(01177)公布附属正大天晴药业的替诺福韦生产线获欧盟颁发EU-GMP(欧盟-药品生产质量管理规范)认证证书，标志著集团从「聚焦国内」向「国内外协调发展」战略转型迈出坚实一步

　　替诺福韦为治疗慢性乙型肝炎的一线药品，并被收录于中国上市药品目录集

：蚯蚓纤连蛋白酶在乙型肝炎治療中的应用的制作方法

本发明属于生物技术的领域具体地说，本发明提供蚯蚓纤连蛋白酶 降解纤维连接蛋白的应用以及在乙型肝炎治療中的应用。

乙型肝炎简称乙肝，是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的传染病 通过血液与体液传播，具有慢性携带状态本病在我国广泛流行。據有 关资料肝炎检测阳性的患者己经达到1.89亿，而应就诊未就诊人数(携 带者)将近4亿是当前危害人民健康最严重的传染病。多见于儿童及 圊壮年乙肝临床表现多样化，易发展为慢性肝炎和肝硬化少数病人 可转变为原发性肝癌，这些疾病对病人以及社会的危害更加严重

發病过程 一般来说，肝细胞受乙肝病毒入侵后乙肝病毒本身并 不直接引起肝细胞的病变。乙肝病毒只是利用肝细胞摄取的养料赖以生 存並在肝细胞内进行复制病毒复制的表面抗原、e抗原和核心抗原都释 放在肝细胞膜上，激发人体的免疫系统来辨认并发生反应。这种在肝 细胞膜上发生的抗原抗体反应可造成肝细胞的损伤和破坏从而产生一 系列临床症状。

治疗手段我国多数患者是在围生期或年幼时感染HBV慥成免疫耐 受往往形成慢性感染，这些患者需要积极而有效的治疗否则可能发 展为肝硬化甚至肝癌，导致死亡然而迄今尚无一种可靠的治疗方法能 清除或永久抑制HBV的复制，从而终止肝脏的炎症和坏死慢性乙型肝 炎目前的治疗目标是①抑制HBV复制(HBsAg、 HBeAg消失)；②非 扩增法检測不出HBVDNA水平；③病情改善，ALT复常；④肝组织学 改善； 减少肝脏失代偿、肝硬化、肝细胞肝癌的发生率目前用于治疗乙肝的药物主要包括幹扰素、核苷酸类似物等抗病毒药物和胸腺肽等 免疫调节药物。

1. 传统干扰素与聚乙二醇干扰素干扰素目前仍是治疗乙型肝炎 的一线药物咜具有明确的疗程，疗效好可使HBsAg消失和抗HBs 产生，无耐药性等优点但是由于同时存在副作用较多、不能使用于失 代偿性肝硬化患者、注射治疗麻烦及代价昂贵等缺点而限制了其使用。 在美国很多的医生倾向于选择核苷(酸)类似物治疗慢性乙肝。

2. 拉米夫定短期用拉米夫定对HBV DNA嘚抑制作用、HBeAg 转阴率、HBeAg血清转换率及血清ALT复常率均优于干扰素而且服用 方便，可以用于失代偿性肝硬化及肝移植前后患者但是其持续應答率 不及干扰素，而且存在一个较突出的耐药性问题且随着服用时间的延 长，耐药性也会逐渐增加

3. 阿德福韦酯是一新型核昔(酸)类似粅，口服阿德福韦酯是阿德 福韦的前体能有效抑制乙肝病毒复制、改善组织学、延缓疾病进展成 肝硬化、肝功能失代偿及肝癌，它的耐藥性发生低于拉米夫定且对拉 米夫定耐药者有很好的治疗效果，但是长期服用有一定肾毒性需定期 监测血清肌酐和血磷。

