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荧光定量PCR实验（qPCR）
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实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。·
Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。
主要实验步骤如下：
1. 设计并合成Realtime
2. 引物溶解后，进行预PCR反应，优化PCR条件。
3. 样品RNA抽提
实验对象为组织样品，取适量（50-100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品加1ml的RNA抽提试剂Trizol，匀浆后抽提RNA。
实验对象为细胞样品，每份样品取1×106-1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加1ml的RNA抽提试剂Trizol，裂解后抽提RNA
4. RNA质量检测
a. 利用分光光度计测定RNA浓度并评估RNA纯度
b.进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性。
5. 使用逆转录酶进行反应，将样品RNA逆转录为cDNA。
6. 制备标准曲线样品：
进行相对定量，需要先将样品的目的基因以及管家基因进行PCR扩增，其产物进行梯度稀释用于做标准曲线。
7.进行RealTime PCR扩增和检测。
8. 检测结果进行标准曲线分析：以对待测样品的目的基因进行定量。相对定量实验需要进一步用样品的目的基因测得值除以管家基因测得值以校正误差，所得结果代表某样品的目的基因相对含量。
9. 实验报告：包括详细的实验方法及实时荧光定量PCR实验结果的相关图表
服务内容：
1）RNA提取与质量检测电泳图
2）RT-PCR扩增曲线示例（三重复避免系统误差）
3）RT-PCR结果柱状图示例（检测干扰效率）
4）靶基因与内参溶解曲线图（检测扩增质量）
5）DNA片段扩增质量检测电泳图
6）并提供详细的实验报告（包含详细的实验数据图片、步骤等，以及使用的仪器）
送样须知：
1）由于RT-qPCR可以检测任何类型样本中基因的表达量，如组织、细胞、细菌等材料。因此本公司接受任何类型的样本，对于不同的样本需要的量有所不同，具体需要量请咨询本公司。
2）不推荐提供RNA样品或cDNA，除非您能充分证明所提供RNA/cDNA是高质量的且可用于RT-qPCR。
3）客户提供尽可能详细的背景信息；物种信息，扩增目的基因的NCBI登录号等。
4）客户可以提供RT-qPCR引物，如果没有引物，本公司可以帮助设计合成，但要另外收费。
5）运输要求，液氮或干冰保存寄送。
本公司可以提供全套技术服务，您只需提供组织或细胞标本，我们为您完成RNA抽提，cDNA制备，实时定量PCR，标准曲线制备及数据分析的所有步骤。
皓歌云平台会员，可以提供免费引物设计
具体价格请咨询QQ：
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qPCR常见问题及分析解决方法
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做过PCR的童鞋们都知道要想完全hold该实验、成为真正的PCR达人，并非易事。就qPCR而言，似乎其中的每一环节都可以让整个实验挂掉，也因此成为了资深科研狗们心中的痛。今天小编就整理了一些有关qPCR常见的问题及分析解决办法分享给大家。
那什么是qPCR呢？
qPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称qPCR。
简单来说，qPCR就是利用荧光信号的变化实时监测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。而常规的PCR是无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时监测。
qPCR的疑难杂问
Q1&如何提高RT-PCR反应的灵敏度与特异性？
1. 首先确定模板RNA完整性好，无DNA污染。
2. RNA模板中不应含有扩增反应抑制剂。
3. 为了防止模板降解，在反应体系中加入RNase抑制剂RNasin。
4. 使用适量的模板RNA，模板量太多会降低特异性，太少会导致扩增不出条带或条带太弱。
5. 若模板中有二级结构，可通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果。
6. 设计引物时，避免在引物3&端含有互补序列，避免形成内部发卡结构。
Q2&避免RNA降解的方法有哪些？
1. 在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA。
2. 使用良好无污染技术分离RNA。
3. 将组织从动物体取出后立刻提取RNA，并将提取好的RNA反转录为cDNA进行低温保存。
Q3&RNA中含有逆转录抑制剂时，怎么处理？
逆转录抑制剂包括：SDS、EDTA、甘油、焦磷酸钠、亚精胺和胍盐，可将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产量以检测RNA抑制剂；若对照RNA与样品混合后产量降低，则说明样品中存在逆转录抑制剂，可用70%（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗，以除去抑制剂。
Q4&如何减少RNA模板中的二级结构？
1. 将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性、退火；提高逆转录反应温度。
2. 温度超过60℃时，不能使用oligo（dT）引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP。
3. RT-PCR产物的长度超过1kb时，反应温度需保持在65℃。
Q5&RNA中有DNA污染的处理方式
1. 若是基因组DNA的污染，可使用DNaseI处理RNA； 同时设置没有逆转录的对照组反应检测DNA污染。
2. 若是受到外源DNA的污染，可使用抗气雾剂和UDG酶。
Q6&qPCR探针设计的一般原则有哪些？
1. 扩增片段的长度不应太大，一般小于300bp。
2. 探针不能和任一引物互补，且其长度在保证特异性的前提下尽可能的短，长度不要超过30bp。
3. 探针的Tm值至少比引物的Tm值高5度。
