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巴西医生用罗非鱼的鱼皮治疗烫伤部位，据说什么药都不用涂
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海豚链球菌(Streptococcus+iniae)全细胞灭活疫苗的研究
中山大学 硕士学位论文 海豚链球菌（Streptococcus iniae）全细胞灭活疫苗的研究 姓名：刘瑞明 申请学位级别：硕士 专业：水生生物学 指导教师：李安兴
海豚链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ）全细胞灭活疫苗 的研究专业名称：水生生物学学位申请人：刘瑞明 导师姓名： 李安兴摘要海豚链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ）是链球菌属中一种重要的人畜共患病致病 菌。研究表明Ｓ．ｉｎｉａｅ是导致鱼类链球菌病的主要致病原，可以感染多种海、淡 水养殖鱼类，对水产养殖业造成了巨大损失。本研究以２００３年从广东省惠东 县分离到的四株Ｓ．ｉｎｉａｅ（ＨＤ．１，ＨＤ．２，ＨＤ．３，ＨＤ＿４）为材料，初步研究 了Ｓ．ｉｎｉａｅ的致病性，筛选出一株免疫效果较好的菌株作为疫苗株，并对 该疫苗株与四种不同佐剂制备的全细胞灭活疫苗的免疫效果进行比较和评价。关于Ｓ．ｉｎｉａｅ致病性方面，我们选取ＨＩ）．１株为代表，利用Ｒｅｅｄ―Ｍｕｅｎｃｈ法计算腹腔注射条件下ＨＤ．１株的半数致死量（ＬＤｊ。）为５．３×１０％Ｉｕ／ 尾。对人工感染条件下罗非鱼的发病情况进行监测，结果发现腹腔注射 感染的罗非鱼同ｔＪ然条件下发病鱼的临床症状一致，病鱼表现出体色 发黑，体表出血，游动姿势异常等一系列鱼类链球菌病的典型症状。 对病鱼进行剖检，结果发现病鱼的脑、肾脏出血；肝脏、脾脏肿大，褪色； 胃肠有积水；胆囊肿大，结合病理组织切片的结果，可以确定ｓ ｉｎｉａｅ是我国养 殖鱼类链球菌病的首要病原。 将四株＆ｉｎｉａｅ（ＨＤ一１，ＨＤ．２，ｌｉＤ．３，ＨＤ．４）的培养液灭活后，同佛 氏佐剂混合，制备四种佛氏全细胞灭活疫苗。然后通过腹腔注射免疫罗非鱼（２×１０８ｃＭ尾），经过两次免疫，初次免疫后３５天，分别用对应的菌株攻毒，统计１４天内各组鱼的死亡情况，计算各免疫组的保护率（ＲＰＳ）， 并监测血清抗体效价的变化。结果表明使用ＨＤ．１株制各的佛氏全细胞 灭活疫苗保护率达到９１．２％，最高血清抗体凝集效价达到ｌ：１６，免疫 效果较好，可作为疫苗株的候选。 将选取的疫苗株（ＨＤ．１）培养液经灭活处理后，同四种不同的佐剂 （佛氏佐剂，铝胶佐剂，蜂胶佐剂，白油佐剂）混合，制成四种全细 胞灭活疫苗。通过腹腔注射接种罗非鱼（１×１０％ｆｕ／，尾），初次免疫后２１ 天，用ＨＤ．１株攻毒，统计１４天内各组鱼的死亡情况，计算各免疫组的保护 率，并监测血清抗体效价的变化。结果表明用佛氏佐剂和白油制备的全细 胞灭活疫苗具有较好的免疫保护效果，可作为商品化Ｓ．ｉｎｉａｅ疫苗的候选。关键词：海豚链球菌，致病性，全细胞灭活疫苗玎Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌ ｋｉｌｌｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔＡｕｔｈｏｒ：Ｌｉｕ Ｒｕｉ?ｍｉｎｇ Ｓｕｐｖｅｒｖｉｓｏｒ：“Ａｎ－ｘｉｎｇＭａｊｏｒ：ＨｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｙＡｂｓｔｒａｃｔＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ，ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，ｉｓａｗｏｒｌｄｗｉｄｅ ｚｏｏｎｏｔｉｃａｎｄ ｆｒｅｓｈ ｗａｔｅｒ ｓｐｅｃｉｅｓ ｐａｔｈｏｇｅｎ．Ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｖａｒｉｏｕｓ ｍａｒｉｎｅ ｆｉｓｈ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎ ｅｎｏｒｍｏｕｓ ｌｏｓｓ ｉｎ ａｑｕｉｃｕｌｔｕｒｅ．Ｆｏｕｒ ｓｔｒａｉｎｓ（Ｈｉ）一１，ｌｉｄ一２，ＨＤ一３，ＨＤ一钔ｏｆ Ｓ．ｉｎｉａｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｕｉｄｏｎｇ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ｐｒｏｖｉｎｃｅ，ｉｎ ２００３ ｗｅｒｅｕｓｅｄ ｔｏｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｓ．ｉｎｉａｅ ａｎｄ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌ ｋｉｌｌｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔＳ／ｎｉａｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｆｉｓｈ．ＨＤ－１ ｗａｓ ｃｈｏｓｅｎａｓ ａｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｆｏｒ ｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｇｏｎｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆＳ．ｉｎｉａｅ． ｗａｓ ５．３ｘＴｈｅｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＬＤｓ０ ｏｆ ｔｈｉｓ ｓｔｒａｉｎ ｂｙｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａ｜ｉｎｊｅｅｔｉｏｎ１０６ｃｆｕ／ｆｉｓｈ．Ｔｈｅ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄｈｅｍｏｒｒｈａｇｅｓｏｎｆｉｓｈ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ｔｈｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｓ：ｄａｒｋｅｎｉｎｇ ｓｋｉｎ，ｃａｓｅｔｈｅ ｂｏｄｙ ａｎｄ ｅｒｒａｔｉｃ ｓｗｉｍｍｉｎｇ ｅｔｃ．ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｔｈｅｉｎ ｎａｔｕｒａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ａｕｔｏｐｓｙ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅｓ ｉｎ ｂｒａｉｎ，ｋｉｄｎｅｙ，ｓｐｌｅｅｎａｎｄｌｉｖｅｒ；ｉｎｔｕｍｅｓｃｅ ｏｆ 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ｍｉｃｒｏｌ ｉｔｅｒ Ｖｏｇｅｓ―Ｐｒｏｓｋａｕｅｒ ｒｅａｃｔｉｏｎＳ Ｊｎｉａｅ ＴＳＢ ｕ１ Ｖ．ＰＶ中山大学硕Ｉ：学位论立海豚链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ）全细胞灭活疫苗的研究前言鱼类链球菌病是分布范围极广的鱼类细菌病，在各大洲的主要经济鱼类养殖 国家均有发生，在温带和热带、亚热带地区尤其严重。鱼类链球菌病可在短时间 内（３―７天）导致很高的致死率（＞５０％＞，并且在海水淡水鱼中均有发病的报 道，能够对水产养殖业造成巨大损失。 海豚链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ）属于革兰氏阳性菌（Ｇ＋），通常呈圆形或卵 圆形，单个或成对、链状排列，有荚膜，不产气，兼性厌氧，无运动性，过氧化 氢酶呈阴性，在绵羊血琼脂板上呈Ｂ型溶Ｓｔｔ５１。该菌不能用传统的兰氏链球菌 血清型分群；其感染致死的病理过程主要是脑膜炎和败血症。海豚链球菌是一种 人畜共患病原，１９９５―１９９６年，在加拿大多伦多地区首次发现该菌引起人感染的 病例，后在美国，香港也出现人被感染的病例【２１】。 关于海豚链球菌的防治，根据国外报道，抗生素在实际应用中往往不够及时 ｍｌ，急需研究出一种能控制该细菌病的疫苗。国外从上世纪九十年代中期便开 始进行鱼类链球菌疫苗的研究：以色列在１９９５．１９９７年问研制的ｓ ｉｎｉａｅ灭活疫 苗使虹鳟的链球菌病死亡率从５０％下降到５％，但１９９７年又爆发了新一轮链球 菌病，后经证实是由于长期使用疫苗对该菌产生了自然选择压力，进而导致一种 具有新的血清型的ｓ ｉｎｉａｅ出现【矧。美国从１９９９年也开始着手研制抗ｓ ｉｎｉａｅ灭 活疫苗，并在对罗非鱼免疫保护实验中，产生较好的保护效果【３９】。国内在鱼类 链球菌免疫防治方面的研究还是空白。 国内对Ｓ．ｉｎｉａｅ这种非常重要的人畜共患病原的研究还不够，与作为世界最 大的水产养殖国家的地位和生产实际需要极不相称，因此亟需对养殖鱼类链球菌 病进行深入的研究及相应疫苗的开发。 本研究目的通过对海豚链球菌的半数致死量（ＬＤ５０），人工感染症状，组织病理变化，病原菌入侵鱼体后在组织中分布的研究来初步揭示冥致病性：从四株分离到的Ｓ ｉｎｉａｅ中初步筛选出一株免疫效果好的致病株，作为疫苗株，并对该 疫苗株与四种不同佐剂制各的全细胞灭活疫苗的免疫效果进行比较和评价。第一章文献综述近年来由于环境的污染和生产方式的不断变更，特别是集约化，工业化养殖 的开展，水生动物养殖疾病越来越趋上升态势，其中细菌性疾病种类多、发病率 和死亡率高，给水产养殖业造成重大的经济损失。鱼类链球菌病是由链球菌属的 细菌所引起的鱼类传染病的总称。自１９５７年鱼类链球菌首次报道发现于养殖的日 本虹鳟体内以来，已在各大洲很多鱼类养殖国家中出现，而链球菌能危害几乎所有海、淡水养殖鱼类【“。据ｃｒａｉｇ在１９９７的估计【２１，全球每年鱼类链球菌病造成的经济损失己超过１．５亿美元，对鱼类养殖业危害极大。ｌ、链球菌属的概述链球菌属于链球菌科（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）链球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ），是一 大类革兰氏阳性球菌，呈单个、成对或呈链状排布，在自然界中分布广泛，可从尘埃、土壤和水中分离到，也可从动物及人的粪便、鼻咽粘膜以及泌尿生殖道检出。