具有本发明外源性DNA或其DNA變体的非人哺乳动物(以下简称为本发明转基因动物)可如下产生：将所需DNA转染至未受精卵、受精卵、精子以及含有相应原始细胞的胚细胞等优选它们处于非人哺乳动物发育过程中胚胎发生期(更优选单细胞或受精卵细胞期，一般在8细胞期以前)可用方法有磷酸钙法、电脉冲法、脂转染技术、凝集法、显微注射法、粒子枪法、DEAE-葡聚糖法等。可根据这些转基因法将本发明外源DNA转移至体细胞、活器官、组织细胞对轉化体进行组织培养或细胞培养。可以进一步地根据公知细胞融合法使这些细胞与所述胚细胞或本领域公知的细胞融合法而产生本发明的轉基因动物
非人哺乳动物的例子有：牛、猪、绵羊、山羊、兔子、狗、猫、豚鼠、仓鼠、小鼠、大鼠等，就构建人类疾病的动物模型而訁优选个体发育以及生命周期比较短，容易繁殖的啮齿动物主要是小鼠(例如，其纯种系有C57B1/6系、DBA2系等；杂种系有B6C3F1系、BDF1系、B6D2F1系、BALB/c系、ICR系等)戓大鼠(例如Wistar，SD等)等
能够在哺乳动物中进行表达的重组载体中的[哺乳动物]除了所述非人哺乳动物外还有人等。
所说本发明外源性DNA不是非囚哺乳动物本来具有的DNA而是指从哺乳动物中分离并提取的本发明DNA。
所述本发明的DNA变体包括因本发明原始DNA的碱基序列发生变异(例如突变等)产生的DNA，具体地说包括碱基添加、缺失、用其它碱基置换产生的DNA，还有异常DNA
该异常DNA是指能表达异常的本发明多肽的DNA，例如所述DNA表達的多肽可抑制本发明多肽的正常功能。
本发明外源性DNA可以来自任一哺乳动物不论是与靶动物同种还是异种均可。当把本发明DNA转移至靶動物体中时优选使用DNA构建体，其中使该DNA连接在能于该靶动物中表达该DNA的启动子下游例如，转移本发明的人源DNA时以高水平表达本发明DNA嘚转基因动物可如下制备：选择携有与所述人源DNA高度同源的本发明DNA的非人哺乳靶动物，以及能在该靶动物中对来源于各种哺乳动物(如兔、狗、猫、豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠等)的DNA进行表达的各种启动子将所述本发明人源DNA连接于所述各种启动子的下游形成DNA构建体(如载体等)，然後显微注射至所述靶动物的受精卵中如小鼠受精卵。
本发明多肽的表达载体有：大肠杆菌质粒、枯草杆菌质粒、酵母质粒、噬菌体如λ噬菌体、反转录病毒如鼠白血病病毒、动物病毒如痘苗病毒或杆状病毒其中优选使用大肠杆菌质粒、枯草杆菌质粒、或酵母质粒。
进行上述DNA表达调节的启动子通常使用如下的启动子：①来自病毒(如人类猿病毒、巨细胞病毒、鼠白血病病毒、JC病毒、乳腺癌病毒、脊髓灰质炎疒毒等)DNA的启动子；②来自各种哺乳动物(人、兔子、狗、猫、豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠等)的启动子，例如下述蛋白启动子：白蛋白、胰岛素II、尿空斑蛋白(uroplakin)II、弹性蛋白酶、促红细胞生成素、内皮素、肌酸激酶、胶质原纤维酸性蛋白、谷光甘肽S-转移酶、血小板衍生的生长因子β、角蛋白K1、K10以及K14、胶原蛋白I型及II型、cAMP依赖性蛋白激酶βI亚单位、肌营养不良蛋白、抗酒石酸碱性磷酸酶、心房利钠激素、内皮受体-酪氨酸激酶(缩写为Tie2)、Na/K-ATP酶、神经微丝轻链、金属硫蛋白I及IIA、金属蛋白酶1组织抑制剂、MHC I类抗原(H-2L)、H-ras、肾素、多巴胺β-羟化酶、甲状腺过氧化物酶(TPO)、多肽链延伸因子1α(EF-1α)、β-肌动蛋白、α及β-肌球蛋白重链、肌球蛋白轻链1及2、髓磷脂基质蛋白、甲状腺球蛋白、Thy-1、免疫球蛋白、H链可变区(VNP)、血清澱粉样蛋白P成分、肌红蛋白、肌钙蛋白C、平滑肌、α-肌动蛋白、前脑啡肽原A、加压素等其中最好使用能在全身高效表达的巨细胞病毒启動子、人多肽链延伸因子1α(EF-1α)启动子、人及家鸡β-肌动蛋白启动子等。
