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PCR-荧光探针法快速检测结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌
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PCR-荧光探针法快速检测结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌
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C-反应蛋白对肺结核活动期辅助诊断价值分析
□ 龙俊 涂伟 李国伦 韦彤
摘　要:目的通过对肺结核患者血清中C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）浓度、痰结核分枝杆菌核酸扩增荧光检查（TB—PCR定性）及血液中白细胞总数（WBC）的动态观察，探讨C-反应蛋白在肺结核辅助诊断中的作用。方法用免疫比浊法测定CRP浓度，用全自动分析仪分析血常规，用结核分枝杆菌核酸扩增荧光检查试剂对患者痰液进行TB—PCR测定。结果痰TB—PCR阳性的肺结核患者C-反应蛋白增高较白细胞总数增高明显。结论在肺结核的辅助诊断中，C-反应蛋白敏感性较白细胞总数高，痰TB—PCR的特异性较高．对肺结核有互补的辅助诊断作用．
作者单位：解放军第59中心医院，云南 开远 661600【摘要】&
通过对肺结核患者血清中c-反应蛋白(c-reactive protein,crp)浓度、痰结核分枝杆菌核酸扩增荧光检查(tb-pcr定性)及血液中白细胞总数(wbc)的动态观察，探讨c-反应蛋白在肺结核辅助诊断中的作用。方法
用免疫比浊法测定crp浓度，用全自动分析仪分析血常规，用结核分枝杆菌核酸扩增荧光检查试剂对患者痰液进行tb-pcr测定。结果
痰tb-pcr阳性的肺结核患者c-反应蛋白增高较白细胞总数增高明显。结论
在肺结核的辅助诊断中，c-反应蛋白敏感性较白细胞总数高，痰tb-pcr的特异性较高，对肺结核有互补的辅助诊断作用。
【关键词】& 肺结核 c-反应蛋白
　　c-反应蛋白是由肝脏合成、存在于人体血浆中的一种急性时相蛋白。正常情况下c-反应蛋白在血清中的含量极微，但当机体受到炎症侵袭时，其含量会出现特征性改变，敏感性也较高，这对炎症的发生、发展及预后有一定的提示。所以研究肺结核患者血常规中白细胞总数、痰tb-pcr定性与c-反应蛋白的关系，可以探讨其对肺结核辅助诊断的作用。
　　1& 对象与方法
　　1.1& 对象&
　　收集2006年6月～2007年5月临床诊断为肺结核的104例患者(诊断标准：依据1999年颁布的结核病诊治指南)，其中男性72例，女性32例，年龄&40岁者40例，年龄＜40岁者64例。留取静脉血同时作血常规与crp检查，并留取清晨清水漱口后第一口深部痰液作痰tb-pcr检查。
　　1.2& 试剂与仪器&
　　血常规分析仪作白细胞计数；用免疫比浊法测定crp浓度；痰tb-pcr测定使用中山大学达安基因研究股份有限公司生产的结核分枝杆菌(tb)核酸扩增(pcr)荧光检测试剂盒，按说明书操作。
　　1.3& 方法
　　按前述诊断标准诊断确立后，作相关检查，根据检查结果分为两组，一组为痰tb-pcr检查阳性，一组为痰tb-pcr检查阴性；分别将两组对象的crp检查值、白细胞总数值进行定量计算，并按下述标准进行阴、阳性判断及灵敏度比较：当crp超过40mg/l时，临床上即可基本确定有细菌感染［１］，故crp＞40mg/l设为阳性(a1)，crp&40mg/l设为阴性(c1)；wbc正常值在4～10g/l之间，取中间值，wbc＞7g/l设为阳性(a2)，wbc&7g/l设为阴性(c2)。
　　2& 结& 果
　　按前述诊断标准进行诊断，诊断成立的患者无论痰tb-pcr阳性还是阴性，crp的敏感性均高于wbc的敏感性，见表1，表2。表1& 痰tb-pcr阳性中crp阳性的资料整理表（略）表2& 痰tb-pcr阴性中crp阳性的资料整理表（略）
　　3& 讨& 论
　　c-反应蛋白是第一个被发现的急性期反应蛋白，是炎症损伤的标志［２］。细菌感染时，炎症细胞浸润后释放内源性递质，刺激肝细胞生成crp，crp浓度增高，可在感染后5～8h升高，48h达峰值，血浆半衰期为19h［３，４］。肺结核患者是因肺部感染结核菌而致病，所以crp在结核菌感染时有较高的敏感性，能在早期的检测中发现，但它对结核菌感染无特异性的诊断作用。本试验结果中，痰tb-pcr阳性的患者，crp增高较白细胞计数增高明显，也反应了crp敏感性较高。痰tb-pcr对肺结核诊断有较高的价值，尤其对肺结核活动期排菌的患者，由于临床上肺结核患者排菌的不同和留取痰标本的差异，导致其实验检查阳性率不高，影响了其对临床诊断的价值。因此，c-反应蛋白，痰tb-pcr定性在肺结核的辅助诊断中有一定的互补作用，综合分析上述检查结果，检测crp对于防止临床肺结核漏诊、误诊有一定的作用。
