感染的化学预防--《国外医学(内科学分册)》1981年10期
感染的化学预防
【摘要】：正 感染的化学预防是一个有争议的课题。尽管应用化学药物预防感染已有多年,但其指征及效果在许多方面仍待澄清。化学预防在下列情况下很可能成功:①用于单一的细菌感染;②病原体对所用的药物十分敏感;③所用的药物副作用极小;④感染的危险性很大,必须使用抗菌药物,尽管这种药物对人体可能有些不良作用;⑤在感染或污染发生之前应用抗菌药物。根据上述条件,药物预防风湿病最为适宜。
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400-819-9993预防链球菌感染与风湿热(氮洁霉素及青霉素口服应用的比较)--《国外医学(内科学分册)》1980年05期
预防链球菌感染与风湿热(氮洁霉素及青霉素口服应用的比较)
【摘要】：正 预防呼吸道的链球菌感染,对于防止风湿热以及风湿性心脏病的发生很为重要。每周注射青霉素120万 U 最为有效,但由于注射部位痛感较重,加以有出现过敏反应的潜在危险,有人乃改青霉素注射为口服应用。但这易促使患者咽部链球菌产生青霉素酶而将青霉素破坏以致往往失败,严重病例,该耐药菌可并发细菌性心内膜炎。因此,有必要寻找其它可以替代的药物,红霉素及磺胺嘧啶等亦可使用。本文报告
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链球菌感染风湿热
状态：就诊前
希望提供的帮助：
去那家医院能对口我这毛病
所就诊医院科室：
赤城中医院 感染内科
用药情况：
药物名称：输液阿齐
服用说明：十天了
既往病史：
无（填写）
建议到大医院风湿免疫科看看
王玉明大夫通知出停诊:敬告各位患者，因外出休假，王玉明将于日至3月23日停诊，3月26正常出诊。给您带来的不便敬请谅解。
大夫郑重提醒：因不能面诊患者，无法全面了解病情，以上建议仅供参考，具体诊疗请一定到医院在医生指导下进行！
疾病名称：一周前腿部出现红斑，三天后自行消退&&
希望得到的帮助：请帮忙确诊是否为免疫系统疾病，是否为结节性红斑，血管炎，有无可能发展为系统性红斑...
病情描述：怀两个孩子时，都是妊高症。现在尿常规都正常。起红斑前几天，有感冒症状，吃了感通片，益生菌等药物。还有吃过大补的东西。
疾病名称：习惯性流产&&
希望得到的帮助：37周时可以剖宫产吗？胎儿大约多重需要放温箱吗？再等几天风险会不会很高？权衡利弊最...
病情描述：孕36+4，阿司匹林停药9天，还在服用氢氯喹和强的松，胎心监护一切正常
疾病名称：肝硬化肺结合矽肺类风湿冠心病&&
希望得到的帮助：长期服用激素药物导致一身病症，该怎么办
病情描述：因多年下煤矿，从而十四年前患有类风湿其治疗期间服用激素药品，去年年底检查出患有肝硬化，矽肺等疾病，现在全身患有湿疹，浮肿。这次住院查出有冠心病
疾病名称：体检异常，不知道什么病&&
希望得到的帮助：想知道提示免疫系统有多大问题
病情描述：体检结果：cd3正常，cd3+cd8偏低，cd4/cd8=0.7(1.0-2.0).其他方面，胆红素升高，轻度脂肪肝。体检报告单
疾病名称：风湿免疫&&
希望得到的帮助：到底是什么病？是风湿么？现在以反应性关节炎？收治入院，还未用激素
病情描述：游走性关节疼痛半月余，伴随低烧10天，现行走困难
全身检查都做了，并没有实质性病变
疾病名称：晨起四肢疼痛，缓解缓慢，有时一天都疼。&&
希望得到的帮助：需要在什么科室挂号，能否使用止痛类药物缓解
病情描述：近期病情加重，本身患有胆囊炎，最近时常发作
疾病名称：系统性红斑狼疮&&
希望得到的帮助：是否是膝关节有问题，还是风湿病？
病情描述：双腿膝关节僵硬，走路时间长就会感觉很累，坐下或者放松就没什么感觉，站立的时候，关节往小腿向下感觉就是僵在那里
疾病名称：早上起床低头感觉手臂后面不是脊椎两边疼&&
希望得到的帮助：想去检查但是检查好多都没用没信心了3年了快我才18希望能帮下我
病情描述：以前医生说和姿势不对有关系吃药没效果
早上或者白天起床低头时候感觉脖子后面下面的筋拉着背疼不低头不疼睡觉上床躺着腰椎有点不舒服和背哪里躺下一会就好了起床几个小时后减轻
疾病名称：手指关节痛，膝盖痛&&
希望得到的帮助：是否去门诊就诊，看什么科
病情描述：1年前患了vkh综合症，服激素11个月，现停药2个月，停药后身上开始痛，近两个星期加重
疾病名称：纤维征肌痛综合征&&
希望得到的帮助：想医生能帮助解答疑问，谢谢医生
病情描述：膝盖 脚踝 肘关节针刺钻骨的频频的疼
是纤维肌痛综合征的症状还是类风湿关节炎的症状？
纤维肌痛综合征会咳嗽吗？
脑脊液伪影和纤维肌痛综合征有关吗？
胸腔后壁后背积液会胸腔内胀痛吗？
疾病名称：早上起来，右手发胀明显，左手次之，脚也胀&&
希望得到的帮助：该去什么科去看？可能的疾病是啥？如何缓解和控制？
病情描述：高血压患病6年多，间断用药，最近一年多持续用药，2017年10月体检，类风湿因子，抗链O正常
疾病名称：双肩酸痛 手肘手腕 都咯吱响&&
希望得到的帮助：什么疾病，从哪一方面开始查
病情描述：颈椎有滋滋的声音，双肩酸痛，手腕，手肘，肩膀都酸痛，还有弹响声，感觉是蔓延的，一开始脖子、肩膀、手肘、手腕 只是弹响声，然后脖子、肩膀酸痛，然后手肘痛，现在蔓延到手腕了，走路点时候 ...
疾病名称：做完扁桃体和鼻窦炎手术后类风湿一个月查血&&
希望得到的帮助：疼痛部位怎么老是转移？
病情描述：本来是右手手腕疼，现在左手中指和右手手腕不疼了，右手食指又开始疼，请问类风湿疾病的疼痛，是不是这个好了就转移到另一个地方疼？
疾病名称：结缔组织病。雷偌氏现像&&
希望得到的帮助：医学院鉴定是结缔组织病。雷偌氏现像
病情描述：天气冷 ，双手指头发白。变紫，变红。暖一下手。几分钟后正常
疾病名称：右腰内侧疼痛是肾的问题吗&&四肢冷痛然后手脚无力是风湿嘛&&
希望得到的帮助：请问脚后跟疼和痛风有关吗
病情描述：医生我这两天右肾和左肾腰内侧有疼痛然后尿尿多，滴不完.肚子小腹也有点疼痛这几天手淫比较频繁我四肢关节冷痛然后无力是什么病？会是风湿性关节炎嘛？然后我尿酸530每天吃一片苯溴马隆片对身体...
疾病名称：疑似干燥综合症&&
检查及化验：2012年1月，因查体中发现胆结石，所以去协和医院消化内科就诊，检查发现：肝病自身抗体谱中抗核抗体（IgG）为阳性H1：640（参考<1：40）；血沉16,超敏C反应蛋白2.34，均正常；r球蛋...
疾病名称：关节疼痛，麻木，晨僵。手指小关节轻微变形&&
希望得到的帮助：是否需前来就诊，可否指导用药
病情描述：父亲有类风湿关节炎，有糜烂性胃炎，晚上睡觉时，肩关节，肘关节，疼痛明里(右边严重，左边稍轻)，有颈椎病史，食指，小指笫一关节有轻微变形。
疾病名称：浑身觉得骨关节疼痛没力气&&
希望得到的帮助：去301医院挂号挂哪个科
病情描述：右脚踝处做过小针刀术．右腿一直到腰都有酸累的感觉．一周前开始觉得全身骨头没劲儿，两膝盖觉得走路无力
疾病名称：风湿&&
希望得到的帮助：风湿病如何预防
病情描述：情问风湿病如何预防，空气潮湿就会得风湿病吗
疾病名称：脂肪瘤&&子宫腺肌症&&自免性肝炎&&干燥症未确诊，自免性肝炎&&绝经&&肾错沟瘤&&
希望得到的帮助：現在激素三粒，帕芙琳兩粒。粉樂因為眼睛不好停了。控制高血壓科索亞和波依定，富馬酸...
病情描述：鄭教授：這些報告都是11/2週四專病門診後檢查的。貧血的問題出在哪裡？心臟和肺的檢查也好像和以前差不多
投诉类型：
投诉说明：（200个汉字以内）
王玉明大夫的信息
治疗，强直性脊柱炎、血管炎，产后风湿，致密性骨炎、痛风、纤维肌痛综合症，肺间质病变，干燥综合症，类风...
王玉明，女，主任医师，毕业于首都医科大学中医药学院，现任北京中医医院风湿科主任、研究生导师、中华医学...