有的是无害共生菌，有的是人、畜及其他动物致病菌。 链球菌属是细菌中具有悠久历史的属，伯杰氏系统细菌学手册（１９８６）将第 十二部分中的革兰氏阳性球菌中的链球菌科取消，链球菌属成为该部分中一个位 置不定的属【３】１４】。链球菌的分类方法比较复杂，常用的有三套分类系统。第一套 分类系统是种名系统，是根据链球萄属内各自的种名进行分类，如化脓链球菌、 猪链球菌、马链球菌等，伯杰氏鉴定细菌学手册第９版（１９９４）将链球菌分为四 个部分，即化脓链球菌（Ｐｙｏｇｅｎｉｃ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ），口腔链球菌（Ｏｒａｌｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）， 厌氧链球菌（Ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ），其他链球菌（Ｏｔｈｅｒ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ），共包 括３８个种【３１。种名系统是一套最正式的分类系统，也是最常见的分类系统。第 二套分类系统是兰氏（Ｉ．ａｎｃｅｆｉｅｌｄ）分群系统，根据细胞壁中的多糖半抗原（亦 称Ｃ抗原）的差异，把链球菌分为２０个血清群（Ａ，ｖ群，其中缺Ｉ、Ｊ）。同～ 群之中，依据表面抗原不同，可分为若干个血清型。第三套分类系统是溶血分类 系统，根据其在血琼脂平板上生长时的溶血型，可分为三类：ａ溶血（甲型溶血）， 此类链球菌致病力微弱；９溶血（乙型溶血），此类链球菌致病力较强；Ｙ溶血２生坐；苎兰堕主堂垡堡塞查壁壁登堕！逝！！！！兰竺竺竺！！生塑丝丕适壅堕竺堕！！（丙型溶血），此类链球菌无致病力悸Ｊ。 链球菌属包含了很多种能引起严重疾病的细菌种类，其宿主包括鸡、猪、牛、 蛙、海豚、鱼、人等多种生物，危害很大。自１９５７年鱼类链球菌病首次被报道 以来１１１，已经有很多种海、淡水养殖鱼都被报道能感染此病，其中对罗非鱼、鲈 和鲷危害尤为严重，此外，该菌也能从一些观赏鱼类中分离到【“。 鱼类链球菌病暴发时可在短时间内（３～７天）导致很高的致死率（＞５０％） ｏ”，且发病区域广，鱼类宿主广泛，能够对水产养殖业造成巨大损失。链球菌属中能导致鱼类疾病的种类主要包括：Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ（无乳链球菌），＆ｍｉｌｌｅｒｉ（米勒链球菌），Ｓ．ｉｎｉａｅ（海豚链球菌），＆ｐａｒａｕｂｅｒ缸（副乳房链球菌），ｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｉｓｌｓｌ， 但在决大多数链球菌病例中经研究确定的病原为＆咖缸ｅ【９１。２、海豚链球菌海豚链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ）属于链球菌科（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）链球 菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ），最初是１９７６年从美国旧金山市某水族馆一头亚马逊淡水 豚皮下脓肿分离出来并定种的【１０ｌ。海豚链球菌属于革兰氏阳性菌（Ｇ＋），通常呈圆 形或卵圆形，单个或成对、链状排列，有荚膜，不产气，兼性厌氧，无运动性， 过氧化氢酶呈阴性，在绵羊血琼脂板上呈Ｂ型溶血【５】。 在脑心浸出液（ＢＨＩ）液体培养基中，Ｓ．ｉｎｉａｅ可以在１０、２５、３５及４５℃， ＰＨ５．５～８．５，盐度低于３０ｐｐｔ的条件下存活。在５＇Ｃ蒸馏水中，Ｓ．ｉｎｉａｅ可以存活５ 天；在５＂Ｃ盐水（ｏ．８５％）中，该菌可以存活９天，２５＂Ｃ时可以存活２天，３５＊（２时可以 存活不超过２４ｈ［ＨＩ。３、海豚链球菌的流行病学 ３．１宿主流行病学研究结果表明，Ｓ．ｉｎｉａｅ可以感染全世界范围内多种海、淡水养殖鱼 类，其中包括几种最为重要的经济鱼类：虹鳟（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓｍｙｋｉｓｓ，Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓｋｉｓｕｔｃｈ），罗非鱼（０忆Ｄ曲，口ｍ如ｓｐ．），河豚（Ｓｉｇａｎｕｓ ｃａｎａｌｉｃｕｌａｔｕｓ），中山大学硕士学位论文海豚链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｉａｅ）全细胞灭活疫苗的研究海鲈（Ｓｐａｒｕｓ ａｕｒａｔａ，Ｄｉｃｅｎｔｒａｒｃｈｕｓ ｌａｂｒａｘ），红鼓鱼（Ｓｃｉａｅｎｏｐｓ ｏｃｅｌｌａｔｕｓ），条纹鲈明．ｏ，溯Ｂ曲，）巧凹，ｘ＾ｆＤ，硼￡５删矗如），澳洲肺鱼（Ｌａｔｅｓ ｃａｌｃａｒｉｆｅｒ）等【１２】，严重影响水产养殖业的发展。此外也有很多野生鱼类被Ｓ伽妇Ｐ感染的报道１１３１，而这些 野生鱼类被怀疑是Ｓ．ｉｎｉａｅ传播的重要媒介之一。３．２感染途径海豚链球菌的自然感染途径主要包括：吞食被链球菌污染的饲料，与濒死的 病鱼共栖，摄食濒死或已死亡的病鱼，体表伤处与被Ｓ．ｉｎｉａｅ污染的环境接触， 此外国外还有报道称该菌可能会经由鼻孔、眼睛或鳃感染鱼体【１２】【１４】［１５１。３．３临床表现被此菌感染后，病鱼的临床表现可分为急性和亚急性两大类ｆ１６】。亚急性类 表现为典型的链球菌病的症状：单侧或双侧眼球突出，体色发黑，缺乏活力，游 动缓慢；眼球充血，角膜浑浊，肛门红肿；鳃盖下缘、胸鳍基部、体表的其它部 位有出血现象；死前出现间断性狂游、翻滚或转圈。解剖病鱼，结果发现其脑部 充血，有出血点；肝脏淤血，出血，有的有坏死灶；脾脏肿大，呈暗红色；胆囊 肿大；肠腔积水【１４ｌ。急性类感染的病鱼往往在一夜间暴毙，临床症状很少，仅 在少数病例中病鱼会出现角膜浑浊，因而一些与其共栖鱼类的突然死亡成为发病 的唯一预警信号【１６】。３．４死亡率关于海豚链球菌发病率和死亡率，国内外报道的差异很大。国外Ａｎａ等 （２００４）【１７１报道，Ｓ．ｉｎｉａｅ感染后死亡率可达３０。５０％。Ｊｅｆｆｒｅｙ等（２００１）１１８】观察 到在渔场中，感染Ｓ．ｉｎｉａｅ而导致的死亡率高达５０％。国内柴家前等（２００２）１１９１ 发现罗非鱼类链球菌病的发病率为２０％。３０％，而致死率高达９５％以上。４中山大学硕士学位论且＝海豚链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｉａｅ）全细胞灭活疫苗的研究３．５对人的感染１９９５．１９９６年，在加拿大多伦多地区首次发现该菌对人感染的病例，后在美 国，香港也先后出现该菌引起人感染的病例１２０】。目前已知的传染途径是人类处 理鱼时（多为罗非鱼），经由伤口造成Ｓ．ｉｎｉａｅ侵入感染。 患病人都是年龄较大的亚洲人，临床症状主要是蜂窝织炎，临床使用Ｐｅｎｃｉｌｌｉｎ的治疗效果良好１２¨。 能引起人类感染＆跏缸ｅ呈现Ａ或Ａ，ＰＦＧＥ图谱的两种致病株，而非致病株的 ＰＦＧＥ图谱与上述两种不同。作为一种重要的入畜共患病原，该菌引起了高度的 重视和广泛的关注。４、致病机制目前，有关Ｓ．ｉｎｉａｅ致病机制的研究主要包括动物感染模型的建立【２２】【２３】，个 别毒力因子的研究【２４１，感染后Ｓ．ｉｎｉａｅ在各组织的分布情况【１４１［１５ｌ等，但Ｓ．ｉ．／ａｅ入 侵鱼体的具体机制尚无定论。而致病株与非致病株ＰＦＧＥ图谱的不同，预示着由 一个或几个特异性基因编码的毒力因子是Ｓ．ｉｎｉａｅ致病性有无的决定因素。致病 株对宿主细胞（组织）的破坏主要包括以下几个方面：Ｓ．ｉｎｉａｅ对上皮细胞有直接 的细胞毒作用，可以破坏上皮细胞层，进入血管，并向其他组织扩散，而且能进 一步突破血脑屏障，导致脑膜炎，使病鱼出现狂游等神经症状：致病株还可以黏 附并入侵上皮、内皮细胞，并在被其侵入的细胞中存活一段时间，从而躲避宿主 免疫系统的清除作用，或者突破细胞间屏障向其他组织扩散。尽管目前尚未从 Ｓ伽抽Ｐ致病株中发现传统链球菌群中含有的可以抵制吞噬作用的Ｍ蛋白，但在 Ｘｉｎｉａｅ中可能存在一种未知的表面蛋白或者蛋白因子，为其提供了抵抗巨噬细胞 清除的能力１１射。有的毒株甚至能够侵入巨噬细胞并在其内繁殖，引起巨噬细胞 凋亡１２０ｌ。鱼类链球菌感染造成死亡的病理过程主要是脑膜炎和败血症。５、海豚链球菌的诊断 ５．１生化鉴定中山大学硕｝学位论文海豚链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｉａｅ）全细胞灭活疫苗的研究目前国际上已分离到多株Ｓ．ｉｎｉａｅ，不同的地理株系在生化特性上存在差异， 例如存在ａ和Ｂ两种溶血类型Ｉ吲，不同株发酵乳糖、水杨苷的能力不同【１９】，另 外精氨酸双水解酶（ＡＤＨ）活性也不同，进而可将Ｓ．ｉｎｉａｅ分为ＡＤＨ＋，ＡＤＨ一， ＡＤＨ“一三类，但也有人认为这可能是人为试验误差造成的假象１２６ｌ。可用于鉴 定海豚链球菌的主要生化生理特征包括：无法利用兰氏分群系统分群；不能在 ６．５％的ＮａＣｌ中生长；不能在胆汁七叶营培养基中生长；精氨酸双水解酶、七叶 苷水解反应呈阳性，ＣＡＭＰ试验呈阳性，脲酶、马尿酸、Ｖ－Ｐ反应呈阴性：能够 发酵葡萄糖，水杨苷，淀粉，蔗糖：不发酵树胶醛糖，菊粉，乳糖，棉子糖，蜜 三糖，山梨糖醇【２７Ｊ。５．２血清学鉴定血清学鉴定以区别荚膜多糖抗原及细胞表面蛋白质抗原的差异为基础，有研 究表明，英膜多糖抗原的血清型似乎与ＡＤＨ试验结果相关【２引。２００１年，在以色 列分离到一株新血清型的＆ｉｎｉａｅ，后经证实是由于长期使用疫苗产生的自然选 择压力导致了这种新血清型的＆ｉｎｉａｅ的出现。Ｇｉｈｄ（２００１）【２９】等将１９９７年以 前分离到的＆ｉｎｉａｅ定为血清型Ｉ型，将此后分离的新血清型的盅ｉｎｉａｅ定为血清 型ＩＩ型。Ｉ型和ＩＩ型Ｓ ｉｎｉａｅ主要差别是精氨酸双水解酶水解反应结果不同，Ｉ 型呈阳性，而ＩＩ型呈阴性。对Ｉ型和ＩＩ型Ｒ ｉｎｉａｅ的１６ＳｒＤＮＡ进行ＲＡＰＤ分析， 结果发现Ｉ型存在一条７５０ｂｐ的条带，而Ｉｌ型中不存在。利用Ｉ型和ＩＩ型＆ｉｎｉａｅ 免疫鱼体制备的抗血清，分别与Ｉ型和ｌＩ型＆ｉｎｉａｅ抗原反应，结果Ｉ型抗血清 只能同ｌ型＆ｉｎｉａｅ反应，而ＩＩ型抗血清既可以同Ｉ型＆ｉｎｉａｅ反应又可以同ＩＩ型ｓ ｉｎｉａｅ反应。目前由于血清学鉴定提供的信息较少，因而在Ｓ ｉｎｉａｅ的诊断中使用较少。５．３分子鉴定分子鉴定主要采用的方法有：ＤＮＡ的限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ），ＤＮＡ 随机扩增多态性分析（ＲＡＰＤ），脉冲场凝胶电泳（Ｐｕｌｓｅｄ Ｆｉｅｌｄ ＧｅＩ６中山大学硕上学位论文海豚链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｉａｅ）争细胞灭活疫苗的研究Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＰＦＧＥ）等。 