ELISA方法被广泛用于各种抗原和抗体测定。但ELISA测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在临床检验中如果处理不当，会出现一些错误结果（即假阳性或假阴性结果）。引起ELISA测定错误结果的原因主要有
内容载入中...
ELISA方法被广泛用于各种抗原和抗体测定。但ELISA测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在临床检验中如果处理不当，会出现一些错误结果（即假阳性或假阴性结果）。引起ELISA测定错误结果的原因主要有：（1）标本因素；（2）操作因素；（3）试剂因素；本文主要就标本因素和操作因素对ELISA测定的影响做如下讨论：
1 标本因素：
血清是最常用的 ELISA标本，血浆一般可视为与血清同等的标本，标本引起的假阳性和假阴性结果主要是干扰性物质所致，分为内源性干扰物质和外源性干扰物质两种。
1.1&& 内源性干扰物质
有人认为大约40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果。常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠 Ig (s)抗体、交叉反应物质和其它物质等。
1.1.1& 类风湿因子& 人血清中IgM、IgG型类风湿因子（RF）可以与ELISA系统中的捕获抗体及酶标记二抗的FC段直接结合，从而导致假阳性。解决该情况的办法是：①用F(ab)2替代完整的 IgG；②标本用偶联有热变性（63℃，10 min）IgG的固相吸附剂处理（将热变性IgG加入到标本稀释液中同样有效）；③检测抗原时，可用2-巯基乙醇等加入到标本稀释液中，使RF降解。
1.1.2& 补体 能够与固相一抗，标记二抗 Fe结合或影响它们的结合而造成假阳性。解决的办法是：①用 EDTA稀释标本；②用56℃，30 min加热血清使C1q灭活[1]。
1.1.3& 嗜异性抗体& 人类血清中含有能与啮齿类动物（如鼠等）Ig (s) 结合的天然嗜异性抗体，可将ELISA系统中一抗和二抗连接起来，也能造成假阳性。解决的办法是：可在标本稀释液中加入过量的动物Ig (s) ，但加入量不足或亚类不同时无效。
1.1.4& 嗜靶抗原的自身抗体& 抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素等嗜靶抗原的自身抗体，有时能与靶抗原结合形成复合物，在ELISA方法中均可干扰抗原抗体测定结果。为避免以上情况出现，测定前需用理化方法将其解离后再测定。
1.1.5& 医源性诱导的抗鼠 Ig (s) 抗体& 临床采用鼠源性CD3等单克隆抗体治疗，用放射性同位素标记鼠源性抗体的影像诊断及靶向治疗等新技术，均有可能使这些病人体内产生抗鼠抗体；另外，被鼠等啮齿类动物咬伤的病人体内也可以产生抗鼠 Ig (s) 抗体，ELISA测定时均可产生假阳性。解决的办法是：测定抗原时，在标本中加入足量的正常鼠Ig (s) ，从而克服由于上述原因造成的假阳性。
1.1.6& 交叉反应物质& 类地高辛、类AFP样物质等，是与靶抗原有交叉反应的物质。在用多抗测定抗原时对测定结果影响不大，但在用单克隆抗体测定抗原时，如果交叉抗原决定簇正好是所用单克隆抗体相对应的靶决定簇时，也会出现假阳性结果。
1.1.7& 标本中其它成分的影响& 血清脂质过高、胆红素、血红蛋白及血液粘度过大等，均对ELISA测定结果有干扰作用。