王玉明大夫的电话咨询
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中医免疫内科可通话专家
广安门中医院
风湿免疫科
江苏省中医院
风湿免疫科
湖南省中医附一医院
副主任医师
甘肃省中医院
风湿骨病科
副主任医师
江苏省中医院
广安门中医院
风湿免疫科大活络丹治致过敏一例--《中医药学刊》1997年05期
大活络丹治致过敏一例
【作者单位】：
【分类号】：R285.6
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400-819-9993POLYPEPTIDE, DNA MOLECULE ENCODING THE POLYPEPTIDE, VECTOR, PREPARATION METHOD AND USE
WIPO Patent Application WO/
A polypeptide, a DNA molecule encoding the polypeptide, a vector, a preparation method and a use therefor are disclosed. The polypeptide comprises an amino acid sequence represented by formula (I) or formula (II): formula (I) comprises an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; formula (II) comprises an amino acid sequence obtained by subjecting the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 to modification, substitution, and deletion or addition of one or more amino acids. The polypeptide may be used in the preparation of drugs that treat or prevent diseases related to infections caused by bacteria, and can also be used in the preparation of drugs that promote tissue repair and wound healing.
Inventors:
LI, Wenxin (Room 201, Building 6 International Enterprises Center,No.1 Guanggu Avenue, Donghu Distric, Wuhan Hubei 4, 430074, CN)
CAO, Zhijian (Room 201, Building 6 International Enterprises Center,No.1 Guanggu Avenue, Donghu Distric, Wuhan Hubei 4, 430074, CN)
WU, Yingliang (Room 201, Building 6 International Enterprises Center,No.1 Guanggu Avenue, Donghu Distric, Wuhan Hubei 4, 430074, CN)
WANG, Zesheng (Room 201, Building 6 International Enterprises Center,No.1 Guanggu Avenue, Donghu Distric, Wuhan Hubei 4, 430074, CN)
HAN, Song (Room 201, Building 6 International Enterprises Center,No.1 Guanggu Avenue, Donghu Distric, Wuhan Hubei 4, 430074, CN)
Application Number:
Publication Date:
01/22/2015
Filing Date:
07/16/2014
Export Citation:
WUHAN MORE BIOTECHNOLOGY CO., LTD. (Room 201, Building 6 International Enterprises Center,No.1 Guanggu Avenue, Donghu Distric, Wuhan Hubei 4, 430074, CN)
International Classes:
C07K7/06; A61K38/08; A61K38/10; A61P17/02; A61P31/04; C07K7/08; C12N15/12; C12N15/63
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Foreign References:
Other References:
See also references of EP
Attorney, Agent or Firm:
UNITALEN ATTORNEYS AT LAW (7th Floor, Scitech PlaceNo.22, Jian Guo Men Wai Ave., Chao Yang District, Beijing 4, 100004, CN)
权 利 要 求
1、 一种多肽， 其特征在于， 其具有（1 )、 （Π )所示的氨基酸序列中任 意一个：
( I ) 具有 SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列；
( II ) 具有 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经修饰、 取代、 缺失或添加一 个或几个氨基酸获得的氨基酸序列。
2、根据权利要求 1所述的多肽， 其特征在于， 所述修饰包括酰胺化、 磷酸化、 曱基化、 乙酰化、 泛素化、 糖基化或叛基化。
3、根据权利要求 1所述的多肽， 其特征在于， 所述取代为取代 1个、 2个、 3个、 4个或 5个氨基酸。
4、根据权利要求 1所述的多肽， 其特征在于， 所述缺失为缺失 1个、 2个、 3个、 4个或 5个氨基酸。
5、根据权利要求 1所述的多肽， 其特征在于， 所述添加为添加 1个、 2个、 3个、 4个、 5个、 6个、 7个、 8个、 9个或 10个氨基酸。
6、根据权利要求 1所述的多肽，其特征在于，其不具有 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:53或 SEQ ID NO:54所述的氨 基酸序列。
7、根据权利要求 1所述的多肽， 其特征在于， 其具有 SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:22 ~ SEQ ID NO:29、 SEQ ID NO:32、 SEQ ID NO:36 ~ SEQ ID NO:45或 SEQ ID NO:52中任意一个所示的氨基酸序列。
8、 根据权利要求 1至 7任一项所述的多肽在制备抗菌剂中的应用。
9、根据权利要求 8所述的应用， 其特征在于， 所述抗菌剂抑制细菌。
10、根据权利要求 9所述的应用， 其特征在于， 所述细菌为革兰氏阳 性菌和 /或革兰氏阴性菌。
11、 根据权利要求 10所述的应用， 其特征在于， 所述革兰氏阳性菌 为葡萄球菌属、 链球菌属、 肠球菌属、 分枝杆菌属、 厌氧细菌或棒状杆菌 属。
12、 根据权利要求 10所述的应用， 其特征在于， 所述革兰氏阴性菌 为奈瑟菌属、 肠道杆菌科、假单胞菌属、 不动杆菌属、 鲍特菌属或嗜血杆 菌属。
13、 根据权利要求 1至 7任一项所述的多肽在制备预防和 /或治疗细 菌感染疾病和 /或湿疹的药物中的应用。
14、 根据权利要求 13所述的应用， 其特征在于， 所述细菌为革兰氏 阳性菌和 /或革兰氏阴性菌。
15、 根据权利要求 13所述的应用， 其特征在于， 所述革兰氏阳性菌 为葡萄球菌属、 链球菌属、 肠球菌属、 分枝杆菌属、 厌氧细菌或棒状杆菌 属。
16、 根据权利要求 13所述的应用， 其特征在于， 所述革兰氏阴性菌 为奈瑟菌属、 肠道杆菌科、假单胞菌属、 不动杆菌属、 鲍特菌属或嗜血杆 菌属。
17、 根据权利要求 13所述的应用， 其特征在于， 所述感染为非特异 性感染和 /或特异性感染。
18、 根据权利要求 13所述的应用， 其特征在于， 所述非特异性感染 为疖、 痈、 丹毒、 急性淋巴管炎、 急性淋巴结炎、 曱沟炎、 脓性指头炎、 手指侧化脓性腱鞘炎、 滑嚢炎、 掌深间隙感染、 脓血症、 菌血症。
19、 根据权利要求 13所述的应用， 其特征在于， 所述特异性感染为 结核、破伤风、 气性坏疽、 炭疽、 百日咳、 流行性脑脊髓炎、淋病、 伤寒、 细菌性痢疾或白喉。
20、根据权利要求 13所述的应用， 其特征在于， 所述感染为 MRSA、 MRCNS、 耐红霉素化脓性链球菌、 产 ESBLs大肠埃希菌、 铜绿假单胞菌 亚胺培南耐药株引起的感染；
或所述感染为金黄色葡萄球菌引起的局部感染、全身感染或毒素性疾 病；
或所述感染为凝固酶阴性葡萄球菌引起的泌尿系统感染、败血症或术 后感染；
或所述感染为链球菌引起的化脓性炎症、 风湿热与急性肾小球肾炎、 猩红热、 细菌性肺炎、 龋齿、 亚急性细菌性心内膜炎或新生儿感染； 或所述感染为肺炎链球菌引起的大叶性肺炎、 气管炎、 中耳炎、脑膜 炎、 胸膜炎、 心内膜炎或败血症；