4. 恩替卡韦是環戊酰鸟苷类似物我国SFDA去年年底刚批准 用于慢性乙型肝炎的治疗。

5. 其他其他还在进行n、 m期临床试验的药物有恩曲他滨、特必

6. 免疫调节治療免疫调节治疗是治疗慢性乙型肝炎的重要手段之

一目前用于治疗乙型肝炎的免疫调节药物主要是胸腺肽。胸腺肽剌激

T细胞增强非特異性免疫功能，其不良反应小耐受性好，使用安全

对于有抗病毒治疗指针，但不能耐受或不愿接受干扰素和核苷酸类似物 治疗的患者鈳选用胸腺肽

随着乙型肝炎发病机理研究的深入，研究工作者发现纤维连接蛋白

在乙型肝炎发病过程中发挥着重要作用纤维连接蛋白(Fibronectin， FN) 是一种存在于血液、体液及各种组织中的具有多种功能的糖蛋白来源 于肝细胞，枯否细胞和内皮细胞通过与整合素结合调节细胞间嘚粘附、免疫、凝血和血小板的聚集，另外在肿瘤与纤维化的发展与发病机制中 FN也起着重要的作用。

一、 纤维连接蛋白的结构及功能

FN按汾布不同可分为两种 一种是分布于血浆的血浆型FN(pFN)， 另一种是广泛分布于人体内细胞表面的细胞型FN(cFN) pFN是一种可溶 性的蛋白质，在血液中浓喥很高血液中的可溶性的FN大部分是由肝细 胞合成。cFN作为不溶性FN的一部分可以掺入到细胞周围基质中，肝 脏中的FN主要由内皮细胞贮脂細胞及枯否细胞分泌。FN分子可以结合 多种分子发挥其功能如胶原蛋白、肝素、血纤维蛋白及细胞表面受体， 其中与细胞表面受体的结合主要是通过FN分子中的RGD序列识别RGD 序列的一些粘合素分子都可以识别FN中的RGD序列，所以FN可通过RGD 与受体相连从而发挥调节作用。

FN还具有病毒结匼活性与甲型肝炎病毒(HAV)结合后，发生HAV 的屏蔽现象可干预病毒检测的放免法，通过富含FN的血产品有助于肝 炎病毒的频繁传播有学者发現人肝脏中的FN通过与HBV前S2区编码的 一特异抗原决定簇结合，从而使病毒在肝窦内循环时被肝细胞所吸收 促进病毒对肝细胞的作用。同时茬肝纤维化及肝细胞癌时，FN在RNA 水平发生变化

二、 纤维连接蛋白与慢性肝炎、肝硬化

HCV和HBV感染后常进展为慢性病毒性肝炎。慢性肝病尤其是活动 性病变由于致病因素的持续作用和机体免疫功能失调，以致肝细胞持 续受损纤维组织不断增生而导致肝硬化。Martinez-Hernandez等提出FN 在肝脏的纤維化过程中发挥重要的作用可促使肝细胞分泌胶原，促进 成纤维细胞的趋化性促进成纤维细胞及肝细胞等与胶原基质的粘附作 用。存茬于成纤维细胞表面的细胞连结素它与酸性粘多糖及胶原具有 很强的亲和性，以FN为核心结合粘多糖及胶原成为三元复合体，做成 细网構造被视为肝纤维化的基础。与正常人群相比较慢性活动型肝 炎(CAH)患者中FN水平明显增加。

血浆型FN绝大部分由肝细胞合成炎症造成血浆ΦFN消耗导致血浆 中FN降低，FN减少则反映了肝细胞合成蛋白质功能的减退故在肝硬化时，血浆FN水平则明显降低然而在急、慢性肝炎时增加。Odenthal等 提出在肝纤维化的急性阶段及接近纤维化阶段细胞型的FN mRNA表达 增加。Jamagin等用鼠急性肝损伤模型检测到内皮细胞主要产生EIII-A 阳性的FN，相反被激活的贮脂细胞主要分泌EIII-B阳性FN Shigem等采 用免疫组化及原位杂交法检测到了在肝纤维化区细胞型FN(EIII-APR阳 性)沉积，提示细胞型FN在肝纤维化时起关键莋用在纤维化肝脏中，肝 细胞与非实质细胞中细胞型FN的mRNA表达增加而且表达FN的细胞也 有所增加，细胞型FN在肝纤维化形成的早期发挥着重偠的作用 三、纤维连接蛋白与肝细胞癌

细胞外基质(ECM)被认为在肿瘤、肿瘤侵袭及转移中发挥重要的作 用。不同分化的肝癌其ECM定位不同FN、 FN受体(整合素a5与(31)及其 片段mAD2(恶性病变相关DNA连接蛋白2)的研究，提示整合素a5(31和FN 与肝癌分化有关并影响肝癌的侵袭性与转移。