ＲＦＬＰ是早期进行分子鉴定的主要方法。该技术由Ｇｒｏｄｚｉｃｋｅｒ等于１９７４年 创立。ＲＦＬＰ标记技术的基本原理是特定生物类型的基因组ＤＮＡ经某一种限制 性内切酶完全酶解后，会产生分子量不同的同源等位片段（或称限制性等位片 段），再通过电泳的方法分离和检测这些片段。凡是可以引起酶解位点变异的突 变，如点突变（新产生和去除酶切位点）或一段ＤＮＡ的重新组织（如插入和缺 失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致限制性等位片段的变化，从而产 生ＲＦＬＰ［３０１。该技术包括以下基本步骤：ＤＮＡ提取；用ＤＮＡ限制性内切酶消化； 凝胶电泳分离限制性片段；将这些片段按原来的顺序和位置转移到易操作的滤膜 上；用放射性同位素或非放射性物质标记的ＤＮＡ作探针与膜上的ＤＮＡ杂交（称 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交）；放射性自显影或酶学检测显示出不同材料对该探针的限制性酶 切片段多态性。Ａｖｉ等（１９９７）１３１ｌ通过对１６ＳｒＤＮＡ的ＲＦＬＰ带型图谱分析发现，来 自美国和以色列的菌株的带型图谱不同，从而否定了该细菌病是从其中一个国家 传播到另一个国家的可能。黜廿Ｄ可用于海豚链球菌的鉴定，该技术是由Ｗｉｌｌｉａｍｓ等于１９９０年创立，其基本原理与ＰＣＲ技术一致，ＲＡＰＤ标记技术就是用一个（有时用两个）随机 引物（一般８．１０个碱基）非定点地扩增基因组ＤＮＡ，然后用凝胶电泳分开扩增 片段。遗传材料的基因组ＤＮＡ如果在特定引物结合区域发生ＤＮＡ片段插入、 缺失或碱基突变，就有可能导致引物结合位点的分布发生相应的变化，导致ＰＣＲ 产物增加、缺少或发生分子量变化。若ＰＣＲ产物增加或缺少，则产生ＲＡＰＤ标 记１３２】。Ｃｏｌｏｍｉ等（２００２）１３３】沿用可区分Ａ群链球菌菌株的引物，对生化反应结果 不同（ＡＤＨ＋，ＡＤＨ一）的两组Ｓ．ｉｎｉａｅ进行ＲＡＰＤ分析，结果发现ＡＤＨ＋组和ＡＤＨ 一组的ＲＡＰＤ谱型不同。 ＰＦＧＥ也应用于Ｓ，ｉｎｉａｅ的鉴定，其原理为：大于２０ｋｂ ＤＮＡ片段可通过电场 变化即脉冲电泳得以有效分离。在电场的作用下ＤＮＡ可进入较小的琼脂糖凝胶 孔中，大的分子只能进入大的胶孔，但需要较长的时间方能找到可进入的胶孔， 所以泳动轨迹弯曲，速度缓慢。大于３０ｋｂ和ＤＮＡ分子在电泳中只能头尾牵引 进入胶孔，需定期改变电场方向使大分子通过凝胶孔。每改变～次大的伸展的 ＤＮＡ分子重新定向，在新的方向上通过凝胶。通过不断交替改变电场方向，选７中ｄｊ－＆学硕上学位论文海豚链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｉａｅ）全细胞灭活疫苗的研究择恰当的脉冲时间等条件，可将３５～１００００ｋｂ的ＤＮＡ分子在凝胶中予以分辨， 适用于细菌种问及种内株间的分型鉴定。Ｗｅｉｎｓｔｃｉｎ等（１９９７）［２１】对６６株海豚链 球菌进行ＰＦＧＥ分析，结果产生１９种不同的图谱。 另外，Ａｒｉａ等（２００４）［１７１提出针对Ｓ．ｉｎｉａｅ的乳酸氧化酶（１ｅｔ ０）基因设计引 物，再进行特异性扩增，从而实现快速疾病诊断。此类ＰＣＲ技术敏感度高，特 异性强，是一种应用前景广泛，而且可以用于大规模筛选的快速诊断方法。６、海豚链球菌的防治 ６．１药物治疗药敏试验结果表明，多种抗生素对Ｓ．ｉｎｉａｅ有效。目前，在国内报道的鱼类 链球菌病的防治工作中，仍以抗生素防治为主：王振龙等（１９９６）ｆ３４】提出使用青霉 素配合“鱼健宝”（山东工业大学研制，济宁兽药厂生产的纯中药制剂）治疗； 刘永进等（１９９５）［３５】提出投喂药饵（主要成分包括磷酸多脂，鱼肝油，红霉素，土 霉索）来治疗；林为民等（２０００）【３６ｌ提出利用氨苄青霉素喷洒全池，并用土霉素混 合饲料投喂。利用抗生素对鱼类链球菌病进行防治，既不能完全杀死病原菌又造 成了抗生素在鱼体内的残留，因此并不可取。实际上本实验室从广东省惠东县所 分离到的几株Ｓ．ｉｎｉａｅ抗性更为广泛，可能因为国内水产养殖中抗生素的大量使 用，导致＆加缸Ｐ对某些抗生素产生了抗药性。６．２免疫防治在现代水产养殖中，接种疫苗作为标准鱼类养殖计划的一个组成部分，是一种 相对崭新的技术手段。通过接种疫苗，既能有效的预防水产动物疾病，又能避免 应用药物防治时对水环境和水产品本身造成的药物污染， 因而得到了世界各国的重视。应用商品化鱼类疫苗的发展起始于本世纪７０年代，从那时起，数以亿计的鱼被接种疫苗，以抵御包括弧菌病（ｖｉｂｒｉｏｓｉｓ）、疖点病＠ｒｕｎｃｕｌｏｓｉｓ）、肠败血病（ｅｎｔｅｒｉｃｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）和肠红嘴病（ｅｎｔｅｒｉｃｒｅｄ－ｍｏｕｔｈｄｉｓｅａｓｅ）在内的各种细菌病ｐ７】。中山大学硕士学位论文海豚链球菌（ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕＧｉｎｉａｅ）全细胞灭活疫苗的研究但是，迄今为止，世界各国真币实现了商品化生产的鱼用疫苗十分有限（仅有６～ ７种），而很多能预防危害十分严重的鱼病的鱼用疫苗，尚处于研究开发阶段【３８Ｉ。 国外从上世纪九十年代中期便＿丌始进行鱼链球菌疫苗的研究：以色列在 １９９５―１９９７年间研制的＆ｉｎｉａｅ灭活疫苗使虹鳟的链球菌病死亡率从５０％下降到 ５％。但９７年又爆发了新一轮链球菌病，后经证实是由于使用疫苗产生的自然选 择压力导致一种新的血清型的ｓ ｉｎｉａｅ的出现【２９１。美国也于１９９９年开始着手研 制＆ｉｎｉａｅ灭活疫苗，并在罗非鱼免疫保护实验中，产生很好的保护效果：腹腔 注射接种疫苗，相对保护率高达９３．２％ｆ３９１。关于疫苗的给予方式，Ａｋｈｌａｇｈｉ等 （１９９６）‘删曾利用浸泡法对虹鳟实施免疫，结果没有产生保护效果。Ｐｈｉｌｌｉｐ等（２０００、㈣采用腹腔注射和肌肉注射两种不同的疫苗给予方式对罗非鱼实施免疫，在注射相同剂量的同种灭活疫苗的条件下，腹腔注射疫苗的保护效果要远好于肌肉注 射的保护效果。此外，Ｔｅｒｕｙｕｋｉ等（２００２）［４１】提出一种新的疫苗给予方式：先将鱼 浸泡于含有灭活疫苗的溶液中，然后使用一个含有多个针状末端的装置刺入鱼身 体两侧的皮肤，从而使灭活疫苗溶液通过皮肤的伤口进入体内，实验结果证实这 种方式的免疫效果与腹腔注射的免疫效果基本相同。Ｓｈｅｌｂｙ等（２００２）１４２】曾对罗非鱼腹腔注射抗Ｓ．ｉｎｉａｅ抗血清实施被动免疫，检测其对罗非鱼的免疫保护效果，结果表明被动免疫可以实现免疫保护，而且抗血清中的抗Ｓ．ｉｎｉａｅ抗体在抵 制Ｓ．ｉｎｉａｅ感染的免疫反应中起到非常重要的作用。国内有关鱼类链球菌病的免 疫防治的研究方面尚为空白。６．３饲养管理措施鱼病的发生是鱼自身因素（如免疫系统受抑制）和环境因素共同作用下的结 果。与鱼类链球菌病发生相关的因素包括水温高（例夏季），饲养密度过高，水 质差（例高氨、噩硝酸盐），捕获、处理鱼造成的损伤等，Ｃｒａｉｇ等（２０００）１４３’提出 饲养密度是影响感染Ｓ，ｉｎｉａｅ罗非鱼致死率的重要因素。因此，改善卫生管理措 施，预防链球菌病的发生要注意以下几点：合理调整养殖密度；尽量保持水质最 佳；预防药物尽量选择对鱼刺激较少的；尽可能避免鱼与传染原接触。９中山人学硕士学位论文海豚链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ）全细胞灭活疫苗的研究总的说来，国内对Ｓ．ｉｎｉａｅ这种非常重要的人畜共患病原的研究还不够，与 作为世界最大的水产养殖国家的地位和生产实际需要极不相称，因此亟需对养殖 鱼类链球菌病进行深入的研究和相应疫苗的开发。１０中山大学硕上学位论文海豚链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｌａｅ）拿细胞灭活疫苗的研究第二章材料与方法第一节材料１．实验动物实验用鱼全部采用尼罗罗非鱼（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓｎｉｌｏｔｉｃｕｓ），购自广东省省级罗 非鱼良种厂，致病性及最佳佐剂筛选实验中采用的实验鱼体重６５．５±１１．４９，体长 １２．４±１．３ｃｍ。疫苗株筛选实验中采用的实验鱼体重６０．３±７．５ ｇ，体长１２．２±１．２锄。实验前喂养于２４０Ｌ塑料水族箱，持续用气泵充气，上覆盖纱网，保证黑夜和白昼时间比１２ｈ：１２ｈ的稳定环境，水温和环境温度保持一致，但不会低于２０℃ （冬季），每周换水２次，一周后无异常表现的鱼用于正式实验。２．菌株海豚链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ）ＨＤ－１、ＨＤ．２、ＨＤ．３和ＨＤ．４株均采自广 东省惠东县盐洲镇海水网箱养殖鱼类。ＨＤ．１株采白花尾胡椒鲷（Ｐｌｅｃｔｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｃｉｎｃｍｓ），ＨＤ－２，ＨＤ－３株采自红鳍笛鲷（ＬｕＯａｎｕｓ ｅｒｙｔｈｏｐｔｅｒｕ５）。ＨＤ一４株采自青 石斑（Ｅｐｉｎｅｐｈｅｌｕｓａｗｏａｒａ）。ＨＤ一１，ＨＤ一２株由本实验室鉴定，ＨＤ．３、ＨＤ．４株由 Ｉｎｖｅｒｔ新加坡公司进行鉴定。 标准株Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅＡＴＣＣ２９１７８ｆｆｌ美国乔治亚大学兽医学院Ｐｒｏｆ．Ｈａｒｒｙ Ｗ．Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ（ＣｏＵｅｇｅｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆＧｅｏｒｇｉａ，ＵＳＡ）惠赠。３．培养基３．１ＢＨｌ固体培养基主些生兰堡！：兰竺堡茎塑壁壁壁塑！里翌竺竺竺兰塑！！全塑丝至垩壅堕堕堕茎―一脑心浸粉，葡萄ｐ／ｉｎｃｈＢＨＩ（购自广州环凯微生物试剂公司，主要成分月示胨，糖，氯化钠，磷酸氢二钠）３６９，琼脂粉１４９，ＮａＣｌｌｏｇ，蒸馏水１０００ｍｌ，１５ ２灭菌１５分钟。３．２ＢＨＩ液体培养基ＢＨｌ３６９，ＮａＣｌｌｏｇ，蒸馏水１０００ｍｌ，分装试管，每管５ｍｌ，１５ｐ／ｉｎｃｈ ２灭菌１５分钟。３．３ＴＳＢ固体培养基ＴＳＢ（购自广州环凯微生物试剂公司，主要成分胰蛋白胨，植物蛋白胨葡萄糖，氯化钠，磷酸氢二钾）１２．４９，琼脂粉１４９，ＮａＣｌｌｏｇ，蒸馏水１０００ｍｌ， １５ｐ／ｉｎｃｈ２灭菌１５分钟。３．４ＴＳＢ液体培养基ＴＳＢｌ２．