或所述感染为无乳链球菌引起的孕妇产褥期脓毒血症、 新生儿脑膜 炎、 产后感染、 菌血症、 心内膜炎、 皮肤和软组织感染或骨髓炎；
或所述感染为肠球菌引起的心血管系统感染或尿路感染；
或所述感染为屎肠球菌引起的尿路感染、 化脓性腹部感染、 败血症、 心内膜炎或腹泻发烧；
或所述感染为粪肠球菌引起的心内膜炎， 胆嚢炎， 脑膜炎，尿路感染 或伤口感染；
或所述感染为脑膜炎奈瑟菌引起的流行性脑脊髓炎；
或所述感染为淋病奈瑟菌引起的淋病；
或所述感染为埃希菌引起的泌尿系统感染、肠道外的化脓性感染、肠 道感染或出血性结肠炎；
或所述感染为志贺氏菌引起的细菌性痢疾；
或所述感染为沙门菌引起的伤寒与副伤寒；
或所述感染为肺炎克雷伯菌引起的肺炎、支气管炎泌尿道感染、创伤 感染、 脑膜炎或腹膜炎；
或所述感染为产酸克雷伯菌引起的抗生素相关性出血性结肠炎； 或所述感染为枸橼酸杆菌引起的肺炎或脑膜炎；
或所述感染为阴沟肠杆菌引起的皮肤软组织感染、泌尿道感染、呼吸 道感染、 腹部感染、 中枢神经系统感染、 眼部感染、 伤口感染、 心内膜炎 或败血症；
或所述感染为沙雷菌引起的肺炎、泌尿道感染、菌血症或手术后感染； 或所述感染为破伤风梭菌引起的破伤风；
或所述感染为产气荚膜梭菌引起的气性坏疽或食物中毒；
或所述感染为无芽孢厌氧菌引起的腹部感染、女性生殖道、盆腔感染 或菌血症；
或所述感染为白喉棒状杆菌引起的白喉；
或所述感染为痤疮棒状杆菌引起的痤疮、 粉刺； 或所述感染为铜绿假单胞菌引起的伤口感染、烧伤组织感染、肺部感 染、 泌尿道感染、 中耳炎、 角膜炎、 心膜炎或败血症；
或所述感染为鲍曼不动杆菌引起的呼吸道感染、菌血症、泌尿系感染、 继发性脑膜炎、 手术部位感染或呼吸机相关性肺炎；
或所述感染为百日咳鲍特菌引起的百曰咳；
或所述感染为流感嗜血杆菌等嗜血杆菌属细菌引起的婴儿及孩童菌 血病症、 急性细菌性脑膜炎、 蜂窝组织炎、 骨髓炎或关节感染；
或所述感染为结核分枝杆菌引起的结核病；
或所述感染为慢性难愈合感染创面。
21、 根据权利要求 1至 7任一项所述的多肽在制备促进组织修复和 / 或伤口愈合的药物中的应用。
22、 根据权利要求 1至 7任一项所述的多肽在制备治疗烧伤、 冷伤、 挤压伤、 战创伤、 动物咬伤、 核放射伤或复合伤的药物中的应用。
23、 一种编码如权利要求 1至 7任一项所述的多肽的 DNA分子， 其 特征在于， 其具有 I 、 II所示的核苷酸序列中任意一个：
I 具有 SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
II 具有 SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列经修饰、 取代、 缺失或添加一个 或多个碱基获得的核苷酸序列。
24、 一种重组载体， 其特征在于， 其含有如权利要求 23所述的 DNA 分子。
25、 一种多肽的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤：
获得具有编码如（ I )或（11 )所限定的氨基酸序列的 DNA分子； 取所述 DNA分子与表达载体融合， 构建重组表达载体；
取所述重组表达载体转入宿主细胞， 获得转化体；
诱导所述转化体表达蛋白， 经分离纯化， 即得；
所述的（ I )为： 具有 SEQ ID NO:l所示的氨基酸序列；
所述的（Π )为： 具有 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经修饰、 取代、 缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。
26、 根据权利要求 25所述的制备方法， 其特征在于， 所述 DNA分 子为具有 I 、 II所示的核苷酸序列中任意一个：
I 具有 SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
II 具有 SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列经修饰、 取代、 缺失或添加一个 或多个碱基获得的核苷酸序列。
27、 根据权利要求 26所述的制备方法， 其特征在于， 所述宿主细胞 为原核系统宿主细胞或真核宿主细胞。
28、 根据权利要求 26所述的制备方法， 其特征在于， 所述原核系统 宿主细胞为大肠杆菌。
29、 一种治疗创面感染和 /或促进组织修复愈合的药物制剂， 其特征 在于，由如权利要求 1至 7任一项所述的多肽及药学上可接受的辅料组成。
30、 根据权利要求 29所述的药物制剂， 其特征在于， 所述多肽占所 述药物制剂的质量百分含量为 0.01%~1.5%。
31、 根据权利要求 29所述的药物制剂， 其特征在于， 所述辅料包括 羟丙曱基纤维素，所述羟丙曱基纤维素占所述药物制剂的质量百分含量为 7.0%。
32、 根据权利要求 29所述的药物制剂， 其特征在于， 以重量百分数 计， 其由如权利要求 1至 7任一项所述的多肽 0.01~1.5%、 丙三醇 5%、 羟丙曱基纤维素 7%、 乙醇酸 0.1%、 EDTA0.1%, 余量为水组成。
33、 根据权利要求 29所述的药物制剂， 其特征在于， 其为凝胶剂、 粉针剂、 气雾剂、 喷剂、 擦剂、 膜剂、 贴剂、 膏剂、 软膏剂、 橡胶膏剂、 水剂、 汤剂、 冲剂、 片剂、 丸剂、 緩释剂、 控释剂、 粉剂、 糊剂、 捺剂、 洗剂、 涂膜剂、 离子透入剂、 滴眼剂、 滴鼻剂、含漱剂、 舌下片、 吹入剂、 栓剂、 气雾剂、 吸入剂、 烟剂、 口月良液 、 口服片、 注射液、 糖浆剂、 煎 膏剂、 酒剂、 散剂、 颗粒剂、 丸剂、 片剂、 胶嚢剂、 灌肠剂或栓剂。
34、根据权利要求 1至 7任一项所述的多肽在制备饲料添加剂、保健 品添力。剂、 食品添力。剂、 化妆品添力。剂中的应用。
Description:
多肽、 编码该多肽的 DNA分子、 栽体、 制备方法及应用
本申请要求于 2013 年 07 月 17 日提交中国专利局、 申请号为 .6、 发明名称为 "多肽、 编码该多肽的 DNA分子、 载体、 制备方法及应用"的中国专利申请和 2014年 07月 10 日提交到中国专利 局、 申请号为 .5、 发明名称为 "多肽、 编码该多肽的 DNA 分子、 载体、 制备方法及应用" 的中国专利申请的优先权， 其全部内容通 过引用结合在本申请中。 技术领域
本发明涉及生物技术领域， 特别涉及一种多肽、 编码该多肽的 DNA 分子、 载体、 制备方法及应用。 H
在各类创伤中， 无论是烧伤、 冷伤、 挤压伤、 战创伤、 动物咬伤、 核 放射伤、及复合伤等各类创伤， 还是开放伤或闭合伤的临床治疗中， 防治 感染和促进组织修复和创伤愈合始终是创伤治疗中的永恒的主题。
细菌感染是致病菌或条件致病菌侵入血循环或局部环境中生长繁殖， 产生毒素和其他代谢产物所引起的急性全身性感染或局部感染，临床上以 寒战、 高热、 皮疹、 关节痛及肝脾肿大为特征， 部分可有感染性休克和迁 徙性病灶。 尤其是老人、 儿童、 有慢性病或免疫功能低下者、 治疗不及时 有并发症者， 可发展为败血症或者脓毒血症。
人体感染的致病菌或条件致病菌种类很多，可侵入人体不同部位的组 织器官， 引起局部组织或全身炎症反应及多种病变。
在非特异性的感染中，也就是化脓性感染中，常见的有疖、痈、丹毒、 急性淋巴管炎、 急性淋巴结炎、 曱沟炎、 脓性指头炎、 手指侧化脓性腱鞘 炎、 滑嚢炎、 掌深间隙感染、 脓血症、 菌血症等， 致病菌有金黄色葡萄球 菌、 溶血性链球菌、 大肠埃希菌、 铜绿假单胞菌等， 可由单一病菌导致感 染，也可以由几种细菌共同致病形成混合感染，所以临床用药的广谱性显 得特别重要。
痤疮也是一种非特异性感染， 为青少年常见病、 多发病， 中年亦有发 生。 临床表现为白头痤疮、 黑头痤疮、 炎性丘疹、 继发性脓疮、 嚢肿或结 节、 发痛、 发痒如若感染可留下疤痕， 影响容颜和身心健康。 现己知许多 发病因素及环节在痤疮发生、发展及转归中起关键作用。其中最为重要的 原因是毛嚢及皮脂腺单位中的微生物作用， 首先是厌氧的丙酸痤疮杆菌， 其次为需氧的表皮及金黄色葡萄球菌等优势化脓菌。细菌感染在痤疮的发 生中是重要发病因素。
特异性感染是指结核、 破伤风、 气性坏疽、 炭疽、 百日咳、 流行性脑 脊髓炎、 淋病、 伤寒、 细菌性痢疾、 白喉等是分别由结核杆菌、 破伤风梭 菌、 产气荚膜梭菌、 炭疽杆菌、 百日咳鲍特菌、 脑膜炎奈瑟菌、 淋病奈瑟 菌、 伤寒沙门氏菌、 志贺氏菌、 白喉棒状杆菌引起的独特病变。 特异性感 染在致病菌、病程演变及治疗等方面与一般的感染不同，这是传染病学研 究的主要内容。
促进伤口愈合，是创伤学中与抗感染同样重要的二大问题之一。近年 来，现代细胞生物学和分子生物学研究的介入，及大量的实验观察到了创 伤愈合过程中的细胞活动及其影响因素，认为多种生长因子参与调控创伤 愈合过程， 其可能的机理也十分复杂。
慢性难愈合感染创面，是体表慢性难愈合创面中感染了细菌的创面的 统称。体表慢性难愈合创面， 是一种由系列创伤和疾病所致。发生在体表 的长期未愈合的创面， 主要包括创伤性溃疡、 下肢静脉性溃疡、压迫性溃 疡以及糖尿病溃疡。 由于发生在体表， 且病程长， 外观影响大、 并发症多 及治疗费用极其昂贵等特点， 因此对患者生活和质量产生重大影响，是现 代社会必须面对的重要问题。
在体表慢性难愈合创面中有 87%的创面有细菌感染， 主要为金黄色 葡萄球菌， 铜绿假单胞菌和大肠埃希菌。 由于患者治疗时间长， 其创面细 菌很大部分产生了不同程度的耐药性， 特别是难愈合创面感染 MRSA、 MRCNS、 耐红霉素化脓性链球菌、 产 ESBLs大肠埃希菌、 铜绿假单胞菌 亚胺培南耐药株（IPM-R株)时， 由于临床缺乏有效的治疗药物， 可能会 给病人造成截肢的严重后果。