现已证实FN参与慢性肝燚、肝硬化及肝癌的发生发展主要通过选 择性剪切和改变与受体的结合来发挥调节作用。其在分子水平中的调控 机制仍不清楚尚需进┅步的研究。

蚯蚓俗称地龙其种类繁多，资源丰富蚯蚓作为药物使用，在我 国已有1200多年的历史最原始的方法是利用整个鲜蚯顿或干蚯顿；随 着发展，后来发现蚯蚓的药用价值与其中含有的多种化学成分有关目 前已经分离到多种不同纯度的蚯蚓成分，其中包括纤溶酶、纤溶酶原激 活剂、钙调素和钙调素结合蛋白、胆碱酯酶、过氧化氢酶、超氧化物歧 化酶SOD、促髓系细胞增殖组分、抗微生物蛋白、收縮血管蛋白、溶血 蛋白、免疫球蛋白样粘连物和抗肿瘤蛋白、抗菌肽等取得了较大的进 展。

种氨基酸序列的共性具有共同的功能域H43 D91， S^(其上編号对应

8IDNO.ll与SEQIDNO.l具有85%以上的同源性)本发明首次发现其 在与血清孵育过程中可迅速降解血清组分纤维连接蛋白，因此将其称为 蚯蚓纤连蛋白酶通过进行用所述蚯蚓纤连蛋白酶对HepG 2.2.15细胞水 平的作用的研究，发现蚯蚓纤连蛋白酶处理组对HBsAg HBeAg的分泌 具有抑制作用，通过用所述蚯蚓纤连疍白酶对HBV转基因小鼠的治疗作 用的研究表明转基因小鼠血清中ALT， AST上升被抑制HBsAg分泌 受到抑制，并且其可使HBsAg转基因小鼠的肝脏坏死病变减輕因此， 所述蚯弼l纤连蛋白酶可以用于制备预防或治疗与纤维连接蛋白相关的疾 病如乙型肝炎的药物的应用。

发明内容 本发明的一个目的是提供蚯蚓纤连蛋白酶用于降解纤维连接蛋白的 应用

在一个实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.l

在另一个实施方案Φ，所述蚯蚓纤连蛋白酶具有这样的氨基酸序列 其氨基酸序列具有H43， D91 S,其上编号对应于SEQ ID NO.l氨基酸 序列)组成的催化三联体。

在一个实施方案Φ所述蚯蚓纤连蛋白酶具有这样的氨基酸序列，所 述氨基酸序列与SEQ ID NO.l具有80%以上的同源性

在一个实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶具有这樣的氨基酸序列所 述氨基酸序列与SEQ ID NO.l具有85%以上的同源性。

在一个实施方案中所述蚯蚓纤连蛋白酶的用量为0~10pM。 在一个实施方案中所述蚯蚓纤连蛋白酶的用量为0-2pM。 在一个实施方案中所述蚯蚓纤连蛋白酶的用量为0-5pg/ml。 本发明的另一个目的是提供所述蚯蚓纤连蛋白酶用于制备药粅的应

用所述药物用于预防或治疗与纤维连接蛋白有关的疾病。

在一个实施方案中所述疾病为乙型肝炎，慢性乙型肝炎肝硬化，

在┅个实施方案中所述蚯蚓纤连蛋白酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.l。

在另一个实施方案中所述蚯蚓纤连蛋白酶具有这样的氨基酸序列， 其氨基酸序列具有H43 D91， S^(其上编号对应于SEQ IDNO.l氨基酸 序列)组成的催化三联体

在一个实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶具有这样的氨基酸序列所 述氨基酸序列与SEQ ID NO.l具有80。/以上的同源性。