4. 探针如用于检测多态位点，多态位点应尽可能靠近探针中部。
5. 探针5&端不能是碱基G，G对荧光基团有猝灭作用。
Q7无反转录酶情况下，对照RNA仍有扩增结果
1. 体外转录时不可能将所有DNA模板消除，因而对照组会含有痕量的DNA。建议可将第一链cDNA稀释1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染造成的影响。
2. 可能是引物二聚体的条带。
Q8&扩增产物滞留在加样孔中
1. 可能是由于模板量过高而导致PCR结果产生了高分子量的DNA胶状物。建议将第一链cDNA浓度稀释至100倍再进行二次扩增。
2. 在二次PCR时，使用的退火温度如果比引物的Tm值低5℃，可将退火温度适当增高或进行热启动以提高特异性。
Q9&无Ct信号出现
1. 反应循环参数不够，一般要在35个循环以上，但是过多的循环次数可增加背景值。
2. 检测荧光信号的步骤有误。SYBRgreen法（SG法）采用的是72℃延伸时采集荧光信号，taqman法则是在退火结束或延伸结束时进行信号采集。
3. 引物或探针降解，可用PAGE电泳检测其完整性，若是电泳条带呈弥散状，可考虑重新合成引物或探针。
4. 模板不足或降解，则可以重新提取核酸模板。
Q10&Ct值出现过晚（Ct&38）
1. 扩增效率低，反应条件不够优化，降低退火温度，增加镁离子浓度。
2. 反应成分降解或加样量不足。
3. PCR产物过长，一般采用80-150bp。
Q11&标准曲线线性关系不佳
1. 加样存在误差，是样品浓度不成梯度。
2. 标准品出现降解，避免反复冻融。
3. 引物或者探针设计不佳。
4. 模板中存在抑制物或模板浓度过高。
Q12&溶解曲线存在多个主峰
1. 引物设计不够优化。
2. 引物浓度不佳，上下游引物浓度比例不一致。
3. 镁离子浓度过高。
4. 模板基因组的污染。
Q13&同一样品中，其中某一个荧光信号特别强
1. 试剂配制时反应液没有完全溶化，导致探针量在一管增多。
2. 试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同。
3. PCR仪热槽被荧光物质污染，需要清除热槽中的污染。
Q14&扩增曲线有一向上或向下的尖峰？
1. 反应过程中电压不稳定。
2. 可能在20个循环左右时，仪器有停下或仪器有开盖，使光线突然增强。
3. 如果尖峰向下，可能是由卤素灯老化所致，这时应更换。
Q15&部分样本扩增效率过低？
1. 提取液残留，一定程度抑制了PCR反应。
2. 反应液未严格取量混匀或分装不均匀。
3. 试剂失效。
Q16&阴性对照或空白对照翘尾
1. 模板提取环境或操作过程有污染。
2. 配液过程存在污染。
Q17&直线型扩增曲线
1. 探针部分降解：一般稀释的探针可在4&C保存至少3个月，探针的反复冻融或导致降解；或者探针在光线下暴露时间太长了。
2. 反应液中有PCR抑制物。
Q18&没有扩增曲线
1. PCR参数设置错误，在设计循环参数时将荧光信号读取时间设在反应的第一步，即stage1阶段。
2. 电脑设定了自动休眠。
Q19&基线下滑
基线选取范围不对，可试着将基线范围改大一些，这一问题常因试剂质量所致。
Q20&扩增曲线断裂
基线选取范围不对，基线终点大于Ct值，这通常是由于模板DNA浓度过高所致，因Ct值&15，而基线范围仍取3-15，其中包含部分扩增信号，导致标准差偏大，阈值过高，解决办法：减少基线终点至Ct前4个循环，重新分析数据。
Q21&样品浓度跨度过大
样品浓度过高，导致阳性样品扩增曲线在后面循环中呈一向下的直线，其解决方法同&扩增曲线断裂&。
Q22&山坡形曲线
常因反应管封口不严，至反应液蒸发所致。
注：文章资料来源于分析测试百科网、病理柳叶刀小木虫 --- 600万学术达人喜爱的学术科研平台
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&&rt-qPCR(one step)标曲问题
rt-qPCR(one step)标曲问题
大家好，还是rt-qpcr的问题，之前来发过一次贴，详见http://emuch.net/bbs/viewthread.php?tid=5474355。但是到现在还没解决，处于极度不知道怎么办的状态。还请各位高手指点一二。问题如下：
标曲RNA样品(最高total RNA浓度约为90ng/uL，10倍数量级稀释5个梯度)，之前一切正常（同样的方法同一批标样至少使用了一年以上），前段时间突然开始最低那个浓度梯度不能扩增，后来迅速发展为倒数第二个也不能扩增，标曲只剩下了3个点，现在第三个浓度低度开始扩增的循环数也推后了……以为是RNA降解了，于是重新制作了标样，可最低两个浓度还是不能正确有效扩增。
于是又考虑probe，primer，RNase free water污染等原因，全部使用了新的，结果还是一样。然后又用了新kit，全部使用了带滤膜的枪头，可还是一样。
后来又考虑到是不是这一批kit的酶有问题，但是奇怪的是同一个标样，同样的稀释方法，其他的功能基因片段可以正确扩增。而一直不能扩增的是当做参考基因β-actin啊~~~~
另外，还想询问下是不是被Rnase污染的可能？目前最高两个浓度开始扩增和达到plateau的循环数同没出现问题一样，污染了话，可能出现这样的情况吗？
还请明白人指点一下那里可能出了问题。
kit: platimum quantitative rt-pcr thermoscript one-step system (invitrogen)
现在是18.87、21.94、27.17；之前标曲各稀释浓度梯度都能出来的时候是17.5、20.44、23.91、28.28、31.62，
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&&关于qPCR RNA水平Ct值校正问题？
关于qPCR RNA水平Ct值校正问题？
看到一个文章上说数据用Ct值进行表示，RNA用Ct值进行比较，用内参GAPDH的进行校正，请问是如何进行校正的呢？谢谢~
The RNA levels were normalized to GAPDH RNA levels and are shown as meanCT values  ± standard deviations.
QQ截图39.jpg
谢谢您的解答，那处理数据时应该怎么处理呢？比如：实验中获得模型组目的基因Ct：21和内参:Ct：16；而药物处理组的目的基因Ct：23和它的内参是15；数据处理时怎样用内参标准它们而进行比较呢，
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