４９，ＮａＣｉｌｏｇ，分装试管，每管装５ｍｌ，蒸馏水１０００ｍｌ， 菌１５分钟。１５ｐ／ｉｎｃｈ２灭４．佐剂 ４．１佛氏佐剂佛氏完全佐剂（ｃＥＡ），佛氏不完全佐剂（１ＦＡ）购自ＳＩＧＭＡ公司。４．２蜂胶佐剂蜂胶佐剂，由广东省农科院兽医研究所惠赠，制备方法：用市售蜂胶，放４ ℃以下低温保存， 用前在４～８℃下粉碎， 过筛， 按１：４（Ｗ／Ｖ）加９５％的中山人学硕士学位论文海豚链球菌（５ｌｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｉａｅ）全细胞灭活疫苗的研究乙醇，放室温浸泡２４～４８ｈ，冷却， 胶津液，津液４℃以下保存备用Ｈ４１。过滤或离心取上清，即得透明栗色纯挣蜂４－３铝胶佐剂铝胶佐剂，由华南农业大学兽医学院宋老师惠赠，制备方法：取氢氧化铝干 粉５０～５５ｋｇ，加入煮丌的６０Ｌ沸水中搅拌均匀，倒入硫酸ｌＯＯｋｇ，发生爆沸至 棕褐色，经３０～６０ｍｉｎ，继续加温水，随加随搅拌约至全量３５０Ｌ，浓度为２６～ ３１波美度。 用前加水释成１０００Ｌ约在９波美度， 温度８０℃， 盛放在一个缸 控制两液流内。另一缸８０ｋｇ烧碱加水至１０００ｋ加温７５＂Ｃ，１０波美度左右， 速达化合液为ＰＨ６．９±０．１至化合终了， 续熟化３ｍｉｎ， 水。蒸汽吹沸熟化ｌＯｍｉｎ，调ＰＨ６．９±０．１继稳定ＰＨ６．９＋０．１，静置沉淀吸去上清液后，加入约５倍量的软化搅拌洗涤、沉淀、去上清液，如此３～５次，检查至硫酸盐合格为止。最后经１００～１２０孔铜纱筛滤过，装入布袋脱水一夜，收存于容器内，约得６００ｋｇ铝 胶【州。４．４白油佐剂白油佐剂购自广东省生药厂。第二节方法１．细菌培养将一２０℃的菌种保存液按培养体积２％的比例接种于ＢＨＩ液体培养基中，置 于气浴恒温振荡器ＣＨＡ－Ｓ（郑州杜甫仪器厂）中，２４ｈ。２８。Ｃ，２００ｒｐｍ下振荡培养２．腹腔注射感染中山人学硕１ ７学位论文海朦链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｉａｅ）全鸯”胞灭活疫苗的研究将罗非鱼捞出，放在一个湿毛巾上，使用注射器沿腹鳍基部插入，进行腹腔 注射，注射完毕后，将鱼轻轻放回水中，正常饲养。３．动物回归实验按１所示方法培养ＨＤ．１，ＡＴＣＣ２９１７８。将所得的菌液用灭菌的ＰＢＳ缓冲液重悬至约１０８ｃｆＩｌ／ｍｌ（经梯度稀释计数确认），每株腹腔注射２０尾健康罗非鱼 （０．１ｍｌ／尾），另设以无菌ＰＢＳ注射（０．１ｍｌ／尾）作为阴性对照，连续观察１４天． 记录发病及死亡情况４．组织涂片与革兰氏染色从发病鱼的脑、肝、脾、肾组织采样作组织涂片，对涂片进行革兰氏染色。 革兰氏染色具体操作步骤： 涂片一固定一结晶紫染色一水洗一碘液媒染一水洗一９５％酒精脱色一水洗一番红染色一水洗一干燥一镜检。呈紫色为革兰氏阳性，呈红色为革兰氏阴性。５．半数致死量（ＬＤｓｅ）的测定按１所示方法培养ＨＤ．１，利用梯度稀释计数法测得菌液浓度为８．４×１０８ ｃｆｕ／ｍＩ，使用０．９％生理盐水将菌液梯度稀释，分成５个稀释度（８，４×１０８，８．４×１０ ７，８，４×１０６，８．４×１０５，８．４×１０４ｃｆｕｍｌ一１），每个稀释度腹腔注射罗非鱼６尾（０．１ｍｌ／尾），另设以注射无菌ＰＢＳ（Ｏ．１ｍｌ／尾）作为阴性对照。各组鱼分别放置 于不同塑料水族箱中，注射后每天至少观察两次，连续观察１４天，记录发病及 死亡情况，按Ｒｅｅｄ－－Ｍｕｅｎｃｈ法计算半数致死量【４５Ｊ。６．病理组织切片的制作１４中山大学硕士学位论文海豚链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｉａｅ）令细胞灭活疫苗的研究取实验中濒死鱼或明显发病鱼的脑、脾、肝、肾组织，固定于１０％中性福尔马林缓冲液中，经脱水透明、石蜡包埋、切片、脱水、苏木精伊红（脏）染色，制作成病理组织切片Ｈ６１。在ＢＸ４１．３２Ｈ０２型系统生物显微镜（日本奥林巴斯 公司）下观察病理组织的病理变化情况。７感染后ｓ．ｉｎｉａｅ在组织中的分布 ７．１细菌培养及腹腔注射感染按１所示方法培养ＨＤ．１，利用梯度稀释计数法测得菌液浓度为１．３×１０９ ｃｆＩｌ／ｍｌ。取５０尾鱼腹腔注射接种菌液０．１ｍｌ／尾，另取１５尾鱼注射ＰＢＳＯ．ＩｍⅣ尾作 为阴性对照。７．２不同时间下，Ｓ．ｉｎｉａｅ在脑组织分布情况腹腔注射感染后４，８，１２，２４，３６，４８ｈ时，随机选取感染罗非鱼３尾，先 用酒精棉球将鱼体表及解剖用刀具消毒，然后用灭菌的５ｕｌ接种环插入罗非鱼的 脑组织蘸取少量组织液，訇ｊ线接种于ＢＨＩ固体培养基，于２７℃～２８℃培养２４．－－４８ｈ 计数ｆ１４ｌ。７．３不同时间下，Ｓ．ｉｎｉａｅ在血液中的分布情况腹腔注射感染后４，８，１２，２４，３６，４８ｈ时，随机选取感染罗非鱼３尾，使 用无菌注射器从尾静脉处准确取静脉血０．１ｍｌ（注射器内先吸入微量肝素钠）， 静脉血中加入２倍量０．０２５％的ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００，混匀后用灭菌ＰＢＳ作１０倍等比稀 释后涂板，２８＂（２培养２４～４８ ｈ后计数菌落咖１。８．疫苗用菌株的筛选 ８．１菌液培养与计数按１所示方法培养ＨＤ．１，ＨＤ一２，ＨＤ．３，ＨＤ．４，利用梯度稀释计数法测得各自中山人学坝Ｊ：学位论文海豚链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ）争细胞灭活疫苗的研究菌液浓度。８．２纯粹检验将培养的四种菌液分别取样划线接种于ＢＨｌ固体培养基，ＴＳＢ固体培养基中， ２８＂Ｃ培养２４ｈ，应该均为纯粹的Ｓ．ｉｎｉａｅ生长。８．３菌液灭活培养的菌液经过纯检后，取无杂菌的培养液加入适量的福尔马林溶液（占终 浓度的３％），将溶液搅拌均匀，于２８＂Ｃ振荡灭活２４ｈ。８．４ＰＢＳ重悬将四种灭活菌液用ＳＩＧＭＡ－－３Ｋ１５离心机（德国ＳＩＧＭＡ公司）于４＂Ｃ， ９０００ｒｐｍ下，离心３０分钟，弃去上清液，用无菌ＰＢＳ清洗两遍， 体积，使四种菌液终浓度均达到４Ｘ １０９ｃｆｕ／ｍｌ。 然后调整菌液８．５佛氏全细胞灭活苗制备将四种灭活菌液分别与佛氏佐剂（初次免疫时使用佛氏完全佐剂，加强免疫 时使用佛氏不完全佐剂）等体积混合，制成佛氏全细胞灭活苗保存于４℃冰箱。 免疫前将疫苗用ＳＫ－－１快速混匀器（江苏金坛市宏华仪器厂）振荡１０分钟，使 之混匀成乳状。８．６疫苗无菌检验取制备好的四种佛氏全细胞灭活苗少量分别接种于ＢＨＩ固体培养基，ＢＨＩ液体培养基，ＴＳＢ固体培养基，ＴＳＢ液体培养基中，２８℃振荡培养７２ｈ，检测是中山大学硕｛：学位论文海豚链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｉａｅ）全细胞灭活疫苗的研究否有细菌生长。８．７安全性检验用制备的四种佛氏全细胞灭活苗各免疫两组罗非鱼，每组含２７尾鱼，每尾 鱼腹腔注射０．１ｍｌ，观察半个月。８．８分组与免疫程序将３５２尾罗非鱼随机分为１６个组，每组２２尾鱼。其中每种灭活菌液对应４ 个组（分别设编号为＃１，＃２，＃３，＃４），＃１，＃２是注射疫苗的免疫组． ＃３，＃４是注射ＰＢＳ的对照组。 初次免疫时，分别向免疫组腹腔注射对应的佛氏完全佐剂全细胞灭活苗 ０．１ｍｌ／尾（剂量均为２×１０９ｃｆｕ／，尾），同时向对照组接种ＰＢＳ（０．１ｍｌ／尾）。三个周 后进行加强免疫，向免疫组腹腔注射对应的佛氏不完全佐剂全细胞灭活苗（剂量 均为２×１０９ＣｆＵ／尾），同时给对照组接种ＰＢＳ（Ｏ．１ｍ１／尾）。８．９免疫保护效力实验加强免疫后１４天，用培养好的四种菌株培养液，分别向对应的免疫组，对照 组腹腔注射Ｏ．３ｍｌ／尾（注射ＨＤ．１、ＨＤ．２，ＨＤ＿４的菌液浓度为１０８ｃｆｉ／ｍ】；ＨＤ．３ 的菌液浓度为１ ｏ．‰／ｍ１），统计１４天内各组鱼的死亡情况。按下列公式计算相对 保护率（ＲＰＳ）： 相对保护率（％）＝（对照组死亡率～免疫组死亡率）／对照组死亡率×１００％１４７１８．１０采血及抗体效价的测定１７中山大学顾上学位论文海豚链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｉａｅ）拿细胞灭活疫苗的研蜜初次免疫后第一周、第三周及第五周各取血一次，每次从每组随机选取８ 尾鱼，尾静脉取血，收集的血液置于室温下１ｈ左右，凝固后，置４℃下，过夜 （切勿冰冻）析出血清，放入离心机中４０００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ。在无菌条件，吸出 血清，注入１．５ｍｌ离心管，贮于．４０℃以下冰箱，或冻干后贮存于４℃冰箱保存。 用微量凝集试验测定血清抗体的效价。在９６孔ｕ型微量血凝板上，将被试 血清用无菌ＰＢＳ做作２倍梯度稀释，每孔含稀释血清５０ｕｌ，然后向每孑Ｌ加入５０Ｉｌｌ 免疫反应抗原，将血凝板轻轻振荡，于３７＊（２下放置过夜。若血凝板Ｕ型底部出 现菌体沉积边缘模糊化则判定为阳性反应，若ｕ型底部出现轮廓清晰的圆形沉 积物则判定为阴性反应。呈明显阳性反应的最高稀释度为该血清的滴度或效价。 反应抗原采用福尔马林灭活的链球菌菌体（浓度１０８ ｃｆｕ／ｍ１）［４８】。９．最佳疫苗佐剂的选取 ９．１菌液培养与计数按１所示方法培养ＨＤ．１，利用梯度稀释计数法测得菌液浓度为２×１０９ｃｆｕ／ｍｌ。９．２纯粹检验将培养的ＨＤ．１菌液按８．２所示方法进行纯粹检验。９３菌液灭活 培养的菌液经过纯检后，按８．３所示方法进行菌液灭活。９．４全细胞灭活疫苗的制备将灭活菌液分装于５０ｍｌ无菌离心管，用ＳＩＧＭＡ－－３Ｋ３０离心机（德国ＳＩＧＭＡ 公司）于４＂Ｃ，９０００ｔｐｍ下，离心３０分钟，弃去上清液，用无菌ＰＢＳ清洗两遍， 调回原来体积，制成全细胞灭活疫苗。９．５佛氏全细胞灭活苗制备方法同８．５９．６白油全细胞灭活苗制各向全细胞灭活疫苗中加入４％Ｔｗｅｅｎ－－８０，然后将其同白油佐剂按１：２的比 例混合，制备成白油全细胞灭活苗。免疫前，将疫苗用快速混匀器振荡１０分钟， 使之混匀成乳状。９．７铝胶全细胞灭活苗制备将灭活全细胞疫苗同铝胶佐剂按４：１比例混合，使用快速混匀器振荡１０ 分钟，振荡搅拌均匀后，放于Ｚ］１．２５０Ａ生化培养箱（北京中西器材公司）中 １０＂Ｃ静置沉积２～３天，制备成铝胶全细胞灭活苗。９．８蜂胶全细胞灭活苗制备将蜂胶佐剂津液按１：１０比例稀释，然后将其稀释液同灭活全细胞疫苗等体 积混合，制各蜂胶全细胞灭活苗。免疫前，将疫苗用快速混匀器振荡１０分钟， 使之混匀成乳状。９．９疫苗无菌检验取制备好的佛氏全细胞灭活苗，白油全细胞灭活苗，铝胶全细胞灭活茁，蜂 胶全细胞灭活苗按８．７所示，进行无菌检验。９．１０安全性检验１９生些丛学硕Ｊ。学位论文海朦链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ）伞细胞灭活疫苗的研究用制备的佛氏全细胞灭活茁，白油全细胞灭活苗，铝胶全细胞灭活苗，蜂胶 全细胞灭活茁各免疫两组罗非鱼，每组含２７尾鱼，腹腔注射Ｏ．