在一个实施方案中所述蚯蚓纤连蛋白酶具有这样的氨基酸序列，所 述氨基酸序列与SEQ ID NO.l具有85%以上的同源性

SEQIDNO.15 所示的氨基酸序列的单一组分使用。

在一个优选实施方案中所述蚯顿纤连蛋白酶的剂量为2000mg/kg 大鼠体重。

在一个优选实施方案中所述蚯蚓纖连蛋白酶的剂量为50mg/kg小 鼠体重。

本发明还提供一种用于治疗与纤维蛋白相关的疾病的药物所述药物 包含上述蚯虫引纤连蛋白酶作为活性荿分。所述药物的有效量可以由本领 域技术人员根据实际情况确定

在一个实施方案中，所述疾病为乙型肝炎慢性乙型肝炎，肝硬化

茬一个优选实施方案中，所述药物所用剂量为2000mg/kg大鼠体重 在另一个优选实施方案中，所述药物所用剂量为50mg/kg小鼠体重 所述药物的所用配制方法，使用方法以及所用的辅料为本领域技术人 员所众所周知本发明所针对的对象，为哺乳动物如人，小鼠大鼠。在一个实施 方案Φ本发明所述的蚯蚓纤连蛋白酶以及包含其的药物针对人进行施 用。

本发明通过蚯蚓纤连蛋白酶与人血清孵育后SDS-PAGE检测血清蛋 白的变化艏次发现所述蚯蚓纤连蛋白酶有快速降解纤维连接蛋白的能 力。本发明将所述蚯蚓纤连蛋白酶与血清共孵育经SDS-PAGE发现有 几个血清蛋白条带消失或者变淡。经质谱鉴定得到一快速降解的蛋白 为纤维连接蛋白。该蛋白在机体内有相当多的生理功能其中之一就是 与乙型肝炎病變的发展有关。用蚯蚓纤连蛋白酶降解纤维连接蛋白纯品 将降解片段进行N端测序，发现作用位点比较单一主要集中在赖氨酸 和精氨酸兩个碱性氨基酸附近，具有典型的胰蛋白酶的特性具有一定 的水解特异性。

本实验还进行了所述蚯蚓纤连蛋白酶对HepG 2.2.15细胞水平的作用 的研究实验结果表明，与空白细胞相比蚯蚓纤连蛋白酶处理组HBsAg， HBeAg的分泌均受到抑制细胞培养基中HBsAg， HBeAg含量有所下降 与拉米夫定阳性对照組相比，蚯蚓纤连蛋白酶对HBeAg的分泌有更强的 抑制作用

本实验室还进行了蚯蚓纤连蛋白酶对HBV转基因小鼠的治疗作用的 研究。结果表明与苼理盐水阴性对照组相比，转基因小鼠血清中ALT AST上升被抑制，HBsAg分泌受到抑制这两个指标均优于拉米夫定的 治疗效果。生理盐水组及拉米夫定组转基因小鼠的血清FN随生存时间的 延长而增加使用蚯蚓纤连蛋白酶后含量基本维持在恒定的水平。对肝 脏的病理学观察结果显示蚯蚓纤连蛋白酶组对乙型肝炎有治疗作用，

与生理盐水组相比可使HBV转基因小鼠的肝脏坏死病变减轻，疗效与 拉米夫定组类似

因此，本發明在HBV转基因小鼠水平证明蚯蚓纤连蛋白酶对乙型肝 炎转基因小鼠的HBsAg分泌有一定的抑制作用对血清ALT、 AST维持 正常的水平有有益的帮助。乙型肝炎转基因小鼠病理切片观察发现蚯 蚓纤连蛋白酶对HBV转基因小鼠的肝脏病变有一定的保护作用。

本发明认为蚯蚓纤连蛋白酶在对乙型肝炎治疗中对慢性乙型肝炎的治疗更有优势。目前临床使用的乙型肝炎治疗药物包括干扰素、拉

米夫定、阿德福韦酯等主要使HBsAg,HBVDNA恢复到┅定的水平。但 乙型肝炎治疗的另一个困难是病变引起肝硬化的发生蚯蚓纤连蛋白酶 恰巧具有降解纤维连接蛋白的能力，不仅可以在一萣程度上阻断病毒的 传播而且可以降低肝脏的纤维连接蛋白的量，缓解肝硬化的发生

本发明认为蚯弼l纤连蛋白酶对乙型肝炎、尤其是慢性乙型肝炎预防和 治疗作用机理之一是蚯蚓纤连蛋白酶有快速降解纤维连接蛋白的能力。 由于纤维连接蛋白在机体内的生理功能很多與细胞间的粘附、免疫、 凝血和血小板的聚集以及老化都有关系，所以预期蚯蚓纤连蛋白酶对凝 血、肿瘤等疾病也有一定的作用

图h蚯蚓纖连蛋白酶与血清共同孵育后SDS-PAGE图

A:血清在37。C孵育不同时间后SDS-PAGE图(M:标准分子量；1:对照

B:蚯蚓纤连蛋白酶与血清在37C共同孵育不同时间后SDS-PAGE图(M:

图4:大鼠口垺蚯虫引纤连蛋白酶后血清中纤维连接蛋白相对含量的变化 (Mean士SD, n=6).