湿疹（ eczema )是由多种复杂的内、 外因素引起的一种具有多形性皮 损伤和易有渗出倾向的皮肤炎症性反应，病因复杂多难以确定。 自觉症状 瘙痒剧烈。 病情易反复， 并伴有细菌的继发感染， 可迁延多年不愈。
就防治伤口感染而言，常用药物是抗生素，但抗生素滥用所致病原菌 的耐药性已使许多创伤无药可用， 导致病人出现脓血症、 菌血症、 其他器 官严重损伤的全身感染，或在体表形成慢性难愈合感染创面。抗生素耐药 性问题已成为全球关注的焦点。耐药菌另一个危害是可以在不同地区、 国 家之间的人群之间传播。肺炎链球菌是引起细菌性肺炎的常见病源菌，近 年来肺炎链球菌对抗生素耐药性呈上升趋势，并已出现多重耐药菌株，是 临床感染控制中棘手的难题。当前许多抗细菌感染治疗药物大部分疗效不 佳是由于耐药细菌特别是耐曱氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA )感染所导 致。 因此， 急需发现新的抗菌物质。
近年来，生物活性抗菌肽的研究已成为国际药学界抗生素发展的前沿 科学， 目前已经有 1300多种抗菌肽被分离鉴定， 其共同特点为： 分子量 小 （12-100个氨基酸残基）、 多聚阳离子型、 两亲建构。 这些被称为肽类 抗生素的生物活性物质， 因为具有纯生物物质、稳定性强、 抗菌力强、 广 谱、 无抗药耐药性、 无毒副作用和"三致"作用特点， 已被认为是现有抗生 素的最佳替代品。抗菌活性多肽 Ctryamp或其结构同源多肽是从西藏特里 豚蝎获得的天然抗菌肽分子， 由于产生机制、杀菌机制和作用方式与传统 抗生素不同， 可很快杀灭微生物 （包括使用由传统抗生素产生的耐药菌） 而自身不产生耐药性， 且肽水解后的氨基酸有利于皮肤组织的生成。 发明内容
有鉴于此， 本发明提供一种多肽、 编码该多肽的 DNA分子、 载体、 制备方法及应用。该西藏特里豚蝎抗菌活性多肽对革兰氏阳性菌、革兰氏 阴性菌、厌氧菌、 临床耐药病原菌均具有广谱高效抑制作用， 同时能促进 组织修复与创面愈合，可用于制备治疗或预防细菌、厌氧菌特别是耐药细 菌导致的非特异性感染、特异性感染的相关疾病的药物与促进组织修复和 伤口愈合的药物。本发明提供的以广谱抗菌活性多肽为有效成分的预防细 菌感染与促进组织修复的添加剂（如化妆品添加剂、保健品添加剂、饲料 添加剂等）， 用于预防细菌感染与促进组织修复。 预防细菌感染效果好、 促进皮肤组织修复佳、 无副作用。
为了实现上述发明目的， 本发明提供以下技术方案：
本发明提换了一种多肽， 其具有（1 )、 （Π )所示的氨基酸序列中任意 一个： ( I ) 具有 SEQ ID ΝΟ:1所示的氨基酸序列；
( II ) 具有 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经修饰、 取代、 缺失或添 加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列。
本发明公开了一组西藏特里豚蝎 Ctryamp多肽的同源结构多肽，其序 列为 SEQ ID NO: 1 所示的氨基酸序列。 根据 Ctryamp 的成熟肽序列 ( FIRIARLLRIF ), 使用在线 NPS@ server [ DSC 法（Discrimination of protein Secondary structure Class ) ]对其进行二级结构预测， 并利用软件 AHTHEPROT 2000显示其二级结构图像。 结果表明， Ctryamp含有 100% 的 α-Helix结构， 具有典型的两亲性（ amphiphilic ) α-Helix结构， 含有大 量带净正电荷的碱性残基（ Arg )。根据多肽序列的螺旋图，然后对 Ctryamp 多肽序列 FIRIARLLRIF进行大量点突变， 发现 FIXJAX LXglF ( Xj , X2和 X3为 His、 Arg和 Lys的 3个碱性氨基酸中任意一个氨基酸 X SEQ ID ΝΟ:1 )序列并不影响其双亲性的特征（表 1 )。 因此， 本发明提供了一组 西藏特里豚蝎 Ctryamp多肽的同源结构多肽（ SEQ ID ΝΟ:1 )。
在本发明的一些实施例中， 修饰包括酰胺化、磷酸化、 曱基化、 乙酰 化、 泛素化、 糖基化或羰基化。
在本发明的另外一些实施例中，修饰为乙酰化； 具体地， 修饰所得多 肽具有如 SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。
作为优选， 取代为取代 1个、 2个、 3个、 4个或 5个氨基酸。 当取代为 1个时， 不具有如 SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。
更为优选地， 取代所得多肽具有下述氨基酸序列中的任意一个： 具有如 SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；
具有 SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；
具有 SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；
具有 SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列；
具有 SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列；
具有 SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
作为优选， 缺失为缺失 1个、 2个、 3个、 4个或 5个氨基酸。 更为 优选地，缺失为缺失 1个或 2个氨基酸。进一步优选地，当缺失为 1个时， 缺失的氨基酸残基不为第四位或第九位。
更为优选地， 缺失所得多肽具有下述氨基酸序列中的任意一个： 具有 SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列；
具有 SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列；
具有 SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。
作为优选， 添加为添加 1个、 2个、 3个、 4个、 5个、 6个、 7个、 8 个、 9个或 10氨基酸。 当添加为添加在具有 SEQ ID ΝΟ:1所示的氨基酸 序列的多肽的 N端时， 优选为添加 1个、 2个、 3个、 4个或 5个氨基酸。
更为优选地， 添加所得多肽具有下述氨基酸序列中的任意一个： 具有 SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列；
具有 SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列；
具有 SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列；
具有 SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列；
具有 SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列；
具有 SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列；
具有 SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列；
具有 SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列；
具有 SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列； 具有 SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列。
作为优选， 其不具有 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:6或 SEQ ID NO:53或 SEQ ID NO:54所述的氨基酸序列。
作为优选，本发明提供的多肽具有 SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:7 ~ SEQ ID NO:20、 SEQ ID NO : 22 ~ SEQ ID NO:29、 SEQ ID NO:32、 SEQ ID NO:36 ~ SEQ ID NO:45或 SEQ ID NO:52中任意一个所示的氨基酸序列。
本发明具体公开了一种西藏特里豚蝎 Ctryamp多肽， 其序列为 SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。 Ctryamp的前体组织形式编码 68个氨基酸 残基， 由三个部分组成， 即信号肽（23个残基）、 成熟肽（11个残基）和 前体肽（34个残基）。 如图 1所示， cDNA序列下方为推断的对应氨基酸 序列； 信号肽氨基酸以斜体标记； 成熟肽氨基酸为阴影部分氨基酸； 下划 线部分氨基酸为 C端前体肽。 因此， 本发明提供一个西藏特里豚蝎抗菌 肽： FIRIARLLRIF ( SEQ ID NO:2 )。
本发明还提供了多肽在制备抗菌剂中的应用； 多肽具有（1 )、 （Π )所 示的氨基酸序列中任意一个：
( I ) 具有 SEQ ID ΝΟ:1所示的氨基酸序列；
( II ) 具有 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经修饰、 取代、 缺失或添 加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；