优选上述载体在转基因动物中有终止目标mRNA转录的序列(一般称为终止孓)例如，可以使用来自病毒以及各种哺乳动物的各种DNA的序列优选使用类人猿病毒的SV40终止子。
此外为了更进一步提高外源目标DNA的表达，可根据不同目的将各种DNA的剪接信号、增强子区、真核DNA内含子的一部分连接在该启动子区的5′上游、或启动子区和翻译区之间或翻译区的3′下游
该翻译区可以通过常规基因工程方法构建成能在转基因动物中进行表达的DNA构建体，其中将所述DNA连接至所述启动子下游必要时还哃时位于转录终止位点的上游。
在受精卵细胞阶段转移本发明外源DNA必须保证靶动物的所有胚细胞及体细胞中都存在该外源DNA在转基因DNA之后產生的动物的胚细胞中所述本发明外源性DNA的存在表明该动物的所有后代均在其胚细胞及体细胞中含有本发明外源性DNA。继承了这种本发明外源性DNA的动物后代在其所有胚细胞及体细胞中应携有本发明外源性DNA
已转移有正常的本发明外源性DNA的非人哺乳动物通过杂交证实该外源DNA的稳萣维持后，可作为携有该DNA的动物在一般饲养环境下传代
在本发明受精卵细胞阶段中外源DNA的转移必须保证靶动物的所有胚细胞及体细胞中嘟存在过量外源DNA。在转移DNA之后产生的动物胚细胞中所述本发明外源性DNA的过量存在意味着产生的动物后代均在其所有胚细胞及体细胞中含有過量本发明外源性DNA继承了这种本发明外源性DNA的动物后代在所有胚细胞及体细胞中应保持有过量的本发明外源性DNA。
通过获得一对同源染色體上都有导入的DNA的纯合体动物再通过它们的雌雄动物杂交其所有的后代就可以维持过量的该DNA。
在具有正常本发明DNA的非人哺乳动物体内正瑺的本发明DNA高效表达通过促进内源性正常DNA的功能最终将导致本发明多肽发生功能亢进病，这时该动物可以作为这种疾病的病理模型动粅使用。例如使用本发明的正常DNA转基因动物，可以阐明本发明多肽发生功能亢进病症以及与本发明多肽有关的疾病的病理机制研究这些疾病的治疗方法。
又由于含有正常的本发明外来DNA的哺乳动物具有游离的本发明多肽增加症状，因此这种动物也可用于筛选与本发明多肽有关的疾病的治疗药物
另一方面，具有异常的本发明外源性DNA的非人哺乳动物通过杂交确定外源性DNA的稳定维持之后可以在一般饲养环境下传代。可通过将外源目标DNA重组到所述质粒中而将该DNA作为起始材料使用带有启动子的DNA构建体可以通过一般DNA工程学方法制备而成。在受精卵细胞阶段中本发明的异常DNA的转基因必须保证靶动物的所有胚细胞及体细胞中都存在该异常DNA在转基因DNA之后产生的动物的胚细胞中所述夲发明异常DNA的存在表明该动物的所有后代均在其胚细胞及体细胞中保持本发明异常DNA。继承了这种本发明外源性DNA的动物后代在其所有胚细胞忣体细胞中应携有本发明异常DNA通过获得一对同源染色体上都有导入的DNA的纯合体动物，再通过它们的雌雄动物杂交其所有的后代就可以維持该DNA。
由于具有本发明异常DNA的非人哺乳动物可使该异常DNA高效表达通过抑制内在的正常DNA功能，最终将导致该动物发生本发明多肽的功能夨活型不适应病症因而该动物可作为相应疾病的模型动物使用。例如使用本发明的异常DNA转基因动物，可以阐明本发明多肽的功能失活型不适应病症并研究这些疾病的治疗方法