1.2& 外源性干扰物质
外源性物质常常是由于用于ELISA测定的血标本的采集、贮存等不当所致。如标本溶血、标本被细菌污染、标本贮存过久、标本凝集不全和采血管中添加物等影响[2]。
1.2.1& 标本溶血& 溶血的原因有许多，主要有体外溶血和体内溶血两种。体外溶血可由物理因素（如机械性破坏、冰冻）、化学因素（如血样接触表面活性剂）和代谢性因素（如遗传病引起的血细胞脆性增加）引起。体内溶血可由物理因素（人工心脏瓣膜或大血管手术后）、生物因素（如恶性疟疾）和药物毒性反应等因素引起。由于各种标本溶血，均可因红细胞破坏溶解时释放出大量具有过氧化物酶活性的血红蛋白，在洗涤过程中往往难以完全洗脱，它可使H2O2释放出原生态氧［O］，从而催化底物四甲基联苯胺生成可溶性的有色物质，在以辣根过氧化物酶为标记的ELISA测定中，会导致非特异性显色，干扰测定结果。为克服上述干扰作用，标本采集时必须注意避免溶血。
1.2.2& 标本受细菌污染& 因菌体中可能含有内源性过氧化物酶，因此，被细菌污染的标本同溶血标本一样，亦可产生非特异性显色而干扰测定结果。
1.2.3& 标本保存不当& 在冰箱中保存过久的标本，血清中IgG可聚合成多聚体、AFP可形成二聚体，在间接法ELISA测定中会导致本底过深、甚至造成假阳性。标本放置时间过长（如一天以上），有时抗原或抗体免疫活性减弱，可出现假阴性。为克服上述干扰，ELISA测定的血清标本宜为新鲜采集。如不能立即测定，5天内测定的血清标本可存放于4℃，1周后测定的血清标本应低温冻存。冻存后融解的标本，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混合后再测定，但混匀时应轻柔，不可强烈振荡。
1.2.4& 标本凝集不全& 在没有促凝剂和抗凝剂存在的情况下，正常血液采集后1/2~2h开始凝固，18~24h完全凝固。临床检验工作中，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，此时的血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果.这类情况于次日复查时因血凝已完全，血清中不再有纤维蛋白存在，故复查结果变为阴性。为避免上述干扰作用，解决的办法最好是血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清。1.2.5& 标本管中添加物质的影响& 抗凝剂（如肝素）、酶抑制剂（如NaN3可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性）及快速分离血清的分离胶等均对ELISA测定有一定干扰作用。 综上所述，对临床检验 ELISA测定中出现的假阳性或假阴性结果，在考虑试剂因素和操作因素之外，更多的应从标本因素方面进行分析，并应采取相应措施排除干扰作用，从而为临床提供正确可靠的检测结果。
2& 操作因素
2.1& 温育的影响
温育是影响ELISA测定结果的关键因素。温育时间不够，弱阳性标本检测不出；温育温度不够，弱阳性标本也难以检出。
2.2& 洗板的影响
洗板对ELISA测定来说也是关键步骤。洗板分手工洗板和机器洗板，一般认为机器洗板较手工洗板效果要好，关键是洗板次数的选择。洗板次数较少，造成残留，可引起假阳性结果；洗板次数过多，可造成抗原抗体结合物洗脱，造成假阴性结果。
2.3& 显色的影响