其中， 修饰包括酰胺化、 磷酸化、 曱基化、 乙酰化、 泛素化、 糖基化 或羰基化； 取代为取代 1个、 2个、 3个、 4个或 5个氨基酸； 缺失为缺 失 1个、 2个、 3个、 4个或 5个氨基酸； 添加为添加 1个、 2个、 3个、 4个、 5个、 6个、 7个、 8个、 9个或 10氨基酸；且其不具有如 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:53或 SEQ ID NO:54所述的氨 基酸序列。 作为优选， 多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2所示。
在本明的一些实施例中， 抗菌剂用于抑制细菌。
在本发明的一些实施例中，细菌为革兰氏阳性菌和 /或革兰氏阴性菌。 抗菌结果表明合成多肽 Ctryamp及其结构同源多肽对标准的革兰氏 阴性细菌大肠杆菌 CCTCCAB94012 和革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌 CCTCCAB94004 的生长具有高效抑制作用。 在 6.25 g/mL 时， Ctryamp 多肽及其结构同源多肽对大肠杆菌 CCTCCAB94012的抑制率就可以达到 100%, 而在 6.25 g/mL时，对金黄色葡萄球菌 CCTCCAB94004的抑制率 就可以达到 100% (表 2 )。 Ctryamp多肽对革兰氏阴性菌， 特别是致病性 大肠杆菌和铜绿假单胞菌增殖具有高效抑制作用（表 3 ), Ctryamp多肽对 铜铝价担保杆菌的最小抑菌浓度为 8-16 g/mL。 抗菌结果还表明 Ctryamp 多肽对革兰氏阳性细菌的增殖、 厌氧菌的生长具有高效抑制作用 （表 3 )。
在本发明的一些实施例中， 革兰氏阳性菌为葡萄球菌属、 链球菌属、 肠球菌属、 分枝杆菌属、 厌氧细菌或棒状杆菌属。 抗菌结果表明合成 Ctryamp多肽对临床耐药细菌（耐曱氧西林金黄色葡萄球菌、 耐曱氧西林 凝固酶阴性葡萄球菌、耐红霉素化脓性链球菌、耐青霉素类和头孢类， 耐 单酰胺类， 对喹诺酮类、 氨基糖苷类、 磺胺类有交叉耐药的产 ESBLs大 肠埃希菌、 耐亚胺培南的铜绿假单胞菌 （IPM-R株））具有高效抑制作用 (表 3 )。
抗菌结果表明化学合成 Ctryamp多肽对引起特异性感染的细菌（包括 百日咳鲍特菌、 破伤风梭菌、 产气荚膜梭菌、 志贺氏菌、 伤寒沙门菌和白 喉棒状杆菌）具有高效抑制作用 （表 3 )。
在本发明的另一些实施例中，革兰氏阴性菌为奈瑟菌属、肠道杆菌科、 假单胞菌属、 不动杆菌属、 鲍特菌属或嗜血杆菌属。
本发明还提供了多肽在制备预防和 /或治疗细菌感染疾病和 /或湿疹 的药物中的应用； 多肽具有（1 )、 （Π)所示的氨基酸序列中任意一个： ( I ) 具有 SEQ ID ΝΟ:1所示的氨基酸序列；
( II ) 具有 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经修饰、 取代、 缺失或添 加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；
其中， 修饰包括酰胺化、 磷酸化、 曱基化、 乙酰化、 泛素化、 糖基化 或羰基化； 取代为取代 1个、 2个、 3个、 4个或 5个氨基酸； 缺失为缺 失 1个、 2个、 3个、 4个或 5个氨基酸； 添加为添加 1个、 2个、 3个、 4个、 5个、 6个、 7个、 8个、 9个或 10氨基酸；且其不具有如 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO: 5,、 SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:53或 SEQ ID NO:54所述的氨 基酸序列。 作为优选， 多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2所示。
在本发明的一些实施例中， 多肽在制备预防和 /或治疗细菌感染疾病 和 /或湿疹的药物中的应用中细菌为革兰氏阳性菌和 /或革兰氏阴性菌。
在本发明的一些实施例中， 多肽在制备预防和 /或治疗细菌感染疾病 和 /或湿疹的药物中的应用中革兰氏阳性菌为葡萄球菌属、 链球菌属、 肠 球菌属、 分枝杆菌属、 厌氧细菌或棒状杆菌属。
在本发明的另一些实施例中， 多肽在制备预防和 /或治疗细菌感染疾 病和 /或湿疹的药物中的应用中革兰氏阴性菌为奈瑟菌属、 肠道杆菌科、 假单胞菌属、 不动杆菌属、 鲍特菌属或嗜血杆菌属。
在本发明的一些实施例中， 多肽在制备预防和 /或治疗细菌感染疾病 和 /或湿疹的药物中的应用中感染为非特异性感染和 /或特异性感染。
在本发明的一些实施例中， 多肽在制备预防和 /或治疗细菌感染疾病 和 /或湿疹的药物中的应用中， 非特异性感染为疖、 痈、 丹毒、 急性淋巴 管炎、 急性淋巴结炎、 曱沟炎、 脓性指头炎、 手指侧化脓性腱鞘炎、 滑嚢 炎、 掌深间隙感染、 脓血症、 菌血症。
在本发明的一些实施例中， 多肽在制备预防和 /或治疗细菌感染疾病 和 /或湿疹的药物中的应用中， 特异性感染为结核、 破伤风、 气性坏疽、 炭疽、 百日咳、 流行性脑脊髓炎、 淋病、 伤寒、 细菌性痢疾或白喉。
在本发明的一些实施例中， 感染为 MRSA、 MRCNS、 耐红霉素化脓 性链球菌、产 ESBLs大肠埃希菌、铜绿假单胞菌亚胺培南耐药株（IPM-R 株） 引起的感染。
在本发明的另一些实施例中， 感染为金黄色葡萄球菌引起的局部感 染、 全身感染或毒素性疾病。
在本发明的另一些实施例中，感染为凝固酶阴性葡萄球菌引起的泌尿 系统感染、 败血症或术后感染。
在本发明的另一些实施例中，感染为链球菌引起的化脓性炎症、风湿 热与急性肾小球肾炎、 猩红热、 细菌性肺炎、 龋齿、 亚急性细菌性心内膜 炎或新生儿感染。
在本发明的另一些实施例中， 感染为肺炎链球菌引起的大叶性肺炎、 气管炎、 中耳炎、 脑膜炎、 胸膜炎、 心内膜炎或败血症。
在本发明的另一些实施例中，感染为无乳链球菌引起的孕妇产褥期脓 毒血症、 新生儿脑膜炎、 产后感染、 菌血症、 心内膜炎、 皮肤和软组织感 染或骨髓炎。
在本发明的另一些实施例中 ,感染为肠球菌引起的心血管系统感染或 尿路感染。
在本发明的另一些实施例中，感染为屎肠球菌引起的尿路感染、化脓 性腹部感染、 败血症、 心内膜炎或腹泻发烧。
在本发明的另一些实施例中，感染为粪肠球菌引起的心内膜炎，胆嚢 炎， 脑膜炎， 尿路感染或伤口感染。
在本发明的另一些实施例中 ,感染为脑膜炎奈瑟菌引起的流行性脑脊 髓炎。
在本发明的另一些实施例中， 感染为淋病奈瑟菌引起的淋病。
在本发明的另一些实施例中，感染为埃希菌引起的泌尿系统感染、肠 道外的化脓性感染、 肠道感染或出血性结肠炎。
在本发明的另一些实施例中， 感染为志贺氏菌引起的细菌性痢疾。 在本发明的另一些实施例中， 感染为沙门菌引起的伤寒与副伤寒。 在本发明的另一些实施例中，感染为肺炎克雷伯菌引起的肺炎、支气 管炎泌尿道感染、 创伤感染、 脑膜炎或腹膜炎。
在本发明的另一些实施例中，感染为产酸克雷伯菌引起的抗生素相关 性出血性结肠炎。
在本发明的另一些实施例中， 感染为枸橼酸杆菌引起的肺炎或脑膜 炎；
在本发明的另一些实施例中，感染为阴沟肠杆菌引起的皮肤软组织感 染、泌尿道感染、呼吸道感染、腹部感染、 中枢神经系统感染、 眼部感染、 伤口感染、 心内膜炎或败血症； 在本发明的另一些实施例中，感染为沙雷菌引起的肺炎、泌尿道感染、 菌血症或手术后感染。
在本发明的另一些实施例中， 感染为破伤风梭菌引起的破伤风。 在本发明的另一些实施例中，感染为产气荚膜梭菌引起的气性坏疽或 食物中毒等临床感染。
在本发明的另一些实施例中， 感染为无芽孢厌氧菌引起的腹部感染、 女性生殖道、 盆腔感染或菌血症。
在本发明的另一些实施例中， 感染为白喉棒状杆菌引起的白喉。 在本发明的另一些实施例中，感染为痤疮棒状杆菌引起的痤疮、粉刺。 在本发明的另一些实施例中， 感染为铜绿假单胞菌引起的伤口感染、 烧伤组织感染等局部化脓性感染、 肺部感染、 泌尿道感染、 中耳炎、 角膜 炎、 心膜炎或败血症。
在本发明的另一些实施例中， 感染为鲍曼不动杆菌引起的呼吸道感 染、 菌血症、 泌尿系感染、 继发性脑膜炎、 手术部位感染或呼吸机相关性 肺炎。
在本发明的另一些实施例中， 感染为百曰咳鲍特菌引起的百曰咳。 在本发明的另一些实施例中，感染为流感嗜血杆菌等嗜血杆菌属细菌 引起的婴儿及孩童菌血病症、 急性细菌性脑膜炎、蜂窝组织炎、 骨髓炎或 关节感染。
在本发明的另一些实施例中， 感染为结核分枝杆菌引起的结核病。 在本发明的另一些实施例中， 感染为慢性难愈合感染创面。
在本发明的另一些实施例中， 多肽在制备预防和 /或治疗湿疹的药物 中的应用。
本发明还提供了多肽在制备促进组织修复和 /或伤口愈合的药物中的 应用； 多肽具有（1 )、 （Π )所示的氨基酸序列中任意一个：
( I ) 具有 SEQ ID ΝΟ:1所示的氨基酸序列；
( II ) 具有 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经修饰、 取代、 缺失或添 加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列； 其中， 修饰包括酰胺化、 磷酸化、 曱基化、 乙酰化、 泛素化、 糖基化 或羰基化； 取代为取代 1个、 2个、 3个、 4个或 5个氨基酸； 缺失为缺 失 1个、 2个、 3个、 4个或 5个氨基酸； 添加为添加 1个、 2个、 3个、 4个、 5个、 6个、 7个、 8个、 9个或 10氨基酸；且其不具有如 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:53或 SEQ ID NO:54所述的氨 基酸序列。 作为优选， 多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2所示。