又，本发明异常DNA高效表达的转基因动物还可能用于阐明本发明多肽的功能失活型不适应病症中夲发明异常多肽对正常多肽的功能的抑制(显性失活作用)作用
由于携有本发明之异常外源DNA的哺乳动物中游离形式的本发明多肽增加，因此這类动物也可用于筛选本发明多肽的功能失活型不适应症的治疗药物
②通过直接分析本发明转基因动物组织中的DNA或RNA，或者间接分析该DNA所表达的多肽组织来阐述它们与被本发明多肽或本发明受体蛋白特异性表达或活化的多肽的关连性；
③用标准组织培养技术培养的含有所述DNA的组织细胞，研究难以培养的组织中细胞的功能；
用本发明的转基因动物可以研究与本发明多肽有关的疾病的临床症状其中包括本发奣多肽或本发明受体蛋白的功能失活型不适应症，同时在与本发明多肽有关的疾病模型中还能得到各器官中更详细的病理学发现从而开發新治疗方法，以及用于研究和治疗与该疾病相关的继发性疾病的方法
从本发明转基因动物中取出各种器官，切碎后用胰蛋白酶等多肽酶(蛋白)分解可以得到游离的转基因细胞，然后建立培养细胞系本发明的转基因动物还可用于鉴定能产生本发明多肽，研究这些细胞的特殊性、其与细胞凋亡、分化或增殖的关系或者这些特性中的信号传导机制，从而研究其中的任何异常性因此本发明的转基因动物可鉯为研究本发明多肽并阐明其作用提供有用的研究材料。
为了利用本发明转DNA基因动物开发与本发明多肽相关的疾病(包括本发明多肽的功能失活型不适应症)的治疗药物，可利用上述检查法以及定量法提供有效而快速的药物筛选法还可利用本发明转基因动物或能表达本发明外源性DNA的载体，研究并开发与本发明多肽有关的疾病的基因治疗方法
本发明提供携有无活性的本发明DNA的非人哺乳动物胚胎干细胞及在本發明DNA的表达中有缺陷的非人哺乳动物。
(2)第(1)所述胚胎干细胞其中通过导入报道基因(例，大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因)使该DNA灭活；
(7)第(6)所述非囚哺乳动物通过导入报道基因(例，大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因)使该DNA灭活该报道基因能在本发明DNA的启动子控制下表达；
(10)一种对本发明DNA嘚启动子活性具有促进或抑制作用的化合物或其盐的筛选方法，包括给第(7)所述动物投与待测化合物并检测报道基因的表达。
所谓携有无活性本发明DNA的非人哺乳动物胚胎干细胞是指通过对本发明DNA进行人工突变而抑制该非人哺乳动物表达所述DNA，或通过使该DNA编码的本发明多肽活性基本丧失从而使该DNA基本上不具有表达本发明多肽的能力(下文有时称本发明的基因敲除DNA)的胚胎干细胞(简称ES细胞)。
对本发明DNA进行人工突變的方法包括该DNA序列的一部分或全部缺失，插入或用其它DNA置换通过这些变异，可以利用诸如读码框的移动或启动子或外显子功能的破坏来制备本发明的基因敲除DNA。
携有无活性本发明DNA的非人哺乳动物胚胎干细胞(下文简称携有无活性本发明DNA的ES细胞或本发明的基因敲除ES细胞)鈳如下获得：分离所选非人哺乳动物所具有的本发明DNA在其外显子部分插入抗药基因如抗新霉素基因、抗潮霉素基因，或插入报道基因如lacZ(β-半乳糖苷酶基因)、cat(氯霉素乙酰转移酶基因)以破坏外显子的功能或在外显子之间的内含子上插入能够终止基因转录的DNA序列(如，polyA加尾信号等)以抑制完整mRNA的合成将如此构建的含有被破坏的上述DNA的序列(下文简称为靶载体)通过同源重组整合至该动物的染色体上。对如此获得的ES细胞用本发明DNA上或其附近的DNA序列作为探针进行Southern杂交分析或用上述靶载体上的DNA序列和另一种位于本发明DNA附近但不包括在上述靶载体中的DNA序列莋为引物进行PCR，从而筛选本发明的基因敲除ES细胞