影响显色的关键是显色温度和显色时间，有些实验室操作人员不严格按说明书操作，因为担心&花板&，往往是显色时间不到就匆忙终止显色，结果造成弱阳性标本不能显色而导致假阴性发生。
2.4& 加样的影响
加入样品、试剂及混匀时间的差异称为操作时差。操作时差在每个试验中都存在，尤为手工操作更著，对结果都会产生或大或小的影响。ELISA常用项目，例如：乙肝两对半，多是成批检测。从加第一个样本到最后一个样本，包括中间换吸管尖的工作，在这一过程中有一个时间差；加试剂及混匀也同样存在时间差，这种操作时间差会致使抗原抗体反应和酶促反应时间的不一致，而这种不一致可以直接导致误差的产生，尤其是在夏天，若不合理安排时间、尽量减少时差，将会导致假阳性或假阴性的结果出现。
ELISA检测法影响因素众多，上述只是一些常见因素分析。要想提高ELISA检测的检测质量，关键还要加强实验室科学管理，强化标准化流程操作，加强质量控制，提高人员素质，以减少检测假阳性、假阴性结果的发生。
<input type="hidden" name="content" value=" " />
更多相关【】的文章
期待你精彩评论，请勿灌水！
请自觉遵守互联网相关政策法规
检验资讯栏目列表
全站资讯搜索&&/&&&&/&&
ELISA血液样本的处理方法&&&&参见附件。&&&&
&&&&【摘要】 目的 比较应用ELISA法检测尿液和血液标本中HIV-1抗体结果的一致性。
您现在查看是摘要介绍页，。做ELISA实验需要注意一些什么？_百度知道
做ELISA实验需要注意一些什么？
我有更好的答案
实验时，这样才能保证数据的准确性。15，要在临用前现配。6、吸取液体时。14、应尽量做双孔实验，要使底物避光保存。5、用枪吸取液体时速度不能太快，以免产生气泡而使吸取量不准确、洗板时。13、温浴时间应遵守试剂盒规定，否则会影响结果，以使结果更稳定。9。2、待检样品要澄清，使之稳定10分钟以上。12。11、检测前，要打开酶标仪，防止水分的蒸发、底物是光敏感的，误差不能超过2%。可用水和电子天平进行确定，应静置1分钟，使清洗更加彻底。10、吸取不同的液体后，要更换枪头。即使是吸取标准品时。3、要在实验前1小时将试剂盒从冰箱中取出，每次洗液加入后、将液体加到酶标孔中时，避免枪头和孔内液体接触。8、温浴时，要用不干胶或胶带纸封好酶标板。7，要用量程和需要量接近的枪去吸，减少误差。4，使各种试剂都恢复到室温1、要保证移液枪的准确性、对结果有疑问的样品要用其它方法进行确证
采纳率：36%
重新复查。 对ELISA测定中出现问题的可能原因（非试剂盒本身的原因）。在此过程中应注意不要把显色剂和终止液滴入顺序弄反，否则重做实验。
2） 加样应直接加入反应孔底部，则需放入-20℃冰柜内冰冻保存。需匀速加样1
临床标本的收集和保存
用于ELISA测定的临床标本最为常用的是血清（浆）。本实验室用ELISA测定乙肝两对半，甲肝，在实验过程中形成纤维蛋白吸附在反应孔孔壁上不易洗掉，每孔吸水是否吸尽，并且要保证洗液在孔中放置的时间。 6 ELISA测定以TMB为底物的显色
加入底物开始显色反应前，最好是先检查一下底物溶液的有效期；所用配制缓冲液的蒸馏水有问题。 2）测定的重复性差 ，这是由于测定操作引起的问题，包括 ①加样本及试剂量不准；孔间不一致 ②加样过快，孔间发生污染 ③加错样本 ④加样本及试剂时，加在孔壁 ⑤不同批号试剂盒中组分混用 ⑥温育时间。当标本出现严重溶血及血清中混有红细胞时，水浴。温育时间应按照试剂说明书上的时间严格执行.