本发明还提供了多肽在制备治疗烧伤、 冷伤、 挤压伤、 战创伤、 动物 咬伤、 核放射伤或复合伤的药物中的应用； 多肽具有（1 )、 （Π )所示的氨 基酸序列中任意一个：
( I ) 具有 SEQ ID ΝΟ:1所示的氨基酸序列；
( II ) 具有 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经修饰、 取代、 缺失或添 加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；
其中， 修饰包括酰胺化、 磷酸化、 曱基化、 乙酰化、 泛素化、 糖基化 或羰基化； 取代为取代 1个、 2个、 3个、 4个或 5个氨基酸； 缺失为缺 失 1个、 2个、 3个、 4个或 5个氨基酸； 添加为添加 1个、 2个、 3个、 4个、 5个、 6个、 7个、 8个、 9个或 10氨基酸；且其不具有如 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:53或 SEQ ID NO:54所述的氨 基酸序列。 作为优选， 多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2所示。
本发明还提供了一种编码上述多肽的 DNA分子， 其具有 I 、 II所示 的核苷酸序列中任意一个：
I 具有 SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
II 具有 SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列经修饰、 取代、 缺失或添加 一个或多个碱基获得的核苷酸序列。
本发明构建高质量西藏特里豚蝎毒腺组织 cDNA文库， 具体包括蝎 毒腺总 RNA的分离和 mRNA纯化 , cDNA的第一链和第二链合成 , 双链 cDNA与 pSPORTl载体的连接和转化， 获得蝎毒腺组织 cDNA文库。 在 构建文库的基础上，随机挑选 3000克隆子进行测序，序列分析发现第 2007 克隆子为一个新的西藏特里豚蝎抗菌肽基因， 命名为 Ctryamp, 其序列为 SEQ ID NO:3 所 示 的 核 苷 酸 序 列 ： ttcctctgtgaaagtaagttctgtgaaactcactcttcgataaaatgaaatctcagacctttttccttctttttctagttgt tttattattagcaatttcacaatcagaagcttttatcaggatcgccaggctcctcaggatctttggaaaaagaagtat gagagatatggatactatgaaatacttatatgaaccaagtttgagtgcagctgacttgaaaaccttacaaaaacta atggaaaattactgattatttgaatataataatgttatctctattttagattataaatatttcttttgaaaaaaaaaaaaaa aaaaaaa (图 1 )。
本发明还提供了一种重组载体， 其含有上述 DNA分子。
本发明还提供了一种多肽的制备方法， 包括以下步骤：
获得具有编码如（ I )或（11 )所限定的氨基酸序列的 DNA分子； 取 DNA分子与表达载体融合， 构建重组表达载体；
取重组表达载体转入宿主细胞， 获得转化体；
诱导转化体表达蛋白， 经分离纯化， 即得；
其中（ I )为： 具有 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；
( Π )为： 具有 SEQ ID NO: l所示的氨基酸序列经修饰、 取代、 缺失或 添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。
在本发明的一些实施例中， 多肽的制备方法中 DNA分子为具有 I、 II所示的核苷酸序列中任意一个：
I 具有 SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
II 具有 SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列经修饰、 取代、 缺失或添加 一个或多个碱基获得的核苷酸序列。
在本发明的一些实施例中，宿主细胞为原核系统宿主细胞或真核宿主 细胞。
作为优选， 原核系统宿主细胞为大肠杆菌。
本发明还提供了一种治疗创面感染和 /或促进组织修复愈合的药物制 剂， 由多肽及药学上可接受的辅料组成； 其中， 多肽具有（1 )、 （Π )所示 的氨基酸序列中任意一个：
( I ) 具有 SEQ ID ΝΟ: 1所示的氨基酸序列；
( II ) 具有 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经修饰、 取代、 缺失或添 加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；
其中， 修饰包括酰胺化、 磷酸化、 曱基化、 乙酰化、 泛素化、 糖基化 或羰基化； 取代为取代 1个、 2个、 3个、 4个或 5个氨基酸； 缺失为缺 失 1个、 2个、 3个、 4个或 5个氨基酸； 添加为添加 1个、 2个、 3个、 4个、 5个、 6个、 7个、 8个、 9个或 10氨基酸；且其不具有如 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:53或 SEQ ID NO:54所述的氨 基酸序列。 作为优选， 多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2所示。 在本发 明的一些实施例中， 多肽占药物制剂的质量百分含量为 0.01%~1.5%。
在本发明的一些实施例中，辅料包括羟丙曱基纤维素，羟丙曱基纤维 素占所述药物制剂的质量百分含量为 7.0%。
作为优选， 以重量百分数计， 本发明提供的药物制剂由多肽 0.01-1.5%, 丙三醇 5%、 羟丙曱基纤维素 7%、 乙醇酸 0.1%、 EDTA0.1%, 余量为水组成。
作为优选，本发明提供的药物制剂为凝胶剂、粉针剂、气雾剂、喷剂、 擦剂、 膜剂、 贴剂、 膏剂、 软膏剂、 橡胶膏剂、 水剂、 汤剂、 冲剂、 片剂、 丸剂、 緩释剂、 控释剂、 粉剂、 糊剂、 捺剂、 洗剂、 涂膜剂、 离子透入 剂、 滴眼剂、 滴鼻剂、 含漱剂、 舌下片、 吹入剂、 栓剂、 气雾剂、 吸入 剂、 烟剂、 口服液 、 口服片、 注射液、 糖浆剂、 煎膏剂、 酒剂、 散剂、 颗粒剂、 丸剂、 片剂、 胶嚢剂、 灌肠剂或栓剂。
本发明还提拱了多肽在制备饲料添加剂、保健品添加剂、食品添加剂、 化妆品添加剂中的应用； 多肽具有（1 )、 （Π )所示的氨基酸序列中任意一 个：
( I ) 具有 SEQ ID ΝΟ:1所示的氨基酸序列；
( II ) 具有 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经修饰、 取代、 缺失或添 加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；
其中， 修饰包括酰胺化、 磷酸化、 曱基化、 乙酰化、 泛素化、 糖基化 或羰基化； 取代为取代 1个、 2个、 3个、 4个或 5个氨基酸； 缺失为缺 失 1个、 2个、 3个、 4个或 5个氨基酸； 添加为添加 1个、 2个、 3个、 4个、 5个、 6个、 7个、 8个、 9个或 10氨基酸；且其不具有如 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:53或 SEQ ID NO:54所述的氨 基酸序列。 作为优选， 多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2所示。
本发明提换了一种多肽， 其具有（1 )、 （Π )所示的氨基酸序列中任意 一个：
( I ) 具有 SEQ ID ΝΟ:1所示的氨基酸序列；
( II ) 具有 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经修饰、 取代、 缺失或添 加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列。抗菌结果表明合成多肽 Ctryamp 及其结构同源多肽对标准的革兰氏阴性细菌大肠杆菌 CCTCCAB94012和 革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌 CCTCCAB94014 的生长具有高效抑制 作用。 在 6.25 g/mL 时， Ctryamp 多肽及其结构同源多肽对大肠杆菌 CCTCCAB94012的抑制率就可以达到 100%, 而在 6.25 g/mL时，对金黄 色葡萄球菌 CCTCCAB94014的抑制率就可以达到 100%。 进一步抗菌结 果表明合成 Ctryamp多肽对革兰氏阴性菌，特别是致病性大肠杆菌和铜绿 假单胞菌增殖具有高效抑制作用（表 3 ), Ctryamp多肽对铜绿假单胞菌的 最小抑菌浓度为 8-16 g/mL。抗菌结果还表明化学合成 Ctryamp多肽对革 兰氏阳性细菌的增殖具有高效抑制作用 （表 3 )。 抗菌结果表明化学合成 Ctryamp多肽对厌氧菌的生长具有高效抑制作用 （表 3 )。 Ctryamp多肽对 临床耐药细菌（耐曱氧西林金黄色葡萄球菌、耐曱氧西林凝固酶阴性葡萄 球菌、 耐红霉素化脓性链球菌、 耐青霉素类和头孢类， 耐单酰胺类， 对喹 诺酮类、 氨基糖苷类、 磺胺类有交叉耐药的产 ESBLs大肠埃希菌、 耐亚 胺培南的铜绿假单胞菌 （IPM-R株））具有高效抑制作用（表 3 )。 Ctryamp 多肽对引起特异性感染的细菌（包括百日咳鲍特菌、破伤风梭菌、产气荚 膜梭菌、 志贺氏菌、 伤寒沙门菌和白喉棒状杆菌）具有高效抑制作用 （表 3 )。
