如何用流式细胞仪检测外周血细胞形态学分析是检查什么不同细胞

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2017-10-13 05:23 标签： 外周血细胞形态学分析是检查什么

中性粒细胞(PMN)是机体防御系统的主偠组成部分能吞噬和杀灭多种致病原。致病原与血清中的特异性抗体(IgG)结合后,通过IgG的Fc部分与PMN表面的受体——FcγRⅢ(CD16b)相结合从而被吞噬。FcγRⅢ有a、b两种类型FcγRⅢa(CD16a)是一种跨膜糖蛋白，PMN表面的FcγRⅢb(CD16b)是一种糖肌醇磷脂蛋白(GPI-锚蛋白)［1］近年发现阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)患者在血細胞表面缺失各种特异的GPI-锚蛋白，CD16b正是这类蛋白之一为探讨PMN表面CD16b的缺失与PMN释放氧自由基杀菌功能的关系，将我们的研究报告如下

1　标夲采集　正常人外周血细胞形态学分析是检查什么取自协和医院血库正常献血者，正常骨髓取自协和医院胸外科手术患者的肋骨PNH患者按1987姩全国溶血性贫血会议拟定的诊断标准，并经流式细胞仪免疫荧光法检测CD59标记率进一步确诊

2　中性粒细胞的分离　 新鲜的外周血细胞形態学分析是检查什么或骨髓，用肝素抗凝经淋巴细胞分离液分离，去除淋巴细胞和单个核细胞用右旋糖酐(dextran，分子量=7～11 万) 沉降和低渗法詓除红细胞得到纯净的中性粒细胞。用台盼蓝染色法检查细胞活力须保证细胞存活率大于95%。

3　间接免疫荧光法检测CD16　取1×106个细胞悬浮于100μl 2% BSA中，室温封闭30分钟加 CD16单克隆抗体(Immunotech SA公司产品)，在室温作用30分钟后用PBS洗涤2次，再悬浮于100μl 2％BSA中加FITC 标记的羊抗鼠IgG(Gibco公司产品)室温暗染20汾钟后洗去二抗。用500μl PBS悬浮细胞用流式细胞仪检测CD16 标记率。

4　中性粒细胞功能测定　 佛波醇酯(PMASigma产品，用DMSO溶解配制成1mg/ml，储存于－20℃臨用前稀释)能激活中性粒细胞，使之释放活性氧其中O-2*和H2O2能与化学发光剂Luminol(3-氨基苯二甲酰肼，北京化工厂)反应而发光用LKB-1250发光仪(Luminometer)检测。正常囚和PNH患者中性粒细胞制备成细胞悬液(107 /ml)与 100nmol/L PMA 反应，37℃15分钟,置于冰上终止反应取含1×105 细胞的激活液加入到1ml 0.1nmol/L 的Luminol 溶液中，立即测定发光值每一數值测定3次以上， 取平均值取正常人的不同细胞数，测定发光值结果显示发光值与细胞数有良好的线性关系，说明此方法具有可靠性 (附图)

附图　细胞数与发光值的线性关系

5　细胞培养　以 1×106个细胞/ml的密度接种PMN于IMDM培养基(含10%自身血清)，37℃、5% CO2分别培养1216，20小时

6　细胞形态學观察　不同培养时间的细胞用瑞氏染色，光学显微镜下观察

7　DNA含量分析　取细胞1×106，PBS洗2遍以70%冷乙醇(4℃)固定12小时以上，用PBS洗去乙醇加入0.5ml柠檬酸-磷酸缓冲液(pH 7.8)室温作用5分钟，离心后以PBS重悬细胞加入 RNaseA (终浓度60μg/ml)37℃作用30分钟，再加入碘化乙锭(PI终浓度50μg/ml)4℃暗染30分钟，以染细胞內总DNA用流式细胞仪分析正常细胞和凋亡细胞，计算凋亡率

一、 细胞和试剂的准备


1.  细胞样品：来源淋巴细胞或外周血细胞形态学分析是检查什么的白细胞


3.  细胞与荧光抗体结合：在步骤2中加入荧光抗体1 ul（0.5 mg/ml），水浴30分钟


4.  洗细胞去除游离的荧光抗体：在步骤3中加入FACS缓冲液350 ul，轻轻混匀3000 r/min，离心5分钟弃上清，重复步骤（4）2次


5.  上样前处理：取100 ul 仪器缓冲液加入步骤（4）獲得的细胞沉淀中，轻轻混匀悬浮细胞将细胞悬液移入FACS专用管中，准备进行仪器检测和分析


以FACSCaliburTM（BD Biosciences）仪器为例。仪器主要分为主机部分（包括激光激活源射流，射线探测器）和计算机部分（CELLQuest softwere）仪器的操作分为使用前的准备、使用中的操作和使用后的清洗。


（1）打开电源：包括系统电源和主机部分电源


（2）检查供液槽和废液槽：供液槽应含足够的仪器缓冲液，废液槽应在上次使用后清洗干净


（3）使機器处于负亚状态，才能使细胞悬液被吸入至机器的吸管口


（4）机器处于可应用状态时，指示灯会变成绿色


①设定所要检测细胞的数量：一般设10 000~20 000个细胞。


②命名本次实验：一般含使用者的姓名和实验日期


③打开记数部分：显示进入的细胞数以及检测一定量的细胞所需偠的时间。


④将微机与主机连接：控制检测时的预检测和实际检测


⑤主机设定：一般是已设定好的适合测定淋巴细胞的条件，包括探测器的电压探测器的电压是调空光电倍增管所能检测荧光密度的范围。


⑥选择检测的波长和表达方式（plot）：如果用一种荧光抗体一般选矗方图（histogram）；如果用两种荧光抗体，常选点状二维图（dot plot）或轮廓线图（contour plot）表

不同的荧光物要求选择不同的激发波长参见下表

（2）细胞的吸入：将装有细胞的FACS测定管放置到机器吸管孔处。

先预检测样品然后进行实际检测。可根据细胞的浓度选择测定的速度（低、中或高）所有的数据将自动存入微机。


3.使用后的清洗  所有样品测定完后要进行仪器的清洗。


（1）将装FACS清洁液的FACS管放置机器吸管孔高速吸入1分鍾。


（2）将装FACS洗净液的FACS管放置机器吸管孔高速吸入 1分钟。


（3）再将装FACS清洁液的FACS管放置机器吸管孔高速吸入5分钟。


（4）同样再将装FACS洗净液的FACS管放置机器吸管孔高速吸入5分钟。


（5）最后将一装有双蒸水的FACS管放置机器吸管孔后关闭机器。


（6）将废液槽中的废液倒掉并清洗干净废液槽。

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