【参考文献】 ......(未完，请点击下方“在线阅读”)
特别说明：本文献摘要信息，由维普资讯网提供，本站只提供索引，不对该文献的全文内容负责，不提供免费的全文下载服务。
金月芽期刊网 2017[转发]结核分枝杆菌核酸扩增荧光定量检测标准操作规程
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三、结核分枝杆菌核酸扩增荧光定量检测标准操作规程
采用一对PCR引物和一个荧光双标记的探针，该探针能与引物扩增区域中间的一段DNA模板发生特异性结合，从而将PCR技术和荧光检测技术结合起来，实现了对TB核酸的自动化检测；检测灵敏度为10个TB菌/毫升，反应管在PCR循环结束后无需开盖；采用了dUTP-UNG酶防污染系统。 可用于可疑结核病患者经处理的痰液标本结核分支杆菌核酸的定性检测，可用于结核病的辅助诊断。
1、储存条件及有效期
本试剂盒贮存于-20℃的条件下有效期为12个月（请于有效期内使用）
2、自备试剂
4% NaOH、灭菌生理盐水
3、样本采集
3.1 以清晨第一口痰为宜。
3.2 先用清水漱口，嘱患者用力咳出深部的痰于无菌样本保存管，密封送检。
4、样本存放
4.1 待测样本在2-8℃保存不应超过24小时。
4.2 -20℃保存不超过三个月；。
4.3 -70℃以下长期保存。
4.4 应避免反复冻融。
5、样本运输
采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输。
6、扩增试剂准备（PCR前准备区）
6.1 从试剂盒中取出TB PCR反应液、Taq酶及UNG，室温融化并振荡混匀后，2,000rpm离心10sec。
6.2 设所需要的PCR反应管管数为n（n = 样本数 + 1管阴性对照 + 1管阳性对照），每个测试反应体系配制如下表：
6.21 Roche LightCycler ,Roter-Gene仪器，准备相应数量的毛细管
TB PCR反应液
计算好各试剂的使用量，加入一适当体积离心管中，充分混合均匀，2000rpm离心10sec，向设定的n个Roche毛细管(LightCycler)中或普通PCR反应管(Roter-Gene)中分别加入18ul，转移至样本处理区。
6.22 PE Gene Amp 5700，PE Gene Amp 7700，ABI-7000，ABI-7300，BIO-RAD iCycler，Line-GeneⅠ，Line-GeneⅡ，MJ OpticonⅠ，MJ Opticon Ⅱ等仪器，准备好相应的反应管
TB PCR反应液
计算好各试剂的使用量，加入一适当体积离心管中，充分混合均匀，2000rpm离心10sec，向设定的n个PCR 反应管中分别加入38ul，转移至样本处理区。
7、样本处理（样本处理区）
7.1 首先对痰液样本进行目测，若样本中唾液占绝大部分，则需重新采集样本。
7.2 目测合格后，在样本中加入2～3倍体积4％的NaOH溶液。
7.3 37℃恒温处理30min或常温下1hr，使其充分液化，无明显固状物并且吸出时无拖丝现象即为液化完全。
7.4 若液化不完全，可适当再加入少量4％的NaOH溶液直至液化完全。
7.5 取液化后的标本900ul以及试剂盒中的阴性对照、阳性对照各500ul于1.5ml无菌离心管中，13,000rpm离心10min。
7.6 弃上清（先倒出大部分液体，再用移液器尽量吸干至无明显液滴为止）。
7.7 沉淀中加入1ml灭菌生理盐水，振荡悬浮（注意：按紧离心管盖后，横向按在漩涡振荡器上将沉淀振起）。
7.8 13,000rpm离心10min。
7.9 弃上清，用1ml灭菌生理盐水洗涤沉淀。
7.10 13,000rpm离心10min。
7.11 弃上清，向沉淀中加入DNA提取液30ul，振荡混匀。
7.12 2,000rpm离心5sec，放37℃温浴30min。
7.13 再放入100℃水浴/干浴10min。
7.14 13,000rpm离心10min，保留上清备用。
7.15 如果样本裂解产物当天不使用，请于-20℃保存。
8、加样（样本处理区）
8.1 若样本及对照品裂解产物保存在-20℃，使用前置室温解冻，以13,000rpm离心5min。