温育的时间与温度
温育是ELISA测定中最容易出现问题的步骤：
1） 洗板前，应检查洗液瓶，加样时，总结如下：
1)弱阳性质控样本检测不出温育的时间或温度不够；显色反应时间太短。 8 ELISA测定结果判定
结果判定一般是根据比色结果和肉眼观察综合判定。如在判定过程发现有些反应孔出现倒阴不阳的现象或出现不常见的模式（如乙肝两对半中出现12阳性等），需本着严谨的态度。
ELISA的比色测定
ELISA的比色测定由酶标仪进行测定，故需强调比色测定时，一定要注意酶标仪的波长是否是双波长（450nm和630nm）。 3） 在洗板过程中，应注意观察反应孔每孔是否灌满且无外溢，加在反应孔孔壁上易溅出会对邻近孔产生污染。尽量避免出现气泡，易造成假性结果，在室温下放置20分钟以上后，需温育15min，最后加入终止液终止反应，振荡混匀后即可进行下面的比色测定判断结果：
1） 要注意避免出现严重溶血及血清中混有红细胞，在处理和保存方面要考虑以下几个方面、B显色剂后。
加血清样本及反应试剂
血清样本使用微量加样枪加样。滴入A。冰冻保存的血清标本须注意避免反复冻融，标本可能引起假阴性结果。此外冻融标本的混匀不要进行剧烈振荡，应反复颠倒混匀。
ELISA 测定中试剂准备
在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中拿出来、蒸馏水瓶是否充足，废液瓶是否满瓶。2） 在自检过程中注意观察洗液灌注是否通畅，排液是否通畅，再注意滴加的角度和滴加的速度。滴加太快易出现重复滴加或加在两孔之间。如果把试剂盒从冰箱拿出来直接做实验会造成一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因为在后面的孵育反应步骤中，并有可能整板花板。
ELISA测定的洗板
全自动洗板机的使用应注意以下几点，再 进行测定，证试剂盒温度要和室温一致，吸样时，防止水蒸气形成水滴掉入反应孔内造成污染，所以在温育时一定要封板。 3） 血清标本可在2～8℃下保存1周： 1） 加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性，残留在反应孔内的血红蛋白具有过氧化物酶的活性，显色时可能造成假阳性，弱阳性样本测不出来 。
2）因为采用水浴。温育实际测定操作中要注意以下几点： 1）要保证在设定的温度下有足够的反应时间。温育时间不够。温育温度应在37℃。使用微量加样枪加样必须注意避免以下几点。
3） 反应试剂的加入时先要注意试剂的有效期，反应孔不易洗净，加样枪需直接按到底。
2） 标本凝固不全强行离心，加样枪需按到第一档，稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量，ELISA实验中洗板用的洗液需每日更换配制，造成孵育时间不够。其次。如血清样本需长时间保存，造成血清中含有少量的纤维蛋白原，戊肝，抗HIV的标本时、洗板、显色时间不一致 ⑦孔内污染杂物，血清标本未完全凝固即加入
为您推荐：
其他类似问题
您可能关注的内容
&#xe675;换一换
回答问题，赢新手礼包&#xe6b9;
个人、企业类
违法有害信息,请在下方选择后提交
色情、暴力
我们会通过消息、邮箱等方式尽快将举报结果通知您。你的浏览器禁用了JavaScript, 请开启后刷新浏览器获得更好的体验!
ELISA法与胶体金法检测血液抗-HIV结果对比分析
与抗-结果【摘要】目的
ELISA法与法检测血液抗-HIV的灵敏度、特异性以及ELISA法测定的s/co值的强、弱与胶体金法的率。
采有用两种ELISA试剂同时检测抗-HIV抗体，对任何一种呈反应性的标本均双孔复查，同时用胶体金法进行检测，复查仍为反应的标本，留取同源血袋血浆及填报资料一同送市疾病中心用进行确认。结果ELISA法检测抗-HIV反应的156人份血液中有1 05例WB法确认为阳性，阳性率为67. 31%，其中95例为胶体金法阳性，符合率为90.48% (95／105)；ELISA法呈强阳性反应与ELISA法呈弱阳性反应的WB法确认阳性率x 2=100.30，P&O.Ol。结论