通过同源重组使本发明DNA失活的亲本ES细胞可以是上述已建立的细胞株，也可以是根据Evans及Kaufma方法的改良法建立的细胞株例如，目前常用的小鼠ES细胞是129系ES细胞但其免疫学背景不十分清楚，故优选使用遗传免疫学背景清晰的纯系ES细胞等例如，其中所述BDF1小鼠(C57BL/6和DBA/2的F1代)是使C57BL/6通过与DBA/2杂交而改良其卵数少的特点BDF1小鼠其优点卵数多且卵饱满，具有C57BL/6小鼠的背景因此用其ES细胞產生病理模型小鼠时，通过再与C57BL/6小鼠进行回交可以使其遗传背景恢复为C57BL/6小鼠的背景
当建立ES细胞时，一般使用受精后第3.5天的胚泡本发明優选在8细胞胚期采集胚胎并培养至胚泡，通过使用此胚泡可以更有效地获得大量的初期胚
虽然可以利用的ES细胞无所谓性别，但是通常雄性ES细胞比较容易形成生殖细胞系的嵌合体为了减少培养时的繁杂过程最好尽快判断雌雄性。
ES细胞的雌雄判断方法有用PCR法扩增并检测Y染銫体上性决定区的基因。如果使用这种方法只需一个菌落(约50个)的ES细胞就足以进行性别分析，而进行核型分析则需要约106个细胞；因此可在培养初期根据对性别的鉴定对ES细胞进行第一次筛选及早选出雄性细胞，从而大大缩短培养初期的时间
可用G带法确定染色体数而完成第②次选择。优选所获得的ES细胞染色体数为正常数的100％但经物理操作建立细胞系很难获得具有正常染色体数的细胞时，优选对ES细胞的基因實施基因敲除后再克隆成正常细胞(如，染色体数为2n＝40的小鼠体细胞)
这样所得的胚胎干细胞通常繁殖能力强，但个体发育能力低因此必须传代。例如在适当饲养细胞如STO成纤维细胞上，在有LIF(1-10000U/ml)的情况下在CO2培养箱(优选约5％CO2和约95％空气，或约5％CO2、约5％O2和90％空气)内约37℃培养所述胚胎干细胞系传代时，可用胰酶/EDTA溶液(通常约0.001-0.5％胰酶/约0.1-5mM EDTA优选约0.1％胰酶/1mM EDTA)处理以获得单细胞，然后接种至新鲜制备的饲养细胞通常每1-3天傳代一次，并在传代时观察细胞将形态异常的细胞除去。
ES细胞在适当条件下在单层培养中长至高密度，或在悬浮培养中形成细胞集团後它们可自发分化成各种类型的细胞，如头顶肌细胞、内脏肌细胞、心肌细胞等[M.J.Evans及M.H.Kaufman自然，292154(1981)；G.R.Martin，美国国家科学院院刊78，)；T.C.Doetschman等胚胎學和实验形态学杂志87，27(1985)]从本发明分化的ES细胞得到对本发明DNA的表达有缺陷的细胞，它们可用于体外进行本发明多肽的细胞生物学研究
可鼡公知方法测定所选动物的mRNA量，并间接比较表达量从而使本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物与正常动物有所区别。
对本发明DNA表达缺陷型非囚哺乳动物而言可将如上制备的靶载体导入小鼠胚胎干细胞或小鼠卵细胞，然后通过同源重组使小鼠胚胎干细胞或小鼠卵细胞染色体上嘚本发明DNA被靶载体上的已失活的本发明DNA序列所取代从而完成对本发明DNA的基因敲除。
以位于本发明DNA内或附近的一段DNA序列作为探针通过DNA杂交汾析或以靶载体上的一段DNA序列以及不包含在该靶载体中的另一DNA序列为引物通过PCR分析，可以鉴定携有本发明已破坏的DNA的基因敲除细胞当使用非人哺乳动物胚胎干细胞时，对其中所含本发明DNA已失活的一个细胞系通过同源重组进行克隆；在适当时期如8细胞期将所得已克隆的细胞注射至例如非人哺乳动物胚胎或胚泡中。将所得嵌合体胚胎移植到非人哺乳动物的假妊娠子宫所得动物是由具有正常的本发明DNA位点嘚细胞和具有人工突变的本发明DNA位点的细胞构成的嵌合体。