１ｍｌ／尾，观察半个月。９．１１分组与免疫程序将２２０尾罗非鱼随机分为１０个组，每组２２尾鱼。每种全细胞灭活苗注射２ 组鱼（分别设编号为＃１，＃２），另设两组（分别设编号为＃１，＃２）注射ＰＢＳ 作为对照。 初次免疫时，将四种全细胞灭活苗分别向对应的组腹腔注射疫苗（四种全细 胞灭活苗的剂量均为１０％ｆｕ／；昆 ），同时向对照组注射ＰＢＳ（Ｏ．１ｍｌ，尾）。一周后进行加强免疫，剂量，操作与初次免疫相同（佛氏全细胞灭活苗采用灭活菌液同 佛氏不完全佐剂等体积混合液）。９．１２免疫保护效力实验在加强免疫后１４天，用培养好的ＨＤ．１培养液，对１０组鱼进行腹腔注射感染 ０．２ｍｌ／尾（菌液浓度１０８ｃｆｕ／ｍ１），统计１４天内各组鱼的死亡情况，计算相对保护率 （ＲＰＳ）。９．１３采血及抗体效价的测定初次免疫后第一周及第三周各采血～次，每次从每组随机选取８尾鱼，按 ９．１０所示方法制备血清。 用微量凝集试验测定血清抗体的效价，操作同８．１０。１０．统计方法２０！些查兰堡主兰竺堡兰塑壁堡竺望！塑里！！竺兰丝塑塑！！兰型塾丕适壅堕塑堕塑结果取重复数据平均值，先在Ｅｘｃｅｌ中做初步分析与处理，再用ＳＰＳＳＩＯ．０ 进行平均数差异显著性检验。中山大学预上学位论文海脉链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ）全细胞灭活疫苗的研究第三章结果与分析１．回归实验健康的罗非鱼腹腔注射菌株ＨＤ．１后，２４ｈ内就开始发病。始发症状为厌食， 精神不振。随后的几天罩，感染的罗非鱼表现出一系列感染鱼类链球菌病的典型 症状：进食量减少或者不进食，没有活力，游动缓慢，体色发黑，体表出血ｆ见 图１Ｃ，Ｄ），肛门红肿（见图１Ｂ），游动姿势异常，死前出现间断性狂游。对病鱼进 行剖检，发现病鱼脑部、肾脏出血（见图１Ｈ），肝脏、脾脏出血，肿大，褪色，有的有坏死灶（见图１Ｅ）胃肠积水，膨大（见图１Ｇ）胆囊肿大（见图１Ｆ）。一周内总死亡率达７５％， 而接种ＡＴＣＣ２９１７８组及对照组罗非鱼未发现如上所述临床症状，７天内也没有死亡。２．组织涂片与革兰氏染色将组织涂片镜检。发现ＨＤ．１攻毒后发病鱼的脑、肝、脾、肾中均有大量链球菌。（见图２）３．ＨＤ－１株半数致死量（ＬＤｓｏ）的测定不同稀释度组的ＨＤ一１腹腔注射感染罗非鱼表现出不同的死亡率。各稀释度组的死亡情况如表１所示。按照Ｒｅｅｄ－－Ｍｕｅｎｃｈ法，计算ＨＤ一１株半数致死量 （ＬＤ５０）为５．３×１０６ｃｆｕ／尾。４．组织病理学分析在脑，肝，胰，肾的病理组织切片中均可以观察到链状排列的球菌（见图３ Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ）。此外，在脑中可以观察到嗜中性粒细胞积聚（见图３Ｅ），肝细胞、肾中ＩＵ人学顾Ｉｊ学位论史姆豚链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｉａｅ）争细胞火活疫苗的研究小管细胞发生颗粒变性（见图３Ｆ，Ｈ），脾脏中单核细胞增多（见图３Ｇ），‘肾脏中 巨噬细胞内含大量被吞噬的ｓｉｎｉａｅ（见图３Ｄ）。５．感染后Ｓ．ｉｍａｅ在组织中的分布腹腔注射感染后４ｈ，即可从血液中分离到Ｓｉｎｉａｅ，而腹腔注射感染后８ｈ， 才能从脑中分离到Ｓｉｎｉａｅ。腹腔注射感染后１２ｈ，从血液和脑中分离到的ｌＳ．ｉｎｉａｅ 鼹著增多，在随后的３６ｈ罩，从血液和脑中分离到的Ｓ．ｉｎｉａｅ的数量都不断增加， 并在腹腔注射感染后４８ｈ分别达到Ｓ，ｉｎｉａｅ量最大值（见表２，３）。幽ｌ（ＦＩＧ １１２３中山人学硕ｔ。学位论文海弊链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｉａｅ）伞细胞灭活疫苗的研究图１续．感染Ｓｉｎ蛔ｅ罗非鱼的Ｉ｜缶床症状。（Ａ）Ｉ【－Ｅ常鱼（Ｂ）肛门红肿（ｃ）、（Ｄ）体表出 血（Ｅ）肝脏、脾脏出血，肿大，褪色（Ｆ）胆囊肿大 ｌ肾脏出血． （Ｇ）胃肠积水，膨大（Ｈ）ＦＩＧ １ Ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ．Ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｓ ｏｆ ｔｉｌａｐｉａ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｓ ｉｎｉａｅ．ｆＡｌ Ｎｏｒｍａｌ ｆｉｓｈ（Ｂ）Ａｓｓ ｓｗｅｌｌｅｄ ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｅｄ（Ｃ）．（Ｄ）Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ ｉｎ ｓｋｉｎ（Ｅ）Ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ，ｓｐｌｅｅｎ ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｅｄ，ｓｗｅｌｌｅｄ ａｎｄ ｆａｄｅ ｉｎ ｃｏｌｏｒ．（Ｆ）Ｔｈｅ ｇａｌｌ ｂｌａｄｄｅｒ ｍｍｅｆｉｅｄ．（Ｇ）Ａｓｃｉｔｅｓ ｉｎｓｔｏｍａｃｈ ａｎｄ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ（Ｈ）Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ ｏｆｋｉｄｎｅｙ图２感染Ｓ．ｉｎｉａｅ罗非鱼的组织涂片（Ａ）脑（Ｂ）肝脏（ｃ）脾脏（Ｄ）肾脏 箭头所指是成簇分布的Ｓ．ｉｎｉａｅ，放大倍数Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ×１０００ＦＩＧ２ ｔｈｅ ｔｉｓｓｕｅ ｓｍｅａｒ ｏｆ ｔｉｌａｐｉａ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｓ．ｉｎｉａｅ，（Ａ）Ｂｒａｉｎ（Ｂ）Ｌｉｖｅｒ（Ｃ）Ｓｐｌｅｅｎ （Ｄ）Ｋｉｄｎｅｙ．Ｔｈｅ ａｒｒｏｗｓ ｐＭｍｅｄ ｔｏ ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｏｆＳ．ｉｎｉａｅ．Ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ×１０００２４中山入学硕｝：学位论，ｉ［拇豚链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｉａｅ）全自ｌｌ№灭活ｊ芟苗的研究表１ＨＤ－ｌ菌株腹腔注射罗非鱼的ＬＤ５０实验 ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈＴａｂ．１ Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｏｆ ＬＤ５０ ｏｆｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｔｉｌａｐｉａ ｂｙ ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ＨＤ―ｌ ｓｔｒａｉｎ稀释梯度Ｄｉｌ ｕｔｉｏｎ结果Ｒｅｓｕｌｔｓ积累结果Ａｃｅｕｍｕｌａｔｅｒｅｓｕｉｔ８死亡率Ｍ０ｒｔａｌｉＬｙ “………’Ｄ死亡ｅａｔｈ６ ２ ２ １ｒ生存ｖｉｖ０４ ４ｌ蕊ｓｕｒ生存ｖｉｖ ａｖｉｖｒｕＳｌａｔｏ撇Ｔｌ Ｄｅａｔｈ １１Ｓｕ ＦＶｉｖａ ｌ ０４１０” １０～１０“ｌｌ ９ １１ １４ 】９ ６１００５５．６５ ３ｌ８ １３１９２７．３７．１ ０ｌＯ一’５６ ６１０一‘００ Ｏｃｏ对ｎｔ照ｖ０１０６０图３（ＦＩＧ ３）中山人学碳ｔ学位论文海胨链球菌（Ｓｃｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ：Ｐｉｎｉａｅ）全绑胞灭活疫苗的卅ｆ究图３续．痫理组织切片Ｓ，ｉｎｉａｅ在脑（Ａ）、肝脏（Ｂ）、脾脏（ｃ）、肾脏（Ｄ）ｆｌｔ织中的 分布，箭头所指是成簇分靠的Ｓ，ｉｎｉａｅ。（Ｅ）脑组织中嗜中性粒细胞积聚，箭头示 嗜巾性粒细胞（Ｆ）肝细胞发生颗粒变性，箭头示发生颗粒变性的肝细胞（Ｇ）脾脏 中单核细胞增多，箭头示单核细胞（Ｈ）肾小管细胞颗粒变性，箭头示颗粒变性的 细胞。放大倍数Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，ＧＨＸ１０００，Ｆｘ４００。ＦＩＧ．３ Ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ．Ｔｈｅ ｓｌｉｄｅ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ ｔｉｓｓｕｅ Ｔｈｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｓ．ｉｎｉａｅ ｉｎ Ｂｒａｉｎ（Ａ），Ｌｉｖｅｒ（Ｂ），Ｓｐｌｅｅｎ（Ｃ），Ｋｉｄｎｅｙ（Ｄ），ａｎｄｔｈｅ ａｌＴｏｗ，ｓ ｐｏｉｎｔｅｄ ｔｏ ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｏｆ Ｓ，ｉｎｉａｅ．ｔＯ（Ｅ）Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｉｎ ｂｒａｉｎ，ａｎｄ ｔｈｅ ａｒｒｏｗｓ ｐｏｉｎｔｅｄｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ．（Ｆ）ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｉｎＧｒａｎｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ，ａｎｄ ｔｈｅ ａｒｒｏｗｓ ｐｏｉｎｔｅｄｔＯｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．（Ｇ）Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓｉｎ ｔｈｅ ｓｐｌｅｅｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ａｒｒｏｗｓ ｐｏｉｎｔｅｄ ｔｏ Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ，（Ｈ）Ｇｒａｎｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｐｈｒｉｃ ｔｕｂｕｌｅ．