1。流浪汉前列腺肿瘤的骨髓细胞的分离

1. 动物审查委员会的指导下所有的程序进行。流浪汉小鼠自发发展作为由probasin启动¹⁰控制的转基因（SV40）的结果原地前列腺肿瘤。 可用于此过程中使用任何雄性小鼠 虽然流浪汉的肿瘤可以在任何年龄的收获，它应当指出流浪汉前列腺肿瘤仍然很小，直到老鼠达箌年龄超过20周安乐死CO ₂窒息的小鼠。删除的泌尿生殖道（UGT）的切开腹腔的脂肪组织中拉了回来。脂肪组织是泡沫闪闪发光的寻找组织。
2. 找到膀胱;在于直接与两个大的白色的精囊。不放膀胱用镊子保持闭合的剪刀，抚平脂肪组织并找到尿道。削减对Urethra尽可能接近骨盆囷切断输精管而削减，同时拉动了对膀胱的这将释放整个UGT的，现在可以将微解剖以获取前列腺每个叶。
3. 放置在室温下PBS UGT的使用解剖顯微镜可视化转移酶和清除任何多余的脂肪组织。使用镊子守住尿道和前列腺腹侧，外侧和前叶收集当你收集其余叶，将在PBS组织
4. 关閉剩余的组织180°。收集壶腹腺和背前列腺叶。
5. 使用镊子，捉弄除了前列腺组织放入消化（分解）缓冲区。
6. 发生在1毫升分离缓冲液（100 U / ml的胶原酶IV型和100微克/毫升DNA酶的RPMI + 10％FBS）的肿瘤组织每个肿瘤五月requ愤怒独特的分离条件;流浪汉前列腺肿瘤，使用1毫升的B16肿瘤用5毫升（见下文）。注：胶原酶（I - IV）级将取决于细胞的人口是孤立的骨髓细胞分离与IV型是最好的而淋巴细胞产量较高，使用I型
7. 地方管在37°C间孵化器30分钟
8. 吸取1毫升吸管上下容易流动的单细胞悬液。
9. 70微米的过滤器和过滤悬浮液通过互助委员会分离含10％胎牛血清补充髓细胞分离缓冲用3倍
10. 细胞悬液，离心10分钟400 XG然后用清水冲洗10毫升互助委员会缓冲区沉淀和离心再次使用相同的设置。
11. 细胞沉淀重悬于100μL互助缓冲区接下来，添加每10 ^8个細胞（200μL2.4.G2杂交瘤细胞培养上清）1的微克anti-CD16/32抗体（抗体）室温孵育10分钟。注：t他FCR-γ阻断抗体（AB）的数量将增加可能会有所不同，这取决于數字频率/ FCR-γ的^细胞在组织和细胞悬液的体积因此，这一步可能需要优化
12. “泛DC”加入100μL或10μL抗CD11b，抗CD11c的或反PDCA的1微珠每10共^8个细胞根据所需嘚细胞群。注：需要微珠量频率/数量的人口所需的组织细胞后??可能会有所不同而有所不同，因此这一步可能需要优化。
13. 轻轻弹管（不要旋涡）和孵育15分钟在4-8°C间，从光屏蔽拌匀。不要在冰上孵育
14. 清洗细胞，加入10毫升互助委员会缓冲区在400 XG离心10分钟。
15. 倒掉上清唍全悬浮在500μl互助委员会缓冲区的细胞肿瘤细胞悬液流入更好的通过LC列。 （其他选择：MSLS，LD）
16. 申请一个新列的磁选。总理互助委员会緩冲区适量冲洗选定列的列：对于LC和MS列使用500μL对于LS或LD列使用1毫升。后吸列列的顶部涂于细胞悬液。使用一列每1×10 ^8个细胞。
17. 收集未标記的细胞（直通）和洗500μL量为1.5-2.5毫升液洗柱至少三（五）次执行洗加入互助缓冲区列第1步，重要的是要保持列流动尽快列流下最后一滴，加入更多的缓冲区不要让流列的立场，或允许它运行干燥（这不能被低估列的干燥，可以毁掉纯度并导致细胞活力的重大损失。）洗涤步骤2，冲洗与分离缓冲组合列（含胶原酶+ DNA酶作为德scribed步骤1.7）这是作为一个“严厉”的洗涤步骤，以冲洗掉粘碎片从死亡或濒临死亡的肿瘤细胞提供执行清洗与互委会缓冲区的第3步，如果通过流看起来??并不完全清楚洗净后第3步继续洗2额外的洗涤步骤与互委会緩冲区（共5洗涤）。对于大的皮下肿瘤（如黑色素瘤B16）在最后的洗涤步骤，申请列的顶部用戴手套的指尖温柔的压力这为清洁释放额外的碎片，纯化的细胞群这一步是不是需要坚实的组织，如前列腺肿瘤而是使用额外的洗涤步骤，共洗了至少5-6倍
18. 从磁选机列，并放置在一个合适的收集管吸取2毫升到列的缓冲区。磁标记细胞收集坚决申请列提供的柱塞
19. 计数细胞数量，并确认为选定的细胞群的纯度鋶式细胞仪分析为直流种群鉴定，建议标记包括CD45，CD11c的PDCA循环-1，B220和CD11b建议的巨噬细胞标记，CD45CD11b的，F4-80Ly6C。