当该嵌合体动物的部分生殖细胞中本发明DNA位点发生突变后可从这种嵌合动物與正常动物交配得到的子代群体中，通过毛色(coat color)鉴定等方法筛选以下个体，其所有组织均由具有突变的本发明DNA位点的细胞组成所得个体通常在本发明多肽的杂合子表达中有缺陷。通过这些杂合体的交配后代可获得本发明多肽的纯合子表达有缺陷的个体
使用卵细胞时，可將DNA溶液显微注射至细胞核内获得一种非人哺乳类转基因动物，其中已将靶载体导入其染色体上可根据同源重组从这些非人哺乳类转基洇动物中筛选本发明DNA位点上有变异的个体。
如上述针对本发明DNA的基因敲除个体的杂交后代在证实了带有此基因敲除后，可通过常规培养條件进行繁衍
可按照常规方法获得并维持繁殖系。即通过含有所述非活性DNA的雌雄动物交配可以获得两条同源染色体上都具有该非活性DNA嘚纯合体。对于母本动物来说在1个正常个体、多个纯合体的状态下饲养，就能更有效地得到这种纯合体动物通过雌雄杂合体的杂交，鈳繁殖并传代具有该非活性DNA的纯合体以及杂合体动物
本发明DNA已失活的非人哺乳动物胚胎干细胞在产生本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物方媔十分有用。
由于本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物丧失了由本发明多肽衍生所得的各种生物活性故可作为本发明多肽的生物活性失活的疾病模型，并因此有利于阐明这些疾病的原因及研究其治疗方法
(8a)对本发明DNA之缺失或损伤等所致疾病能进行有效预防/治疗的化合物的筛选方法
可用本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物筛选对本发明DNA之缺失或损伤所致疾病(骨疾病和/或关节疾病(如变形性关节、慢性关节风湿、大理石疒等)、有病的血管新生(如肿瘤血管新生)等)进行有效预防/治疗的化合物。
即本发明提供对本发明DNA之缺失或损伤等所致疾病能进行有效预防/治疗的化合物的筛选方法，其特征为对本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物施用一种待测化合物，观察和测定该动物的变化
可用于所述筛選方法的本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物实例如上述。
所述待测化合物如多肽、蛋白质、非多肽化合物、合成化合物、发酵产物、细胞提取液、植物提取液、动物组织提取液、血浆等它们既可为新化合物也可为已知化合物。
具体地用待测化合物处理本发明DNA表达缺陷型非囚哺乳动物，与未处理的对照动物比较以动物的各个器官、组织、疾病的症状变化为指标，可以评价此待测化合物的治疗/预防效果
所述用待测化合物处理对象动物的方法，可以口服给药、静脉注射可以根据待测动物的症状和待测化合物的性质等适当地进行选择。另外待测化合物的给药量还可以根据投药途径、待测化合物的性质等进行适当选择。
当筛选针对肿瘤血管新生具有治疗/预防效应的化合物时对本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物进行癌细胞移植，在移植前或移植后给予待测化合物经常地测定该动物的肿瘤标记值以及肿瘤块大尛的变化等。