ａｎｄ ｔｈｅ ａｒｒｏｗｓ ｐｏｉｎｔｅｄ ｔｏｃｅｌｌｓ ｉｎ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，ＧＨ×１ ０００，Ｆ Ｘ ４００．中山人学硕１。学位论艾海豚链球菌（＆ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｉａｅ）令细胞灭活疫苗的研究组织中分离 到的细菌数旦胁／ａｅｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ ｓａｍｐｌｅ （ｃｆｕ／ｕ１）０５ｘ１０２８Ｘ１０２１．３Ｘ１０３１．４Ｘ１０３０５０６Ｘ１０２１．１×１０３１＿３×１０３１．６Ｘ１０３０．４３０１ｘ１０２８Ｘ１０２１．０×１０３１．５×ｌｏｓ平均菌落数ｍａｉｎ ｃｆｕ Ｏ．１３ ３１．７４Ｘ １０２９×１０２１．２Ｘ １０３１．５Ｘ １０３（ｃｆｕ／ｕ１）表３不同时间下，Ｓ．ｉｎｉａｅ在血液中的分布情况Ｔａｂ，３ ｔｈｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｉａｅ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｉｍｅ时闽（ｈ）４ ８１２２４３６４８Ｔｉｍｅ组织中分离４８ 到的细菌数Ｓ．ｉｎｉａｅ ｉｎ ４７．５５０９×１０２４．２５Ｘ１０３９．７５Ｘ１０３ｌＡＸｌ０４５０１．２Ｘｌｏｚ９．５×ｌＯｚ１．１×１０３１．４５Ｘ１０４Ｔｉｓｓｕｅ ｓａｍｐｌｅ （ｃｆｕ／ｕ１） ３６．５６０６．２５×１０２５Ｘ１０３１．１ Ｘ１０４１．６５Ｘ ｔｏｓ平均菌落数Ｍｅａｎｃｆｕ４４ ５３．３５．１８×１０２３．４Ｘ】０３７．２８×１０３６．４５×１０４（ｃｆｕ／ｕ１）中山人学硕Ｊ二学位论文海豚链球菌（盛ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｌａｅ）全细胞灭活疫苗的研究５．疫苗用菌株的筛选 ５．１安全性检验四种菌株培养液经福尔马林灭活后，接种于ＢＨＩ固体培养基．ＢＨＩ液体培养基，ＴＳＢ固体培养基，ＴＳＢ液体培养中，２８＂（２培养７２ｈ结果均无细菌生长，可 认为细菌已全部灭活。注射疫苗１４天内，除了ＨＤ．２免疫组２＃有一尾罗非鱼死 亡外（系跳出塑料箱窒息而死，视该组存活率为９５．５％），其他所有被注射疫苗 的罗非鱼全部存活，且活动正常，可认为疫苗是安全可靠的。５．２免疫保护效果检验鱼体在加强免疫后１４天，用对应的病原菌进行腹腔注射攻毒，各免疫组获得 了不同程度的免疫保护力。四种佛氏全细胞灭活茁（ＨＤ．１、ＨＤ．２，ＨＤ．３， ＨＤ．４）的相对保护率（ＲＰＳ）分别是９１．２％，８７．１％，８８．９％，８９．６％。各免疫 组和对照组的死亡情况见表４，图４。由上述结果可以看出，各免疫组在初次免 疫一个半月后，仍具有较强的免疫保护功能，各组间存活率、ＲＰＳ有差异，但差 异不显著（ｐ＞ｏ．０５），其中ＨＤ．１组ＲＰＳ最高，达到了９１．２％。 表４免疫罗非鱼抗￥．ｉｎｉａｅ感染的免疫保护效果１Ｔａｂ．４ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ Ｄ．ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ ａｇａｉｎｓｔ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｗｉｔｈ Ｓ．ｉｎｉａｅ同列内不同小写字母表示差异显著（ｐ―ｏ．０５）。相对保护率（％）＝（对照组死亡率一免疫组死亡率）／对照组死亡率×１００％Ｉ”ｊ其中对照组、免疫组死亡率采用的是两个重复组的死亡率的算术平均值。ＲＰＳ＞５０％，认为 该疫苗能起到免疫保护作用。中山人学硕十学位论文海豚链球菌（Ｓｔｒ印Ｓｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ）全细胞灭活疫苗的研究｜＿ 、 ｛ｔ÷ “１。二：；，毫，ｊ：盘ｉ。：。＋“，；ｊ曩ｋｉ警．ｏ。，ｎｊ．．７７。；ｊ誊≥！誊鬟ｉ羲：ｉ纛ｉ瓣’¨奄ｊ“，蠕‘；，≮犟鬻；∞带怒矗４，墨囊ｉ豢囊霪ｉ：’？专！譬≤ｋ！ｊ荔≤篓鬻ｉｌ§蒸誊囊 ＋免疫组：＾装ｖ糌杂豫嚣串 ∞∞舳∞∞∞０瓣‘穗ｌ鬻？ｊ！：０二‘ｊ，鬻瓣篓鬻《霆蘩 ≮譬羹黧誊ｊ；？＋＿１｜；銎零鬻辫溢ｉ。『；＿；＿＝嚣凌鎏ｊ。ｉ。’－．０一善笺≯≥。、：ｊｌ ２唯一对照组ｆ３４５６７８９１０Ｕ１２时『日Ｊ（天）ＨＤ－１组（ＨＤ一１Ｇｒｏｕｐｓ）ｉ鬻薹霹ｊ嚣’ｊ蔫爨‘蒸：碧！囊，蚓＾Ｘｖ姆蜂谁霜｝ ∞∞∞∞∞加０１ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０，≤菱麓；、囊；ｊ ｉ；。ｊ１＿ｉ基≥熏、，麓蕊囊ｉ麟萋鬻ｉ雾鼍攀薅≮。≤辫ｉ鬻鬟ｉ嗣 ＋免疫组 ？棼蕊燮瑟ｊ≤二ｊ≯ｉ，≤囊磷漾鎏鞫 ～?一对照组ｌ瓣鬻鎏。≥誊》簿蠹蘧豢纛鞫时间（天） ＨＤ?２组（ＨＤ?２Ｇｒｏｕｐｓ）懑繁§戮ｊ ２繇鏊毫瓣搂鬻蒸誉ｉ誊润＋免疫组一一对照组＾美ｖ料蜉忙嚣７ｋ加∞的∞如∞ｏ１２３４５６７８９１０１１时问（天）ＨＤ一３组（ＨＤ－３Ｇｒｏｕｐｓ）中山大学硕士学位论文海豚链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ）全细胞灭活疫苗的研究ＨＤ一４组（ＨＤ一４Ｇｒｏｕｐｓ）图４免疫罗非鱼抗Ｓ．ｉｎｉａｅ感染的平均存活率ＦＩＧ．４ Ｍｅａｎ ｐｅｒｃｅｎｔ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ０＿ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ ｖａｃｃｉｎｅｄ ａｇａｉｎｓｔ Ｓ．ｉｎｉａｅ５．３血清抗体凝集效价的测定 用微量凝集试验测定血清抗体凝集效价，第一周、第三周及第五周鱼体内血 清抗体凝集效价的变化如表５所示。结果表明免疫后，各免疫组鱼体内血清抗体效价随时间增加，到第五周各免疫组抗体凝集效价均达到最高值，分别ｍＤ．１、ＨＤ－２，ＨＤ－３，ＨＤ－４）达到１：１６，１：８，１：４，１：８，其中ＨＤ．１组血清抗体 凝集效价最高，达到１：１６。结合免疫保护效果和血清抗体凝集效价的结果，选 择ＨＤ．１株，做为疫苗株。表５．免疫组和对照组血清中抗体平均凝集效价测定Ｔａｂ．５ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅａｎｔｉｂｏｄｙｔｉｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｖａｃｅｉｎｅｄ ａｎｄ ｕｎｖａｃｃｉｎｅｄ ｔｉｌａｐｉａ中山大学硕Ｌ学位论文海胨链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ）全细胞灭活疫苗的研究６．最佳疫苗佐剂的选取 ６．１安全性检验ＨＤ．１培养液经福尔马林灭活后，接种于Ｂｉｌｌ固体培养基，ＢＨＩ液体培养基，ＴＳＢ固体培养基，ＴＳＢ液体培养中，２８＂Ｃ培养７２ｈ结果均无细菌生长，可认 为细菌已全部灭活。注射疫苗１４天内，除了白油全细胞灭活苗组有２尾罗非鱼 死亡外（两个白油全细胞灭活苗组各有一尾死亡，存活率都为９５．５％），其他所 有被注射疫苗的罗非鱼全部存活，且活动正常，可认为疫苗是安全可靠的。６．２免疫保护效果检验鱼体在在加强免疫后１４天，用对应的病原菌进行腹腔注射攻毒，各免疫组 获得了不同程度的免疫保护力。四种灭活苗（佛氏全细胞灭活苗，自油全细胞灭 活苗，铝胶全细胞灭活苗，蜂胶全细胞灭活苗）的相对免疫保护率（ＲＰＳ）分别 是７８．９％， ７１．１％，４７．４％，５０％。其中佛氏全细胞灭活苗组和白油全细胞灭活茁组同对照组的存活率、相对保护率差异显著（ｐ＜Ｏ．０５），保护效果较好。各免 疫组和对照组的死亡情况见表６，图５。 表６免疫罗非鱼抗Ｓ．ｉｎｉａｅ感染的免疫保护效果Ｔａｂ．６ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ Ｄ．ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ ａｇａｉｓｔ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｗｉｔｈ Ｓ．ｉｎｉａｅ注１．同列内不同小写字母表示差异显著（ｐ《Ｏ．０５）。 ２．相对保护率（％）＝（对照组死亡率一免疫组死亡率）／对照组死亡率×１００％１４”，其中对照 组、免疫组死亡率采用的是两个重复组的死亡率的算术平均值。ＲＰＳ＞５０％，认为该疫 苗能起到免疫保护作用。３１！坐盔兰堡！：兰堡堡兰塑竺堡登堕！塑翌！竺！！竺堡丝！全塑堕墨堕壅苎塑型塑图５免疫罗非鱼抗Ｓｉｎｉａｅ感染的平均存活率Ｔａｂ．５ Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｐｅｒｃｅｎｔ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ０．ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ ｖａｃｃｉｎｅｄ ａｇａｉｎｓｔ Ｓ．ｉｎｉａｅ６．３血清抗体凝集效价的测定 用微量凝集试验测定血清抗体凝集效价，第一周、第三周鱼体内血清抗体凝集效 价的变化如表７所示。结果表明免疫后，各免疫组鱼体内血清抗体效价随时问而 略有提高，血清抗体凝集效价最高值分别（佛氏全细胞灭活苗，白油全细胞灭活 苗，铝胶全细胞灭活苗，蜂胶全细胞灭活苗）为１：８，１：４， １：２， １：２。结合免疫保护效果和血清抗体凝集效价的结果。用佛氏佐剂和白油制备的全细 胞灭活疫苗具有较好的免疫保护效果，可做为商品化Ｓ．ｉｎｉａｅ疫苗的候选。表７．免疫组和对照组血清中抗体平均凝集效价测定Ｔａｂ?７ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｉｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｖａｃｃｉｎｅｄ ａｎｄ ｕｎｖａｃｃｉｎｅｄ ｔｉｌａｐｉａ佛氏佐剂 白油佐剂 铝胶佐剂 蜂胶佐剂 ＰＢＳ对照组１０８ １０８ １０８ １０８ １０８１：２ ＜２ ＜２ ‘２ ＜２１：８ １：４ １：２ １：２ ＜２３２中山大学硕士学位论文海豚链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｓ ｉｎｉａｅ）全细胞灭活疫苗的研究第四章讨论１．海豚链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｌａｅ）对罗非鱼的致病性链球菌属能导致鱼类疾病的种类主要包括：Ｘａｇａｌａｃｔｉａｅ（无乳链球菌）。ｓｍｉｌｌｅｒｉ（米勒链球菌），Ｓ．