5-4:血清中纤维连接蛋白FN相对含量的变化 5-5:转基因小鼠肝脏病理观察结果

A:生理盐水組(IO倍)B:蚯蚓纤连蛋白酶处理组(IO倍) C:拉米夫定组(IO倍)

以下本文将通过具体的实施例来描述本发明。如未特别指明之处可

根据本领域技术人员所熟悉的参考书如蛋白质技术手册(汪家政、范 明主编，科学出版社)、抗体技术实验指南(沈关心、龚非力等译科学 出版社)、药理实验方法学(第彡版，主编徐淑云人民卫生出版社)、 分子生物学实验指导(刘进元，清华大学出版社)、分子克隆实验指南(第 三版黄培堂等译，科学出版社)等以及本文所引用的参考文献中所列 的方法来实施

实施例l蚯蚓纤连蛋白酶与血清共孵育试验

2. 将上述血清酶解产物及空白血清孵育样品鼡去离子水稀释10倍，加入 2xSDS-PAGE上样缓冲液煮沸10分钟，进行8% SDS-PAGE最后以考 马斯亮蓝染色。

3. SDS-PAGE图见图1结果显示空白血清在37。C孵育不同时间蛋白质条 帶无明显变化(见图1A)血清与蚯蚓纤连蛋白酶的孵育产物中有一些蛋 白条带迅速降解(见图1B)。

实施例2典型蛋白条带的鉴定

1. 将所选择的胶带'a用切胶笔切下，置于eppendorf(EP)管中并记录

4. 重复步骤3，直至蓝色褪去；

5. 加乙腈50jaL脱水至胶粒完全变白真空抽干5min;

8. 依次用25mMNH4HC03、 50%乙腈溶液和100%乙腈洗，乙腈脱水箌 胶粒完全变白为止真空抽干5min;

9. 将0.1吗/pL的胰蛋白酶储液以25mMNH4HCO3稀释10倍，每EP管 加2nL稍微离心一下，让酶液充分与胶粒接触4。C或冰上放置30min 待溶液被胶块完全吸收，加25mMNH4HC03 10-15pL置37°C消化过夜；

11. 消化产物上清液进行质谱分析(参考蛋白质化学与蛋白质组学一书。 夏其昌、曾嵘等科学出版社)，獲得酶解肽段的分子质量

结果鉴定结果表明，蛋白条带V为纤维连接蛋白(见图2在鉴定肽段 中，有21个肽段与纤维连接蛋白的酶解肽段比对荿功可能性分数为92， 结果可靠)实施例3蚯蚓纤连蛋白酶对纤维连接蛋白水解位置的确定

3. 蚯蚓纤连蛋白酶对纤维连结蛋白的作用位点见图3。结果显示蚯蚓纤 连蛋白酶对纤维连结蛋白的作用位点比较单一主要集中在赖氨酸和精 氨酸两个碱性氨基酸附近，具有典型的胰蛋白酶嘚特性

实施例4大鼠口服蚯蚓纤连蛋白酶后血清中纤维连接蛋白浓度的变化

1. 选择健康雄性SD大鼠6只(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)

3. ELISA法测定上述血清中纤维连结蛋白的浓度

(4) 加入IOO pl辣根过氧化物酶标记的IgG二抗(北京中杉金桥生物 技术有限公司)，37"孵育lh PBST洗涤。

(5)加入100 ^显色剂暗处显銫10分钟加入50 pl 2M的硫酸终止反应。

蛋白的ODo值为100%用药后某一时刻t纤维连结蛋白的相对浓度

4.大鼠灌胃服用蚯蚓纤连蛋白酶后血清中纤维连接蛋皛浓度的变化见图 4。结果显示纤维连接蛋白浓度首先随着时间的延长而降低约4小时达 到最低点，然后随时间的延长有所恢复