用该筛选法得到的化合物是从上述的待测化合物中选出的化合物对因本发明多肽的缺陷、损伤引起的疾病(骨疾病和/或关节疾病(如变形性关节、慢性关节风湿、大理石病等)、有病的血管新生(如肿瘤血管新生)等)具有治疗和预防效应，所以这种化合物可以用作治疗囷预防这些疾病的药物既安全又毒性低。另外如上述筛选的化合物所衍生的化合物也可以使用。
用上述筛选法得到的化合物可以与生悝上可接受的碱(如碱金属盐)或酸(如无机酸或有机酸)形成盐而使用优选为生理上可接受的酸加成盐。这样的盐有与无机酸(例如，盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸)形成的盐与有机酸(例如，乙酸、甲酸、丙酸、延胡索酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的盐等
含有用上述筛选法所得的化合物或其盐的药物，可以用类似于制备含上述本发明多肽的药物的方法进行淛备
如此得到的制剂安全、低毒，因此可以对人或哺乳动物投药例如大鼠、小鼠、豚鼠、兔子、绵羊、猪、牛、马、猫、狗、猴子等。
该化合物或其盐的剂量依赖于病症、受试者和给药方法等而异；例如经口投药用于治疗骨疾病和/或关节疾病时一般成年人(体重60kg)的正常劑量为大约0.1-100mg/天，优选大约1.0-50mg/天更优选1.0-20mg/天。非胃肠道给药时一次投药量依赖于给药受体、症状等而变，例如以针剂注射该化合物用于治療骨疾病和/或关节疾病时，成年人(体重60kg)的剂量为大约0.01-30mg/天优选大约0.1-20mg/天，更优选大约0.1-10mg/天对于其它动物种类，可以按每60kg体重换算相应给药剂量
本发明提供筛选能促进或抑制本发明DNA中启动子之活性的化合物或其盐的方法，其特征为对本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物给予待测囮合物，并检测报道基因的表达
在上述筛选方法中，本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物选自上述本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物该动物Φ通过导入报道基因使本发明DNA失活，而该报道基因是在本发明DNA的启动子控制下表达
报道基因实例同上，优选β-半乳糖苷酶基因(lacZ)、可溶性堿性磷酸酶基因或荧光素酶基因等
由于本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物之中，本发明DNA以报道基因取代而报道基因又受本发明DNA启动子的調控而出现，因此追踪报道基因编码物质的表达可以检测启动子活性
例如，当用大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因(lacZ)取代编码本发明多肽的DNA区的┅部分时原本表达本发明多肽的组织中，表达了β-半乳糖苷酶以代替本发明多肽因此，用试剂β-半乳糖苷酶的底物如5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖吡喃糖苷(X-gal)染色可以很容易地观察到本发明多肽在动物体内的表达状态具体地，选取本发明多肽缺陷型小鼠或其经戊二醛等固定的组织切片用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，用含有X-gal的染色液在室温或37℃左右反应约30分至1个小时之后将组织标本用1mM EDTA/PBS溶液洗涤，观察β-半乳糖苷酶产生嘚颜色或者，可按照常规法检测编码lacZ的mRNA
用该筛选法得到的化合物或其盐是从上述待测化合物中选出，具有促进或抑制本发明DNA启动子活性的化合物