ｉｎｉａｅ（海豚链球菌），＆胛阳曲州ｓ（副乳房链球菌），＆ｄｉｆｆｉｃｉｌｉｓ［８】【４９｝，但在绝大多数链球菌病例中经研究确定的病原为ｓ跏缸ｅ１９１。利用本 实验室分离鉴定的Ｓ咖妇ＨＤ．１株进行回归实验，结果发现ＨＤ．１对罗非鱼有很强 的毒力（一周内总死亡率达７５％，ＬＤ５０为５．３×１０６ｃｆｕ／ｍ１），结合临床症状观察， 病理组织切片分析， 结果都与国外相关研究报道基本一致，因此可以确定Ｓｉｎｉａｅ也是我国养殖鱼类链球菌病的首要病原。 关于Ｓ．ｉｎｉａｅ自然感染及人工感染养殖罗非鱼的临床症状，国外已有报道。 Ｂｏｗｓｅｒ等（１９９８）ｔｓｏｌ观察．到感染Ｓ．ｉｎｉａｅ的濒死罗非鱼体表，口腔周圈，鳃盖，鳍条基部，肛门均有出血现象。Ｊｏｙｃｅ等（２０００）ｔ１２】通过鼻腔人工感染罗非鱼，发病罗非鱼出现厌食或拒绝进食，皮肤黑色素沉积，不规则的游泳行为的现象。Ｐｅｒｅｒａ 等（１９９４）ｐｌＪ报道，自然感染的罗非鱼会呈现失去方向感，角膜浑浊，眼球突出， 眼睛畸形的症状；Ｓｔｏｆｆｒｅｇｅｎ等（１９９６）１５２Ｊ报道人工感染条件下，杂交条纹鲈出 现皮肤和视觉系统损伤（单侧或两侧眼球突出，眼球出血或浑浊）的症状。本实 验采用腹腔注射感染的方式，感染的罗非鱼表现出一系列鱼类链球菌病的典型症 状：进食量减少或者不进食，没有活力，游动缓慢，体色发黑，体表出血，肛门 红肿，游动姿势异常，死前出现间断性狂游， 但未发现病鱼出现皮肤及眼球的损伤。此外我们还发现当感染罗非鱼出现以上症状时（尤其是出现游动姿势异常， 狂游时），很快病鱼便开始出现死亡。之所以各个文献中所提到的感染临床症状 不同，可能是因为自然感染与人工感染，及不同感染途径条件下病鱼会表现出不 同的症状，另外菌株本身致病性的差异也可能导致临床症状彼此不同。且前，所 有关于此病的报道中，最频繁出现的症状是眼球突出，出血，游动姿势异常，急 性死亡，因而当养殖鱼类表现出以上特征时，链球菌病就应该在病因考虑之列。 腹腔注射感染４ｈ及８ｈ后，可以分别从血液和脑组织中分离到Ｓ．ｉｎｉａｅ， 这一结果证实了Ｓ．ｉｎｉａｅ能够突破血脑屏障。并在脑组织中散布生长。在随后的±坐叁兰堡生兰垡堡奎塑壁堡壁堕！ｉ受竺竺！兰丝！全塑堕丕煎壅茔塑！！塞时间里分离到的细菌数量不断增加，说明Ｓ．ｉｎｉａｅ在鱼体内不断繁殖扩增。据Ｓｈａｗｎ等（２００３）【”１报道，经由鳃感染杂交条纹鲈，７２ｈ内，从脑中分离到的Ｓ．ｉｎｉａｅ 数量持续增加，而Ｊｏｙｃｅ等（２０００）［ｔ２】报道，经由鼻腔感染杂交条纹鲈，４８ｈ时， 从脑中分离到的Ｓ．ｉｎｉａｅ数量开始减少，我们实验中通过腹腔注射感染，４８ｈ内， 从脑中分离到的Ｓ．ｉｎｉａｅ数量持续增加，出现这种差异的原因可能是不同感染方 式下，Ｓ．ｉｎｉａｅ入侵鱼体、突破血脑屏障的进程不同，从而导致不同组织中的分布 情况不同。目前关于Ｓ．ｉｎｉａｅ入侵鱼体的具体机制尚不清楚，Ｊｅｆｆｒｅｙ等（２００１）１１８１ 曾对致病株和非致病株进行ＰＦＧＥ分析，结果发现致病株和非致病株的ＰＦＧＥ图 谱不同，这预示着存在一种或几种由特异性基因序列编码的毒力因子，而这些毒 力因子是Ｓ．ｉｎｉａｅ致病性的决定因索。Ｊｅｆｆｒｅｙ等还以小鼠为动物感染模型，来研 究Ｓ．ｉｎｉａｅ的致病机制，结果发现致病株对上皮细胞有直接的细胞毒作用，可以 破坏上皮细胞层，进入血管，从而向其他组织扩散，并能进一步突破血脑屏障， 导致脑膜炎。致病株还可以黏附并入侵上皮、内皮细胞，并在被侵入细胞中存活 一段时间，从而躲避宿主免疫系统的清除功能或者突破细胞间屏障向其他组织扩 散。尽管从Ｓ．ｉｎｉａｅ致病株中尚未发现传统链球菌群中含有的可以抵制吞噬作用 的Ｍ蛋白，但其可能存在一种未知的表面蛋白或者可分泌的蛋白因子，从而干 扰巨噬细胞的清除作用。Ａｍｉｒ等（２００３）［２０ｌ报道了吞噬细胞和Ｓ．ｉｎｉａｅ的相互 作用及其在Ｓ．ｉｎｉａｅ入侵过程中的意义。结果表明血清型Ｉ和１１Ｓ．ｉｎｉａｅ都可以侵 入吞噬细胞，但Ｉｌ型Ｓ．ｉｎｉａｅ在吞噬细胞中存活的时间更长，而且能够引发巨噬 细胞凋亡，这些特征不仅使Ⅱ型Ｓ．ｉｎｉａｅ在入侵时，受到非特异性免疫的防御作 用降低，而且为其随巨噬细胞突破血脑屏障，侵入中枢神经系统，引发脑膜炎提 供了可能。此外，Ｊｅｆｆｒｅｙ等（２００２）【２４ｌ还研究Ｓ．ｉｎｉａｅ中链球菌溶血素蛋白同其 致瘸力的关系，Ｍｅｌｏｄｙ等（２００２）［２２】建立了斑马鱼－－Ｓ．ｉｎｉａｅ感染模型，从鱼类 的角度研究Ｓ．ｉｎｉａｅ的致病机制。总的说来，有关Ｓ．ｉｎｉａｅ致病性及致病因子很多 方面研究尚未有结论，有待深入研究，以便有效预防和控制暴发性疾病的流行。 作为一种入畜共患病原，ｓ ｉｎｉａｅ也可以感染人类。１９９５―１９９６年间，在加拿 大多伦多地区首次发现该菌对人感染的病例，后在美国，香港也出现人感染的病 例例Ｉ。目前已知的传染途径是人类处理鱼时，经由伤口造成的Ｓ ｉｎｉａｅ侵入感染， 鱼种多为罗非鱼，患病人都是年龄较大的亚洲人，临床症状主要是蜂窝织炎，也中山人学顾士学位论文海豚链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ）令细胞灭活疫苗的研壅有患者出现关节炎、脑膜炎、心内膜炎，使用Ｐｅｎｃｉｌｌｉｎ的治疗效果良好。用ＰＦＧＥ 对鱼源和人源的致病性Ｓｄｎｉａｅ进行分子分型时，发现它们都具有两种基因图谱 （Ａ或Ａ，）１２１】。我国对Ｓ．ｉｎｉａｅ作为人畜共患病原的研究几乎为空白，亟需进行深入的研究。２．免疫防治国外从上世纪九十年代中期便开始进行鱼链球菌疫苗的研究：以色列在 １９９５．１９９７年间研制的ｓ ｉｎｉａｅ灭活疫苗使虹鳟的链球菌病死亡率从５０％下降到 ５％１２９１。美国也于１９９９年开始着手研制工ｉｎｉａｅ灭活疫苗，并在罗非鱼免疫保护实 验中，产生较好的保护效果，相对保护率高达９３．２％１３９１。 制备控制动物疾病的疫苗，最重要的生物学原则是疫苗对防治对象要安全， 有效。因此，国内外鱼类细菌病免疫防治，大都采用灭活的死菌苗作为鱼用疫苗， 通常采用福尔马林灭活和热灭活两种方法。美国联邦农业部（ｕｓＤＡ）提出商用 疫苗在鱼体免疫后７～１４天内存活率要达到９５％以上ｆ５３】。我们的实验表明用３％ 的福尔马林灭活制得的全细胞灭活疫苗对罗非鱼的安全性均达到９５．５％以上，符 合了疫苗安全性的要求。 Ｐｈｉｌｌｉｐ等（２０００）１３９１采用腹腔注射Ｓ．ｉｎｉａｅ全菌灭活疫苗（４×ｌＯＳｃｆｕ／尾）来 免疫罗非鱼，经过一次免疫，发现６周内福尔马林灭活疫苗免疫组相对保护率最 高可达到９３．７％，最低也有４５．６％。Ａｖｉ等（１９９７）ｆ５岫对虹鳟腹腔注射抗Ｓ抽抽口 全细胞灭活疫苗（３×１０”ｃｆｕ／尾），分两组分别采取一次， 二次免疫，结果６周内两组福尔马林灭活疫苗相对保护率都是８７．５％。本实验利用从惠东采集到的 四株ｓ ｉｎｉａｅ（ＨＤ．１，ＨＤ－２，ＨＤ．３，ＨＤ．４）制备的四种佛氏全细胞灭活苗腹腔免疫 罗非鱼（２×ｌＯＳｃｆｕ／尾），经两次免疫，７周内免疫保护率分别达到９１．２％，８７．１％， ８８．９％，８９．６％。这说明了在一定时间内。罗非鱼注射佛氏全细胞灭活苗后获得 了较好的免疫保护效果。今后可以考虑提高注射疫苗的剂量，利用全细胞菌液同 灭活菌株培养液按一定比例混合，制备全菌灭活疫苗从而进一步提高疫苗的保护 效果。 鱼类虽然属于低等脊椎动物，但对于外来抗原仍可产生免疫应答反应。Ａｖｉ中山人学磺Ｊ。学位论文海豚链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｉａｅ）伞细施灭活疫苗的研究等（１９９７）ｉ５４】用Ｓ．ｉｎｉａｅ全细胞灭活疫苗免疫虹鳟，血清抗体凝集效价最高可达１：３０：Ａｖｓｈａｌｏｍ等（１９９７）ｔ贷ｌ用Ｓ．ｉｎｉａｅ全细胞灭活疫苗免疫虹鳟，血清抗体凝集效价最高～组可达１：６０，但ＲＰＳ最高的组抗体效价却仅为１：２。Ｓａｋａｉ等（１９８９） １５６１曾报道，利用腹腔注射给予疫苗后会出现测得的鱼体血清抗体凝集效价很低， 而经过浸泡法给予疫苗，则检测不到鱼体血清抗体凝集效价的现象；Ａｖｉ等 （１９９７）ｔ删发现，利用微量凝集法测褥抗体滴度仅为ｌ：１，疫苗仍具有保护效果。 本实验利用四种佛氏全细胞灭活苗免疫罗非鱼，血清抗体凝集效价最高值达到 １：１６，用四种佐剂制备的全细胞灭活苗的抗体效价最高也仅为１：８，以上抗体 效价水平，不仅远低于哺乳动物免疫后测得的血清抗体凝集效价，而且比鱼类使 用其他菌苗免疫后测得的血清抗体凝集效价低很多，与疫苗的免疫保护力缺乏对 应关系。出现这一结果可能的原因是经过免疫后，鱼体内产生的抗体虽足以对鱼 产生保护，但由于实验中采用的抗体效价检测方法（微量凝集试验）不够灵敏， 因此测得的抗体效价水平～直很低。 佐剂是一种能够非特异性地增强或改变疫苗免疫应答的一类物质，一般与疫 苗一起使用或者预先使用。一般认为佐剂能使抗原在鱼体内缓慢释放，增强巨噬 细胞和浆细胞的活性，提高抗体水平【５７】。但也有报道佐剂会对鱼体产生一些负 面影响，例如影响鱼的生长、产生肉芽瘤、色素、内部器官粘连及注射位点病变 等【５８】。 鱼用疫苗常用的佐剂主要有三种类型，一是以矿物质乳胶为基质的佐剂，如 氢氧化铝乳胶（铝胶）、硫酸铝、钾明矾等。＝是以油为基质的佐剂，如佛氏不 完全佐剂（ＦＩＡ）、佛氏完全佐剂（ＦＣＡ）、油包水型乳化佐剂和水包油包水乳化 佐剂等。三是在我国以中草药莨菪为佐剂，能增强疫苗的渗透性，促进鱼体的吸 收【５９Ｊ，而目前外国已报道的抗Ｓｉｎｉａｅ疫苗均未采用任何佐剂。本实验采用了四种 不同佐剂，其中佛氏佐荆，白油佐剂属于以油为基质的佐剂， 铝胶佐剂属于以矿物质乳胶为基质的佐剂，蜂胶佐剂主要是在家禽，家畜免疫保护时使用，目前 尚未有其用于鱼用疫苗的报道。利用四种佐剂（佛氏佐剂， 白油佐剂，铝胶佐剂，蜂胶佐剂）制备的全细胞灭活苗腹腔免疫罗非鱼（１０Ｓｃｆｕ／尾），经两次免疫， ５Ｎ内免疫保护率分别达至ｔＪ７８．９％，７１，１％，４７．４％，５０％，血清抗体凝集效价最 高值分别为１：８，１：４， １：２，１：２，其中佛氏全细胞灭活疫苗和白油全细中山大学硕十学位论文海豚链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｉａｅ）全细胞灭活疫苗的研究胞灭活疫苗的免疫保护效果较好。 本实验用佛氏佐剂和白油制备的全细胞灭活疫苗的免疫保护效果比Ｐｈｉｌｌｉｐ 等（２０００）【３９】及Ａｖｉ等口４】制备的Ｆ笛．／ｎ／ａｅ疫苗的免疫保护效果稍低，其原因可能 是制备的全细胞灭活疫苗除去了Ｓ．ｉｎｉａｅ培养液中部分蛋白抗原，故而其免疫效果 不及全菌疫苗，而免疫时所用的疫苗的浓度（本试验所用疫苗浓度１０９ｃｆｕ／ｍｌ，Ａｖｉ 等接种疫苗的浓度最高可达３Ｘ１０ｎｃｆｕ／ｍ１）较低，也会影响到疫苗的保护效果， 此外注射感染时，采用的菌株毒力的强弱、剂量的大小也会影响到疫苗的ＲＰＳ，肖惠等（２００３）Ｉ删提出，实验室攻毒手段与实际生产中的自然感染存在差异，因此如何利用实验室攻毒手段尽可能客观真实反映水产动物经免疫后获得免疫保护 力显得相当重要。 