8.2 Roche仪器
8.21在所设定的n个Roche毛细管中分别加入步骤7中处理过的样本、阴性对照、阳性对照上清液各2ul。
8.23 盖紧管盖，连同Roche专用金属反应管套放在离心机中，于2,000rpm离心10sec。
8.24 将毛细管排好放入Roche PCR仪内，记录样本摆放顺序。
非Roche仪器
8.31 向所设定的n个PCR反应管中分别加入步骤6中处理过的样本、阴性对照、阳性对照上清液各2ul。
8.32 盖紧管盖，将PCR 反应管转移至检测区，置于PCR仪上，记录样本摆放顺序。
9、PCR扩增（检测区）
9.1 循环扩增条件
Roche Lightcycler
37℃：3 min； 93℃：1 min；
93℃：5 sec, 60℃：40 sec（Acquisition Mode为Single）40个循环，Analysis Mode为Quantification。
Roter-Gene
37℃：5 min； 94℃：1 min；
95℃：5 sec, 60℃：30 sec，40个循环。反应体系设为20ul。荧光信号收集设在60℃。
PE Gene Amp，ABI-，
37℃：5 min； 94℃：1 min；
95℃：5 sec, 60℃：30 sec，40个循环。反应体系设为40ul。
Line-GeneⅠ,Ⅱ
37℃：5 min； 94℃：1 min；
95℃：5 sec, 60℃：40 sec，40个循环。反应体系设为40ul。
BIO-RAD iCycler
37℃：5 min； 94℃：1 min；
95℃：5 sec, 60℃：30 sec，42个循环。反应体系设为40ul。
MJ OpticonⅠ,Ⅱ
37℃：5 min； 94℃：1 min；
95℃：5 sec, 60℃：30 sec，40个循环。反应体系设为40ul。荧光信号收集设在60℃。
9.2 仪器检测通道选择
Roche Lightcycler
选择F1通道。
Roter-Gene
Acquisiton选择Fam。
PE Gene Amp ，ABI-
PE Gene Amp 5700是单通道荧光PCR检测仪，无需选择检测通道。
PE Gene Amp 7700, ABI- Reporter设为FAM，Quencher设为TAMRA。Passive Reference设为None（ABI-）。
BIO-RAD iCycler
荧光素选择FAM-490。
Line-GeneⅠ,Ⅱ
选择F1通道，增益值批间有所不同，应按每批试剂建议值设定。（每一批试剂的增益值详见试剂盒中给定值）
MJ OpticonⅠ,Ⅱ
OpticonⅠ是单通道荧光PCR检测仪，无需选择荧光通道。
Opticon Ⅱ是双通道荧光检测仪，由于实验只需要单荧光，选择Single Color Experiment。
10、结果分析条件设定
10.1 Roche Lightcycler
10.11 选择F1或F1／F2通道（建议选择F1通道），点击Quantification进入定量分析窗口。
10.12 在Quantification窗口中，设定Analysis 方式为Fit points，Adjustment 方式为 proportional。
10.13 选定Noise band项, 阈值（Noise band cursor）设定以刚好超过正常阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct值不出现任何数值为准。
10.14 也可根据仪器的实际情况进行调整。
Roter-Gene
阈值(Threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct值无数值为准。
PE Gene Amp ，ABI-
10.31 PE Gene Amp 5700 结果分析时基线（baseline）的确定：取6—10或6—15个循环的荧光信号。阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct值=40.0为准。
10.32 PE Gene Amp 7700，ABI-结果分析时基线（baseline）的确定：取3—10或3—15个循环的荧光信号。阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct值=40.0为准。
BIO-RAD iCycler
果分析时基线（baseline）的确定，基线（baseline）取为2—10或2—15个循环的荧光信号。