本发明还提供了外用凝胶抗菌制剂。抗菌结果表明其抗菌制剂对革兰 氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、厌氧菌、及临床耐药细菌具有高效抑制作 用。 其对标准的革兰氏阴性细菌大肠杆菌 CCTCCAB94012的最小抑菌浓 度 MIC 为 6.25 g/mL , 对革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌 CCTCCAB94004的最小抑菌浓度 MIC为 6.25 g/mL, 对耐曱氧西林金黄 色葡萄球菌（MRSA )最小抑菌浓度 MIC为 6.25 g/mL、对铜绿假单孢菌 的最小抑菌浓度 MIC为 8 g/ mL、 对产气荚膜梭菌最小抑菌浓度 MIC为 25 g/ mL (表 4 ) (按照制剂中有效成分抗菌多肽 Ctryamp多肽或其结构 同源多肽计算）。
选用来医院治疗的各种外伤患者、体表慢性难愈合感染创面病人，所 有病人随机分为实验组和对照组。实验组用制备的外用 Ctryamp多肽抗菌 凝胶制剂， 对照组常规用药 （给予 5%的硫横霜）。 对于创面细菌感染， 治疗组 82例患者创面均一期愈合， 未出现感染及创面延迟愈合， 未出现 过敏反应及其他不良反应。 根据卫生部 1988年颁布的抗菌药物临床试验 技术标准分为四级： 痊愈、 显效， 有效， 无效。 结果治疗组 82例中显效 80例，有效 2例，有效率 100% 。对照组 74例中显效 50例，有效 20例， 无效 4例， 有效率 95%, 两组经统计学 F检验， p & 0.05。 两组促进创面 愈合时间比较见表 5, 经过统计学 F检验， p & 0.05。 临床治疗结果表明， 本发明提供的外用凝胶能有效的预防和治疗细菌感染， 特别对 MRSA和 铜绿假单胞菌亚胺培南耐药株（IPM-R株）有独特的杀菌作用， 同时能 显著的促进伤口的修复愈合。
痤疮治疗的临床观察， 选择痤疮、 青春痘、 粉刺患者 258例为对象， 记录实验组（用 Ctryamp多肽外用抗菌凝胶制剂治疗）、 对照组两组患者 面部痤疮皮损数目、变化和不良反应。按痤疮各种损害（粉刺、炎性疤疹、 脓疮、 结节、 嚢肿）减少的总百分率统计疗效。 抗痤疮丙酸杆菌的抗菌制 剂实验组有效率达到 97%。 而常规用药对照组有效率为 41%。 两组疗效 差异有高度显著性， 说明实验组对治疗痤疮疗效优于对照组。
湖北省人民医院烧伤整形外科用本发明的 Ctryamp 多肽外用抗菌凝 胶制剂抗治疗了 22例慢性湿疹患者， 实验结果显示， 蝎肽抗菌凝胶对湿 疹有独特的疗效， 治愈率 100%, 临床随访无复发， 而实验组临床症状减 轻， 但随访复发严重。 本发明还提供了以传统中药材蝎的活性多肽为有效成分配制的更为 有效的治疗创面细菌感染和痤疮、湿疹的新药剂，用于治疗创面细菌感染、 体表慢性难愈合感染创面、 痤疮、 湿疹与促进组织修复和伤口愈合， 治疗 效果显著。 本发明也涉及了一种预防细菌感染与促进组织修复的添加剂， 用于制备预防细菌感染与促进组织修复的化妆品、保健品、饲料等，预防 细菌感染与促进皮肤组织修复效果显著。本发明所釆用的原料均为传统中 药材蝎的活性成分， 无毒副作用， 不留后遗症。 此药物或者添加剂能够真 正达到见效快、 无副作用、 治愈后不复发的效果。 附图说明
图 1示本发明提供的西藏特里豚蝎广谱抗菌活性多肽 Ctryamp基因及 其氨基酸序列；
图 2西藏特里豚蝎广谱抗菌活性多肽 Ctryamp的纯度；
图 3西藏特里豚蝎广谱抗菌活性多肽 Ctryamp质谱。 具体实施方式
本发明公开了一种多肽、 编码该多肽的 DNA分子、 载体、 制备方法 及应用， 本领域技术人员可以借鉴本文内容， 适当改进工艺参数实现。 特 别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易 见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实 施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对 本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合 ,来实现和应用本发明 技术。
下面结合实施例， 进一步阐述本发明： 实施例 1 西藏特里豚蝎广语抗菌活性多肽基因的制备
A: 西藏特里豚蝎毒腺总 RNA的提取 ( Trizol LS—步法： Trizol LS 购自美国 Invitrogen ) ①取 500mg的蝎尾腺在液氮中研成细粉末，加入 10mL TRIZOL试剂 混匀， 室温 (20-25°C , 以下相同）放置 5分钟； ②然后加入 2mL氯仿混合 15秒， 室温放置 2-3分钟， 4°C下 12000g离心 15分钟； ③取水相加 1倍 体积异丙醇，室温放置 10分钟， 4°C下 12000g离心 10分钟得 RNA沉淀； ④沉淀用 5ml75 %乙醇洗涤， 7500g离心 5分钟； ⑤ RNA沉淀干燥后溶 于 DEPC处理水， 55-60°C保温 10分钟以彻底溶解 RNA。 整个过程参照 TRlZOL(Total RNA Isolation)Reagent Kit推荐方法进行。 制备的蝎毒腺总 RNA釆用曱醛变性凝胶电泳检测其质量。得到了高质量的蝎毒腺总 RNA。 B: mRNA的分离纯化
釆用 PolyA Tract mRNA 分离系统 （ Promega, USA ) 分离和纯化 mRNA, 其工作原理是基于 Oligo (dT)与 mRNA 3'端 poly(A)尾的互补配 对特性， 用生物素标记 Oligo (dT), 通过它与 mRNA 3'端 poly(A)的退火 形成杂交体， 然后用标有亲合素的磁珠和磁性分离架捕获并洗涤生物素 Oligo (dT)/mRNA杂交体， 最后用无 RNA酶的灭菌双蒸水（ dd 3/4 0 )将 之洗脱下来， 达到从总 RNA中分离 mRNA的目的。 ①样品的制备： 将 RNA加入到含有 32μ β-巯基乙醇的 800μ 的结合緩冲液中。②探针的退 火： 取 250ρΜ浓度 Oligo(dT) 5μ , 加蒸馏水至 5(^L; 加入 1.6mL预热 的 dilution buffer ( dilution buffer已加入 32 L β -巯基乙醇）， 与 RNA混 匀， 70°C温育 5分钟。 ③磁珠的活化： 取 1.2mL的磁珠 SA-PMPS (购自美 Promega)于 1.5mL的离心管中； 用 0.5xSSC重悬 SA-PMPS, 以磁架吸附 磁珠， 原体积 0.5xSSC洗涤 SA-PMPS3次。 ④ mRNA的获取： 将 70°C温 育的 RNA与 SA-PMPS混合， 室温放置 5分钟放磁架上吸附磁珠， 弃上 清液； 2mL的 0.5XSSC悬浮磁珠，洗涤重复 2次，最后一次尽量去除 SSC; 加入无 RNA酶的 dd 3/4 0至磁珠中， 轻轻混匀， 然后离心 （ 12000gx3分 钟）或磁架吸附磁珠； 取上清， 获得 mRNA。通过电泳和紫外测定 mRNA 的浓度和纯度。 ⑤ mRNA的沉淀： 将④获得的 mRNA中加入糖原和 2.5 倍体积的无水乙醇， 沉淀过夜， mRNA将用于 cDNA的合成。 C: 第一链 cDNA合成
①在 1.5mL E 管中力口入 2μΙ Not I Primer-adapter和 mRNA (含 3 gmRNA), 70°C温育 lOmin, 迅速放于水上， 离心后， 加入下列成分： Ι, 5Χ 2 L0.1MDTT; \μΙ lOmMdNTPs; l LH20。 轻轻混匀后离心， 37°C放至 2 ②加入 5 L逆转录酶， 混匀后取 2 L, 加 l L [a-32P]dCTP ( 4μα ) (示踪管）。 与上述反应组分（样品管） 同时 37°C温育 lh, 然后放入水上终止反应； ③对于示踪管， 依次加入 43 L20 mM EDTA和 5 L酵母 tRNA, 混匀后， 分别取两份 ΙΟμΙ^点于两张滤膜 上， 1份用 10% TCA洗 3次，每次 5min, 95%乙醇洗 1次， 空气干燥后， 放入 1.5mL闪烁液中 （为 1 #样品）； 另 1份空气干燥后， 放入 1.5mL闪 烁液（为 2 #样品）。 另 30μ 示踪液， 加 1.5 L 7.5M 醋酸氨 ( NH4Oac ) 和 9(^L无水乙醇（ -20 °C ), 混匀后立即 14,000rpm离心 20min, 弃上清， 加入 0.5mL70%无水乙醇（-20°C ), 14,000rpm离心 2min, 弃上清， 37°C 干燥 1 Omin让乙醇挥发， 溶于 1 ( L TEN溶液 ,加入 1 ΟμΙ^ 2Χ加样緩冲液 , 取 ΙΟμ 用于碱性凝胶电泳。 用 [a-32P]dCTP标记 λ?ΝΑ HindlU片段作分 子量标记； ④混匀后室温下放置 15min,加入 2 L 0.2 M EDTA终止反应。 取 6 L反应液和 6mL 2X碱性电泳緩冲液混匀， 电泳 5h后， 用 7% TCA 浸泡 20min, 直至溴酚兰变黄。 然后用卫生纸吸干 （ 8h左右）， 进行放射 自显影； ⑤对于样品管， 用于第二链的合成。
ffind III 10X buffer 2 L dGTP 0.2mM dATP 0.2mM
[a-32P]dCTP 2μΟ?