ELISA法检测试剂不同的厂家的差异，都有一定的漏检率及率，胶体金法因方法学，存在漏捡和检测假阳性的可能；ELISA法检测抗-HIV呈SlOD值呈强、弱确认为阳性中存在显著性差异，SlOD值越高，与WB法试验结果符合率越高。为了了解ELISA法与胶体金法的灵敏度、特异性以及ELISA法测定的S／CO值的强、弱与胶体金法的符合率，笔者对本市年份检测的无偿献血者份标本的HIV-Ab进行回顾性分析比较，结果报告如下：1材料与方法1.1标本年贵港市无偿献血者200 603人份血样，其中ELISA法检测抗-HIV呈反应性标本156人份。1.2仪器与试剂Uranus全自动酶免仪、Xantas加样器、佰乐7515型洗板机。ELISA试剂（万泰公司、珠海丽珠公司、厦门新创公司、北京金豪公司及荷兰生物梅里埃）及胶体金试剂（杭州艾康）。1.3方法采有用两种ELISA试剂同时检测抗-HIV抗体，对任何一种呈反应性的标本均进行双孔复查，同时用胶体金法进行检测，复查仍为阳性反应的标本，留取同源血袋血浆及填报资料一同送市疾病预制中心用WB法进行确认。ELISA法S／CO（S为标本OD值，CO为临界OD值）&5.6定为强阳性，S／CO值在1N 5.6定为弱阳性，S／CO值在0.8～1定为灰区（可疑），S／CO值&0.8为。各种试剂均经批批检合格产品，操作严格按照试剂书进行；采用x-计算器1.61软件进行数据处理，x2检验分析，P& 0.05有统计学。2结果见表1，ELISA法检测抗-HIV呈阳性反应的156人份血液中有105例WB法确认为阳性，阳性率为67.31%，105例中有95例为胶体金法阳性，符合率为90.48%。表1ELISA法检测抗-HIV呈强、弱阳性反应与胶体金法、WB法结果比较3讨论目前，由于地区差异及财政支持力度的不同，对无偿献血血液进行抗- 的方法和技术存在一定的差异，而世界各国的血液筛查项目中几乎均包括HIV检测，有的发达已用核酸检测方法直接检测病毒。了解不同检测方法进行抗- Hiv检测的灵敏度及特异性，对血液检测准确性有更好的帮助，ELISA法检测试剂不同的厂家存在技术的差异，都有一定的漏检率及假阳性率，笔者对156例ELISA法检测抗-HIV抗体呈阳性反应的假阳性率为32.69%，胶体金法的假阳性率为5.77%(9／156)，漏检率为6.41% (10/105)。胶体金法因方法学原因，存在漏检和检测假阳性的可能，ELISA法确认为阳性的105例中胶体金法有95例为阳性符合率为90.48%，说明S／OD值越高，与胶体金法试验结果符合率越高。所以用胶体金法在基层用血机构的用血时，对血液进行抗-HIV初筛能大大降低输血的风险，但所有的检测结果应以确认的确认报告为准，对结果的反馈更要慎重。ELISA法检测抗-HIV呈S／OD值呈强、弱阳性结果确认为阳性中存在显著性差异，两种ELISA试剂检测同时呈强阳性反应的104例中有87例经WB法确认为阳性，符合率为83.65%，说明S/OD值越高，与WB法试验结果符合率越高。两种ELISA试剂检测同时呈弱阳性反应的52例中只有8例经WB法确认为阳性，符合率为15 .39%，说明S/OD值越低，与WB法试验结果符合率越低。而单一ELISA试剂呈阳性反应的结果，胶体金法及WB法均为阴性，所以单一ELISA法试剂呈阳性反应的假阳性率非常高，对无偿献血者的血液检测中，单一ELISA法试剂检测抗-HIV抗体呈阳性反应的信息，笔者认为，为了减少对的不利，以其他项目对其血液进行报废，但必须留取同源血袋血浆及填报资料一同送市冷疾病预防控制中心用WB法进行确认。流行形势日益严重，目前检测的普及性和便利性仍，因此借献血再次检测的仍然存在，而受到的相关羞辱与歧视依然严重，不能排除极个别者出现报复社会的倾向，所以加强对血液进行抗-HIV的检测尤为重要，且贵港市是HIV感染的高发区，在本市使用ELISA法试剂和其它初筛试剂联合检测抗-HIV时，应同时ELISA法的反应强度(S/OD)与筛查方法的结果，同时必须考虑试剂的质量、敏感度、特异性，在经济条件好或政府资金的支持下使用核酸检测，尽可能缩短HIV的窗口期。
微信客服：dupinjiance（长按复制）
客服电话：