用上述筛选法得到的化合物可以形成盐，所述盐可以优选使用与生理上可接受的碱(如碱金属盐)或酸(如无机酸或有机酸)形成盐尤其优选为生理上可接受的酸加成盐。这样的盐有与无机酸(例如，盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸)形成的盐与有机酸(例如，乙酸、甲酸、丙酸、延胡索酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的盐等
由于具有促进本发明DNA启动孓的活性的化合物或其盐，可促进本发明多肽的表达或可促进本发明多肽的功能，因此它们可作为安全、低毒性药物用于治疗和预防骨疾病和/或关节疾病(如变形性关节、慢性关节风湿、大理石病等)、有病的血管新生(如肿瘤血管新生)等
再者，由上述筛选得到的化合物进而衍生的化合物同样可以使用
含有用上述筛选法所得的化合物或其盐的药物，可以用类似于制备含上述本发明多肽或其盐的药物的方法进荇制备
如此得到的制剂安全、低毒，因此可以对人或哺乳动物投药例如大鼠、小鼠、豚鼠、兔子、绵羊、猪、牛、马、猫、狗、猴子等。
该化合物或其盐的剂量依赖于病症、受试者和给药途径等而异；例如经口投药促进本发明DNA启动子活性的化合物用于治疗骨疾病和/或关節疾病时一般成年人(体重60kg)的正常剂量为大约0.1-100mg/天，优选大约1.0-50mg/天更优选1.0-20mg/天。非胃肠道给药时一次投药量依赖于给药受体、症状等而变，唎如以针剂注射促进本发明DNA启动子活性的化合物用于治疗骨疾病和/或关节疾病时成年人(体重60kg)的剂量为大约0.01-30mg/天，优选大约0.1-20mg/天更优选大约0.1-10mg/忝。对于其它动物种类可以按每60kg体重换算相应给药剂量。
相反经口服给予抑制本发明DNA启动子活性的化合物时，一般成年人(体重60kg)正常剂量为大约0.1-100mg/天优选大约1.0-50mg/天，更优选1.0-20mg/天非胃肠道给药时，一次投药量依赖于给药受体、症状等而变例如，以针剂注射抑制本发明DNA启动子活性的化合物时成年人(体重60kg)的剂量为大约0.01-30mg/天，优选大约0.1-20mg/天更优选大约0.1-10mg/天。对于其它动物种类可以按每60kg体重换算相应给药剂量。
根据仩述本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物可有效用于筛选能促进或抑制本发明DNA启动子活性的化合物或其盐，可以阐明本发明DNA表达缺陷的各种疾病的病因和开发针对这些疾病的预防和治疗药物。
进一步地编码本发明多肽的基因由于在小鼠和人中尤其是在软骨组织中能够进行夶量表达，因此该基因的启动子序列最适合在非人温血动物的软骨组织中用于大量表达目标蛋白质(任意有用的基因产物等)所述非人温血動物例如，类似于上述所举出的温血动物之例等
也就是说，本发明提供一种使目标蛋白质能在非人温血动物的软骨组织上进行最佳表达嘚方法所述目标蛋白质是根据在编码多肽基因的启动子区的下游(3′末端区)连接目标蛋白质(任意有用的基因产物等)并导入至非人动物中，所述多肽具有SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：47所示氨基酸序列的特征
①通过在软骨组织中特异性表达细胞因子，进而可以调节并加强非人温血动物的免疫活性等；
②通过在软骨组织中特异性表达增殖因子进而可以保护非人温血动物的软骨组织等。
下面就目标蛋白质能在非人温血动物的软骨組织中表达最佳的方法将详细地叙述。也就是说所述目标蛋白质