阈值(threshold) 设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct值=0.0为准。也可根据仪器噪音情况在15.0—40.0之间调整。
Line-GeneⅠ,Ⅱ
10.51击数据分析进入结果分析界面。
10.52选择样点拟合法进行结果分析：零点调整取1－10或1－15个循环的荧光信号。
10.53在噪声容限界面下调整基线位置，其设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增线（无规则的噪音线）的最高点为准。
10.54选择定量分析，对样本进行结果分析。
MJ OpticonⅠ,Ⅱ
10.61击Quantitation进入结果分析窗口
10.62在Option选项区域进行基线以及阈值线的调整。
10.63取为2—10或2—15个循环的荧光信号，阈值(threshold) 设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct值显示为none为准。
10.64也可根据仪器噪音情况在15.0—40.0之间调整。
10.65在用PE,ABI-/BIO-RAD, OpticonⅠ,Ⅱ/ Line-GeneⅠ,Ⅱ iCycler荧光定量PCR检测仪进行分析的过程中，为避免漏检强阳性样本，
应首先将基线定为6—10/3—10/2—10/1－10个循环的荧光信号观察分析Ct值。
如果没有Ct值＜16.0的样本，则将基线改定为6—15/3—15/2—15个循环的荧光信号进行结果分析。
如有Ct值＜16.0的样本，则应将该样本剔除此次结果分析。
同时仍将基线改定为6—15/3—15/2—15个循环的荧光信号进行结果分析。
11、质控标准
11.1 阴性对照的Ct值均应等于40.0(PE)或无数值。
11.2 阳性对照的Ct值应小于等于30.0。
11.3 否则，此次实验视为无效。
12、结果判断
12.1 Ct值等于40或0的样本为阴性样本。
12.2 检测样本Ct值≤37.0者判为阳性。
12.3 Ct值大于37.0的样本建议重做。
12.4 重做结果Ct值＜40者为阳性，否则为阴性。
13、试剂盒使用注意事项
13.1 有关实验室管理规范请严格按照行业行政主管部门颁布的有关基因扩增检验实验室的管
理规范执行。
13.2 本试剂盒仅用于体外检测。
13.3 阳性工作标准品具体拷贝数请参照试剂盒内给定值。
13.4 实验请严格分区操作：
第一区：PCR前准备区 — 准备扩增所需试剂；
第二区：样本处理区 — 待测样本和对照品处理；
第三区：检测区 — PCR扩增检测。
13.5 各区物品均为专用，不得交叉使用，避免污染，实验后即请清洁工作台。
13.6 试剂盒内各试剂使用前，充分融化并振荡混匀后请稍事离心。
13.7 在－20℃保存的样本裂解产物，应在加样前置室温解冻，作短暂离心后使用。
13.8 分装有反应液的反应管应扣盖或装入密实袋内再转移至样本区。
13.9 加样时应使样品完全落入反应液中，不应有样品粘附于管壁上，加样后应尽快盖紧管盖。
13.10扩增完毕立即取出反应管，密封在专用塑料袋内，丢弃于指定地点。
13.11反应液分装时应尽量避免产生气泡，上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。
13.12实验中用过的吸头请直接打入盛有1%次氯酸钠的废物缸内，并与其他废弃物品一同灭菌后丢弃。
13.13工作台及各物品定期用1%次氯酸钠、75%酒精或紫外灯进行消毒。
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【2017年整理】结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂注册指导原则
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附件结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂注册技术审查指导原则本指导原则旨在指导注册申请人对结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门审评注册申报资料提供参考。本指导原则是对结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导文件，不涉及注册审批等行政事项，亦不作为法规强制执行，如有能够满足法规要求的其他方法，也可以采用，但应提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。