实施例5蚯蚓纤连蛋白酶对HBV转基因小鼠的治疗作用

1. 实验动物C57BL/6J-HBV转基因小鼠(购自北京大学医学部实验动 物部)。转入的基因片段是编码包膜蛋白HBsAg的S基因preS基洇以及 编码X抗原的X基因(参考文献董宇红、席宏丽、田枫、康爱君，苦 参素对HBsAg转基因小鼠血清Thl和Th2细胞因子水平的影响中华实验和 临床病毒学雜志2004， 18 (3) 277-280 Chisarl FV. Hepatitis

分泌HBsAg的高低(以OD值(450nm)的大小表示)进行分组，每组9 □

阳性对照拉米夫定(灌胃剂量为100mg拉米夫定/kg小鼠体重) 药物蚯蚓纤连蛋白酶(混合物(与上哃)灌胃剂量为50mg蚯蚓 纤连蛋白酶/kg小鼠体重)

(1) 灌胃每天灌胃一次，持续21天观察至30天。

(2) 取血分别在用药前用药10天、20天取血，制备血清测定穀-丙转氨酶(ALT)，谷-草转氨酶(AST)(使用中生北控公司的IFCC推 荐法仪器为日立7170A型全自动生化分析仪。操作步骤按照试剂盒说明 书进行操作)在用药后7、 14、 21、 30天取血，制备血清测定HBsAg

因为小鼠血容量有限，为了保证小鼠的生存质量每次取血体积一 般控制在0.2ml以下，并间隔足够的时间所鉯测定ALT、 AST的取血时 间与测定HBsAg的取血时间不同。

(3) 取组织在实验最后一天取血完成后断颈处死小鼠，收集肝组织 部分保存于4%甲醛中固定，淛备石蜡切片HE染色，进行肝脏病理变化 观察；部分保存于液氮中备用

5. 实验结果随着实验的进行，三个实验组动物活动状态没有显著性嘚 差别体重也没有显著性差异。与生理盐水组相比转基因小鼠血清中 ALT, AST上升有所抑制，结果见图5-l 5-2。与生理盐水组相比转基 因小鼠血清中HBsAg有所降低，结果见图5-3转基因小鼠血清中纤维连 接蛋白(FN)含量的变化见图5-4，结果显示生理盐水组及拉米夫定组 转基因小鼠的FN随生存时間的延长而增加，蚯蚓纤连蛋白酶实验动物组

18FN含量基本维持在恒定的水平对转基因小鼠肝脏的病理学观察结果见

图5-5。 A:生理盐水组肝小葉结构存在，肝细胞水肿以肝小叶中央区 为著。肝血窦和中央静脉明显扩张点灶状肝细胞坏死，每10个低倍视 野可见12个肝细胞坏死灶B:肝小叶结构存在，肝细胞水肿以肝小叶 中央区为著。肝血窦和中央静脉明显扩张点灶状肝细胞坏死和少量单 核淋巴细胞浸润，每10个低倍视野可见4个肝细胞坏死灶C:肝小叶结 构存在，肝细胞水肿以肝小叶中央区为著。肝血窦和中央静脉明显扩 张小灶状肝细胞微泡状脂肪性变性，每10个低倍视野可见4个肝细胞坏 死灶生理盐水组6只转基因小鼠，蚯蚓纤连蛋白酶处理组6只转基因小 鼠与拉米夫定组6只转基因小鼠的肝组织病理切片观察结果表明与生理 盐水组相比蚯顿纤连蛋白酶实验动物组HBsAg转基因小鼠的肝脏坏死 病变减轻，疗效与拉米夫定组类姒

实施例6蚯蚓纤连蛋白酶对H印G 2.2.15细胞水平的作用

阳性对照拉米夫定处理组；

用药组蚯虫引纤连蛋白酶处理组(单一组分SEQIDNO.l)。

将HepG2.2.15细胞进行接种(96孔板每孔lx104个细胞)。细胞接种 三天后分别加入不同浓度的蚯蚓纤连蛋白酶(培养基中药物终浓度为 0-5(ig/ml)和拉米夫定(培养基中药物终浓度为0-100)iM)。细胞接种六天时更换相应的含药培养基在细胞接种九天时收集细胞培养基，用于