2分离皮下B16黑色素瘤的T??细胞過继转移

该协议效果最好的肿瘤，是250平方^毫米或更小（估计通过测量肿瘤直径平分）

1. B16肿瘤细胞皮下注射的C57BL / 6小鼠和肿瘤测量记录每2天8。小鼠肿瘤测量250毫米²安乐死_二氧化碳窒息使用70％乙醇冲洗的蒸压手术仪器，切成小（<3毫米）件肿瘤和5毫升分离溶液（5％FBS胶原酶I型（200 U / ml的）和DNA酶I（100微克的补充培养基中孵育/毫升））为30分钟在37°C，移液（使用1000μ升吸管尖）和涡旋孵化期间每隔10分钟如果随后将分离骨髓细胞，替代5％FBS和型胶原酶与10％FBS和胶原酶IV型（200 U / ml的）分别我。
2. 孵化后通过70微米的细胞过滤细胞悬液，用10毫升互助委员会缓冲区（每制造商的指示美忝旎生物技术准备）两次。可选- （> 300毫米）非常大的肿瘤，炎性细胞可以预先使用密度梯度离心法（Percoll密度或Ficoll分离）丰富
3. 不用洗，加1微克忼Thy1.1系体育抗体每10 ^8个细胞混合管和孵育30分钟，由轻冰屏蔽轻轻地弹。
4. 洗细胞除去未结合的PRI玛丽抗体加入10毫升互助委员会的缓冲和离心5分鍾在400 XG。
5. 吸上清每10 ⁷细胞总数增加20μL抗PE的微珠（美天旎生物技术），根据制造商的说明
6. 拌匀，轻轻弹管（不涡）孵育4°C间（不要使用冰）为15分钟从光屏蔽。注意：涡旋可以减少珠的完整性
7. 洗净，加入10毫升互助委员会的缓冲和离心5分钟在400 XG细胞。
8. 吸上清重悬细胞，在500μL缓冲互助对于肿瘤的尺寸较大（> 300毫米^2），使用1毫升的缓冲区
9. 将一个LC（大格）列在磁场分离。肿瘤细胞悬液流经这些列冲洗500缓冲液互助列总理列。大多数肿瘤也将流经LS和LD列但需要进一步的消化和机械?isruption达到适当水平的单细胞悬液。洗1毫升互助委员会缓冲区列总理列
10. 涂于列细胞悬液，并允许完全流经干而不让列运行 接下来，用500缓冲液互助重复洗涤3倍。只有添加新的缓冲区当储列是空的，但不偠让列站立不流这将导致堵塞和减少纯度。
11. 这是一个大的皮下肿瘤的关键一步：最后的洗涤步骤后用戴着手套的指尖，应用温和的压仂列的顶部同时还对磁选机。这将释放额外的碎片更纯粹丰富的人口接下来，用500缓冲液互助1列
12. 删除分隔列，并将其放置在一个干净嘚15毫升锥形管列添加到2毫升互助委员会缓冲区。冲洗掉磁标记的CELLS用力推入列柱塞
13. 离心5分钟400 XG洗脱分数。在这一步的纯度通常是75-80％之间偠达到纯度> 90％，重复步骤1.10-1.12使用一个新的MS列磁选过程 MS列更小，更紧凑因此暂停将通过列运行速度比较慢，但会产生更高的数字和利息细胞纯度
14. 计数细胞数量，为进一步的实验和流式细胞仪分析检查的纯度对于T细胞过继转移，如在本协议中所述的隔离等位基因的识别標记包括CD45和Thy1.1系（转移细胞）和Thy1.2（宿主T细胞）。

一个特定的细胞群（即巨噬细胞直流，T细胞等）的产量会有所不同根据肿瘤的大小和治療方法，是管理一起注册在肿瘤的生长前列腺从未经处理的14-16周老流浪汉鼠标之间应产生8x10的^{5-1×6 +（DC）}的90-95％的纯度或1×10 ⁶ 1.5×10 ⁶ F4/80的细胞素CD11c ⁺ / PDCA的1 ⁺ / CD11b的在80-90％，從300毫克的组织的纯洁性（巨噬细胞）以上的隔离协议 如图1所示。继转移肿瘤抗原特异性T细胞后这些细胞的数量略有增加。穷人的纯度通常是不足洗涤让干列（这可能会导致肿瘤碎片保留在列），或不足的Fc受体阻断

同样，从分离的B16肿瘤细胞总数也将有所不同取决于肿瘤的大小在组织收割的时间和带或不带DC疫苗（T细胞转移5X10 ^{6）（1×10 5}转）继转移。极少数抗原-SPEcific T细胞浸润的肿瘤抗原致敏的DC疫苗除非也给T细胞轉移后有一天。如果一个DC疫苗管理鼠标轴承小，扪及肿瘤（<50毫米^2）约3X10 ⁵ Thy1.1系^{+ T}细胞纯度80-85％，产量将被视为一个“好“丰收图2A所示。但是洳果肿瘤较大的收获，总收率和纯度将减少

巨噬细胞（F4/80的⁺ /细胞CD11b ^+）通常是在B16肿瘤细胞总数的比例较小。 图2B显示利用从肿瘤细胞CD11b，是250平方^毫米 产生巨噬细胞约1×10 ^6，纯度在90％-95％ 此外， ⁶ CDC预计从250平方^毫米的B16肿瘤纯度在80％-90％降低纯度通常是从列中的肿瘤细胞不清除的结果。步驟2.12是一个关键步骤消除黑色素细胞的小丛，在列的基础仍然存在经过这一步，提高纯度更好的洗涤步骤和结果的有效性

图1。DCS（CD11c的⁺ / PDCA循環^-1）和巨噬细胞（F4/80的⁺ /细胞CD11b ^+）从流浪汉前列腺肿瘤分离点积值表示兴趣前或净化后的细胞百分比。

^-从传统的DCS和F4/80的⁺ /细胞CD11b ⁺巨噬细胞皮下分离B16 Thy1.2 ⁺小鼠的黑色素瘤点积值表示兴趣前或净化后的细胞百分比。