本实验用佛氏佐剂和白油制备的佛氏全细胞灭活疫苗具有较好的免疫保护 效果，可做为商品化抗Ｓ．ｉｎｉａｅ疫苗的候选。进一步研究可以包括检验用ＨＤ．１ 制备的全细胞灭活疫苗对分离到的其他株Ｓ．ｉｎｉａｅ的免疫保护效果，所选用的佐 剂对鱼体的副作用，及通过更大规模的田间试验对制各的疫苗的免疫效率进行考 察，以推动商品化抗Ｓｄｎｉａｅ疫苗早目研发成功并投入生产实践。中山大学硕卜学位论文海豚链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｉａｅ）幸细胞灭活疫苗的研究全文总结１．利用从惠东分离到的海豚链球菌（ＳｔｒｅｐｔＯＣＯＣＣＵＳ ｉｎｉａｅ）ＨＤ～ｌ株 实现了对罗非鱼的人工感染。利用Ｒｅｅｄ―Ｍｕｅｎｃｈ法计算其半数致死量 （ＬＤｓ。）为５．３×１０６Ｃｆｕ／尾。感染￡ｉｎｉａｅ的罗非鱼表现出体色发黑， 体表出血，游动姿势异常等一系列鱼类链球菌病的典型症状：对病鱼进 行剖检，发现病鱼的脑，肾脏出血，肝脏、脾脏肿大，褪色，胃肠积水， 胆囊肿大。结合病理组织切片分析， 结果都与国外相关研究报道基本一致，因此可以确定＆ｉｎｉａｅ也是我国养殖鱼类链球菌病的首要病原。２．将四种不同菌株（ＨＤ―ｌ，ＨＤ一２，ＨＤ一３，ＨＤ－４）的培养液，经福尔马 林灭活，制备了四种佛氏全细胞灭活疫苗，将这四种灭活苗通过腹腔注 射免疫罗非鱼（２ｘ１０９０ｆｕ／尾），经过两次免疫，初次免疫后２１天，用对 应的菌株攻毒来考察疫苗的免疫保护力。结果表明使用ＨＤ．１株制备的 佛氏灭活苗相对保护率（ＲＰＳ）达到９１．２％，最高抗体凝集效价达到 １：１６，免疫效果较好，可作为疫苗株候选。３．将选取的疫苗株（ＨＤ．１）培养液用福尔马林灭活，同四种不同佐剂（佛 氏佐剂，铝胶佐剂，蜂胶佐剂，白油佐剂）混合制备四种全细胞灭活疫苗， 将这四种全细胞灭活苗通过腹腔注射免疫罗非鱼（１×１０９个／尾），经过 了两次免疫，初次免疫后１４天，用ＨＤ．１攻毒考察疫苗的免疫保护力， 并监测血清抗体效价的变化。结果表明佛氏佐剂、白油佐剂制备的全细胞灭 活疫苗的保护效果较好，可做为商品化Ｓ．ｉｎｉａｅ疫苗的候选。主些尘兰堡主兰竺笙苎塑壁壁蔓堕！墅翌竺竺堡塑！！全墅塑丕垩壅堕塑竺塞参考文献１．Ｈｏｓｈｉｎａ Ｔ，Ｓａｎｏ Ｔ ａｎｄ Ｍｏｒｉｍｏｔｏ Ｙ．Ａ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｔｏ ｆｉｓｈ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｏｋｙｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ，１９５８，４４：５７―６８． ２．Ｃｒａｉｇ Ｓ ａｎｄ ｅｈｉｌＵｐ Ｋ．Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｂｌｅｍｓ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ：ａ ｒｅｖｉｅｗ．Ｉｎ ｔｉｌａｐｉａａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，１９９７，２（６）：７１＿８０．３．Ｂｅｒｇｅｙ Ｄ Ｈ，Ｊｏｈｎ Ｇ Ｈ，Ｎｏｅｌ Ｒ Ｋ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒ Ｈ Ａ Ｓ．Ｂｅｒｇｅｙ’Ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ １９９４，３３２?３３４． ４．Ｐｅｔｅｒ Ｈ Ａ Ｓ ａｎｄ Ｈｏｌｔ Ｊ Ｇ。Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌｕｍｅ １． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．ＮｉｎｔｈＥｄｉｔｉｏｎ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ：Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ／Ｌｏｎｄｏｎ：Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，１９８６，４０８―４２０． ５．陆承平．兽医微生物学．哈尔滨：中国农业出版社，２００１，１４８－１５７． ６．Ｉｎ＃ｉｓＶ Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｒ Ｊ ａｎｄ Ｂｒｏｍａｇｅ Ｎ Ｒ．Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｉｎ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｆｉｓｈ．ＮＹ：ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９３，１：９６－９７．ｏｎ７．Ｋｕｓｕｄａ Ｒ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｆｉｓｈ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｉｎ ｍａｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｊａｐａｎ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉａｌ ｅｍｐｈａｓｉｓ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ．Ｉｓｒａｅｌｉ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＡｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，１９９２，４４：ｔ４０． ８．Ｒｏｙ Ｐ Ｅ．Ｙａｎｏｎｇ ａｎｄ Ｒｕｔｈ Ｆ．Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆｆｉｓｈ．ｈｔｔｐ：／／ｅｄｉｓ．ｉｆａｓ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／ｏｕｔｌｉｎｅ＿ｆａ０５７＃ｆｏｏｔｎｏｔｅ ２，２００２．９。Ｅｌｄａｒ Ａ，Ｇｈｉｔｔｉｎｏ Ｃ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｒｖｉｅａｅ ａｎｄ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｒａｉｎｂｏｗ ｔｒｏｕｔ Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ：ｓｉｍｉｌａｒ，ｂｕｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ａｑｕａｔｉｃｏｒｇａｎｉｓｍｓ，１９９９，３６（３）：２２７―２３１． ａｎｄ ＭａｄｉｎＳ Ｈ．Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｎ１０．Ｐｉｅｒ Ｇ Ｂｉｎｉａｅ ｓｐ．ｎｏｖ．．ａｂｅｔａ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍＡｍａｚｏｎ ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ ｄｏｌｐｈｉｎ，ｌｎｉａ ｇｅｏｆｆｒｅｎｓｉｓ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９７６，２６：５４５－５５３． １１．Ｐｅｒｅｒａ Ｒ Ｐ，Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｓ ＫａｎｄＬｅｗｉｓＤ Ｉ－Ｉ．Ｅｐｉｚｏｏｔｉｏｌｏｇｉｃａｌａｓｐｅｃｔｓ ｏｆＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｔｉｌａｐｉａ ｉｎ Ｔｅｘａｓ，Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，１９９６，１５２：２５－－３３． １２．Ｊｏｙｅｅ Ｊ Ｅ＇Ｃｒａｉｇ Ａ Ｓ ａｎｄ Ｐｈｉｌｌｉｐ Ｋ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｓｔ却ｅｄ ｂａｓｓ（Ｍｏｒｏｎｅ ｃｈｒｙｓｏｐｓｘＭｏｒｏｎｅ ｓａｘａｔＨｉｓ）ａｎｄ ｔｉｌａｐｉａ（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓｎａｒｅｓｎｉｌｏｔｉｃｕｓ）ｂｙｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ．Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，２０００，１８９：１９７－２１０．３９中山大学硕士学位论文海豚链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｉａｅ）垒细胞灭活疫苗的研究１３．Ａｍｉｒ Ｚ，Ｈａｎｎａｈ Ｈ ａｎｄ Ａｖｉ Ｅ．Ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ ｆｒｏｍｗｉｌｄ ｆｉｓｈｔＯｃｕｌｔｕｒｅｄｆｉｓｈ．Ａｐｐｌｉｅｄａｎｄｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９８，４０６５－４０６７． １４．Ｊｏｙｃｅ Ｊ Ｅ，Ｃｒａｉｇ Ａ Ｓ ａｎｄ Ｐｈｉｌｌｉｐ Ｋ Ｈ．Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ ｉｎ ｈｙｂｒｉｄ ｓｔｒｉｐｅｄｂａｓｓ（ＭｏｒｏｎｅｃｈｒｙｓｏｐｓＸＭｏｒｏｎｅ ｓａｘａｔｉｌｉｓ）ｆｏｌｌｏｗｉｎｇｎａｒｅｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ．Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，２００１，１９４：２３３―２４３． １５．Ｓ