4. HBsAg HBeAg的测定方法将步骤3收集的细胞培养基12000rpm离心 5min，取适量采用乙型肝炎病毒s抗原及e抗原诊断试剂盒(酶联免疫 法，华美生物工程公司)按照说明书步骤进行测定

5. 实验结果见图6，结果表明与空白细胞相仳，蚯蚓纤连蛋白酶处理 组HBsAg HBeAg的分泌均受到抑制，细胞培养基中HBsAg HBeAg 含量有所下降。蚯蚓纤连蛋白酶的几种纯化产物的氨基酸序列序列表

1. 乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒对纤维连接蛋白基因表达的调节胃肠

2. 纤维连接蛋白在慢性中毒性肝病中的变化及其意义。现代中西医结 合杂誌2003 12 (16) : 。

3. 纤维连接蛋白检测在肝病中的临床意义中国热带医学2006， 6(5): 818-819

<110>中国科学院生物物理研究所

<120〉蚯顿纤连蛋白酶在乙型肝炎治疗中的应用

權利要求 1.蚯蚓纤连蛋白酶用于降解纤维连接蛋白的应用。

2.权利要求1的应用其中所述蚯蚓纤连蛋白酶的氨基酸序列为SEQ IDNO.l。

3. 权利要求1的应用所述蚯蚓纤连蛋白酶具有这样的氨基酸序列， 其氨基酸序列具有H43 D91， S^(其上编号对应于SEQIDN0.1氨基酸序 列)组成的催化三联体

4.权利要求1或3的应用，所述蚯蚓纤连蛋白酶具有这样的氨基酸序 列所述氨基酸序列与SEQ IDNO.l具有80%以上的同源性。

6.蚯躬l纤连蛋白酶用于制备药物的应用所述药物用于預防或治疗与 纤维连接蛋白有关的疾病。

7.权利要求6的应用所述疾病为乙型肝炎，慢性乙型肝炎肝硬 化，肿瘤疾病

8. 权利要求6或7的应用，所述蚯蚓纤连蛋白酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.l

9. 权利要求6或7的应用，所述蚯蚓纤连蛋白酶具有这样的氨基酸序 列其氨基酸序列具有H43， D91 S'88(其上编號对应于SEQIDN0.1氨基 酸序列)组成的催化三联体。

10. 权利要求6或7的应用所述蚯蚓纤连蛋白酶具有这样的氨基酸 序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO.l具有80%以上的哃源性

15. —种用于治疗与纤维连接蛋白相关疾病的药物，所述药物包含所述 蚯蚓纤连蛋白酶作为活性成分

16. 权利要求15的药物，其中所述纤維连接蛋白相关疾病为乙型肝炎 慢性乙型肝炎，肝硬化或肿瘤疾病

全文摘要 本发明属于生物技术领域，本发明提供了蚯蚓纤连蛋白酶對纤维连接蛋白的降解作用；本发明还提供了所述蚯蚓纤连蛋白酶用于治疗乙型肝炎的应用尤其是对慢性乙型肝炎，乙型肝炎引起的肝硬化的预防和治疗作用；本发明还提供了一种药物所述药物包含所述蚯蚓纤连蛋白酶作为活性成分。

荣 潘, 王学清, 蓉 肖, 赫荣乔, 岚 陈 申请人:Φ国科学院生物物理研究所

　　瑞银集团发表研究报告指Φ生制药(01177)第三季收入按年升52%，扣除整合Tide的影响后收入升27%，胜预期料集团全年收入及纯利均可录得健康增长。

　　不过由于新药品集團采购(GPO)竞标名单尚未公布，尚需时检讨有关政策对中生制药药品目录的影响不过，集团旗下的乙肝药品恩替卡(Entecavir)拥有60%市占率在竞争加剧丅，相信恩替卡无可避免会受影响

　　该行将集团2019至2020年盈测下调5%及7%，以反映恩替卡将面对的压力以及其他乙型肝炎药品的疲弱表现，目标价由14.43元降至13元评级维持「买入」。

　　(文章来源：经济通中国站)