一、范围　结核病是由结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌和非洲分枝杆菌等引起的慢性传染性疾病，可累及全身各个器官，以肺结核最为多见。其中，结核病的病原菌主要是结核分枝杆菌，牛结核分枝杆菌次之。结核分枝杆菌主要是经空气传播，大多数人在感染结核分枝杆菌后并无症状，称为潜伏感染。潜伏感染可持续几十年，仅有5%—10%的潜伏感染者发展为活动性肺结核。在结核病的细菌学检验中，通常将分枝杆菌分为结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex）和非结核分枝杆菌（Nontuberculosis mycobacteria, NTM）。结核分枝杆菌复合群包括结核分枝杆菌（M.tuberculosis）、牛结核分枝杆菌(M.bovis)、非洲分枝杆菌（M.africanum）和田鼠分枝杆菌（M.microti）。在结核分枝杆菌复合群内各种中，除田鼠分枝杆菌对人无致病力外，其他三种菌均可对人致病，产生大致相同的临床表现。因此，临床上往往只做结核分枝杆菌复合群的鉴定而不进行亚种水平的鉴定，用于结核辅助诊断的核酸检测试剂也常采用结核分枝杆菌复合群共有的核酸序列作为靶标来进行检测。核酸检测是肺结核病原学诊断的重要参考。2009年，美国疾病控制预防中心（CDC）更新了肺结核的诊疗指南，将核酸检测作为肺结核的辅助诊断方法，明确：对所有疑似肺结核患者，应至少进行一个呼吸道样本的核酸检测。我国《临床诊疗指南—结核病分册》也明确：结核分枝杆菌的DNA检测可作为肺结核诊断的参考。与其他实验室检查方法比较，核酸检测的价值在于：（1）可快速鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌，提高涂片阳性肺结核的诊断特异性；（2）与涂片比较，灵敏度较高，可提高涂片阴性肺结核的检出率；（3）与培养相比，操作快速，可及早进行正确的医疗处置。结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂是指：利用分子生物学检测技术，如聚合酶链式反应（PCR）等，以特定的结核分枝杆菌复合群共有的核酸序列为检测靶标，对痰、支气管肺泡灌洗液中的结核分枝杆菌复合群进行体外定性检测的试剂，用于肺结核的辅助诊断。本指导原则的技术要求是基于荧光探针PCR方法建立的，对于其他分子生物学检测技术，可能部分要求不完全适用或本文所述技术指标不够全面，申请人可以根据产品特性对不适用部分进行修订或补充其他的评价和验证，但需阐述不适用的理由，并验证替代方法的科学合理性。本指导原则适用于以结核分枝杆菌复合群共有的靶核酸序列作为靶标进行检测的试剂，对于某些以结核分枝杆菌特有的靶核酸序列为靶标进行检测的试剂，可能部分要求不完全适用或本文所述技术指标不够全面，申请人可以根据产品特性对不适用部分进行修订或补充其他的评价和验证，但需阐述不适用的理由，并验证替代方法的科学合理性。本指导原则适用于预期用途为肺结核辅助诊断的、以痰或支气管肺泡灌洗液作为适用样本类型的结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂。对于用途相同的其他呼吸道样本类型，或者预期用途为肺外结核辅助诊断的结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂，可能部分要求不完全适用或本文所述技术指标不够全面，申请人可以根据产品特性对不适用部分进行修订或补充其他的评价和验证。本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可事项变更的产品。二、注册申报资料要求（一）综述资料综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、研究结果的总结评价以及国内外同类产品上市情况介绍等内容。其中，同类产品上市情况介绍部分应着重从方法学、检验原理、最低检测限及被测靶核酸序列的特性等方面写明申报试剂与目前市场上已获批准的同类产品之间的主要区别。若被测物为新的靶核酸序列，则应详细论述作为检测靶标的核酸序列的临床意义，即其与临床应用（可用于肺结核辅助诊断）的相关性，并提供充分的支持资料。综述资料应符合《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号，以下简称《办法》）和《关于公布体外
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