Hind III markers l g
Klenow DNA polymerase 2 unit 补 dd 3/4 0至总体积 20μ D: 第二链 cDNA合成
①水上在样品管中依次加入下列成分； ②轻轻混勾后， 16°C温育 2h; ③加入 2 L ( lOunits ) T4DNA聚合酶， 继续 16°C反应 5 ④转入水上， 加入 1( L 0.5 M EDTA;⑤加入等体积（ \50μΙ )酚/氯仿 /异戊醇（ 25/24/1 ), 彻底涡旋后， 室温下 14,000rpm 离心 5min。 将水相 （ 140μ )转入另一 1.5mL E 管； ⑥加入 70μ 的 7.5MNH4OAc和 0.5mL无水乙醇（ -20 °C ), 涡旋后， 室温下 14,000rpm离心 20 ⑦弃上清， 加入 0.5mL70%乙醇 (-20°C ), 同上离心 2min。 弃上清， 37°C干燥 10min。
DEPC-treated water 92μ
5X second strand buffer 30μ
lOmMdNTP mix μL·
E.coli DNA ligase (lOunits/ L) \μL
E.coli DNA polymerase (lOunits^L)
总体积 15(^L
E: 双链 cDNA与 Sal I衔接头的连接
①用 25 L灭菌水溶解实 D的 cDNA样品，然后按下表依次加入；② 轻轻混匀， 16°C反应过夜（约 20h )。 ③用酚 /氯仿 /异戊醇（ 25/24/1 )抽提 和 NH4Oac/乙醇沉淀后， 37 °C干燥 10min。
5X T4DNA ligase buffer ΙΟμΙ,
Sal I adapters lO L
T4DNA ligase 5μ?_ 总体积 5(^L
F: Noil消化双链 cDNA ①将 E的样品溶于 41 L, 然后按下表依次加入； ②混匀后， 37 °C温 育 2h; ③用酚 /氯仿 /异戊醇（25/24/1 )抽提一次， 然后用 7.5M NH4Oac/ 乙醇沉淀， 37 °C干燥 10min。 ④溶于 70μΙ^ ΤΕΝ, 取 ΙμΙ^用于定量， 其余 -20 °C保存备用。
REACT 3 buffer
总体积 50μΙ G: 去除双链 cDNA分子中的过量 / 1衔接头和酶切小片段 用 nucleon extraction and purification kit (Amersham, USA)去除过量 / I衔接头和酶切小片段。 ①室温下悬浮树脂， 然后取 600μ 加于离心 柱中， 2 000 rpm离心 10s , 去掉液体。 在树脂中央加入 40μ 上述 cDNA 溶液。 同上离心； ②收集洗脱液用于连接反应。
H: 双链 cDNA与 pSPORTl载体的连接和转化
①在 1.5mL Ep管中依次加入下列成分； ②室温下反应 16h; ③在② 反应液中依次加入下列成分： 5.0μ yeast tRNA, 12.5 L 7.5 M NH40ac, 70μ 无水乙醇（-20 °C )。 涡旋混匀后立即 14000离心 20 ④沉淀用 70%乙醇（-20 °C )洗涤， 37 °C干燥后溶于 4 L; ⑤取 2 L电击转化 50μ E.coli K12 MC1061。 用 PCR 方法鉴定文库的质量， 正向引物： 5 ' TCGACCCACGCGTCCG 3' (按 Sail衔接头序列设计）； 反向引物： 5 ' GAGCGGCCGCCCT 15 3， （按 Notl引物 -衔接头的序列设计）。
5X T4 DNA ligase buffer 4 L pSPORT 1 , Not I-Sal I-Cut (50ng L) 1 i
cDNA(3ng L) \i
T4DNA ligase
补 dd 3/4 0至总体积 2(^L I： 随机测序策略筛选 cDNA文库
随机从构建好的西藏特里豚蝎毒腺 cDNA文库中挑选 3000克隆子， 送上海三博公司测序。 序列录入软件为 BioEdit v4.5.8 (Tom Hall, 1999), 同源性比较和信号肽切割位点预测软件分别为 CLUSTAL X 1.8 (Thompson et al., 1997)和 PC/GENE (Intelligenetics Inc., Switzerland)。序歹1 J 分析表明克隆子 2007为一个全新的抗菌肽基因， 命名为 Ctryamp。 其序 列 为 SEQ ID NO:3 所 示 的 核 苷 酸 序 列 ： ttcctctgtgaaagtaagttctgtgaaactcactcttcgataaaatgaaatctcagacctttttccttctttttctagttgt tttattattagcaatttcacaatcagaagcttttatcaggatcgccaggctcctcaggatctttggaaaaagaagtat gagagatatggatactatgaaatacttatatgaaccaagtttgagtgcagctgacttgaaaaccttacaaaaacta atggaaaattactgattatttgaatataataatgttatctctattttagattataaatatttcttttgaaaaaaaaaaaaaa aaaaaaa (图 1 )。 Ctryam 的的前体组织形式编码 68个氨基酸残基， 由三 个部分组成， 即信号肽（ 23个残基）、 成熟肽（ 11个残基）和前体肽（ 34 个残基）。因此，本发明提供一个西藏特里豚蝎抗菌肽： FIRIARLLRIF( SEQ ID NO:2 )。 实施例 2 Ctryamp多肽的结构分析及其同源结构双亲性多肽
根据实施例 1提供的 SEQ ID NO:2所示的 Ctryamp的成熟肽序列 ( FIRIARLLRIF ), 使用在线 NPS@ server [ DSC 法（Discrimination of protein Secondary structure Class ) ]对其进行二级结构预测， 并利用软件 AHTHEPROT 2000显示其二级结构图像。 结果表明， Ctryamp含有 100% 的 α-Helix结构， 具有典型的两亲性（ amphiphilic ) α-Helix结构， 含有大 量带净正电荷的碱性残基（ Arg )。根据多肽序列的螺旋图，然后对 Ctryamp 多肽序列 FIRIARLLRIF进行大量点突变， 发现 FIX1IAX2LLX3IF ( XI , X2和 X3为 His、 Arg和 Lys的 3个碱性氨基酸中任意一个氨基酸 ) ( SEQ ID ΝΟ: 1 )序列并不影响其双亲性的特征（表 1 )。 因此， 本发明提供了一 组西藏特里豚蝎 Ctryamp多肽的同源结构多肽（ SEQ ID NO: 1 )。 表 1 西藏特里豚蝎 Ctryamp多肽及其结构同源多肽
多肽名称 ^列 序列表中的位置 突变性质 A螺旋值 Ctryamp FIRIARLLRIF SEQ ID NO:2 野生型 100% Ctryamp-R3K FIKIARLLRIF SEQ ID NO:7 碱性 100% Ctryamp-R5K FIRIAKLLRIF SEQ ID NO :8 碱性 100% Ctryamp-R9K FIRIARLLKIF SEQ ID NO :9 碱性 100% Ctryamp-R3H FIHIARLLRIF SEQ ID NO: 10 碱性 100% Ctryamp-R5H FIRIAHLLRIF SEQ ID NO: 11 碱性 100% Ctryamp-R9H FIRIARLLHIF SEQ ID NO: 12 碱性 100% Ctryamp- 1 FIKIAKLLRIF SEQ ID NO: 13 碱性 100% Ctryamp-2 FIKIARLLKIF SEQ ID NO: 14 碱性 100% Ctryamp-3 FIRIAKLLKIF SEQ ID NO: 15 碱性 100% Ctryamp-4 FIKIAKLLKIF SEQ ID NO: 16 碱性 100% Ctryamp-5 FIHIAHLLRIF SEQ ID NO: 17 碱性 100% Ctryamp-6 FIHIARLLHIF SEQ ID NO: 18 碱性 100% Ctryamp-7 FIHIAKLLRIF SEQ ID NO: 19 碱性 100% Ctryamp-8 FIRIAKLLHIF SEQ ID NO:20 碱性 100%
实施例 3 多肽及其同源结构双亲性多肽
根据实施例 1提供的 Ctryamp(FIRIARLL i )及异 is
肽的氛基酸序列 (FIXJAXsLLXglF , 实施例 2提供)进行人工合成。 固相化 学合成的办法获得了高纯度的 Ctryamp多肽（如图 2和图 3所示）及其同 源结构双亲性多肽（表 1 )。 实施例 4 Ctryamp多肽及其同源结构双亲性多肽的抑菌试验 对革兰氏阴性菌的抑制试验：
96 孔板培养法： ①分别将铜绿假单胞菌 （包括标准株、 临床分离株 和耐药株）、 大肠埃希菌 （包括标准株 CCTCC AB94012和 ATCC25922、 临床分离株和耐药株）、 肺炎克雷伯菌、 居泉沙雷菌、 鼠伤寒沙门氏菌、 痢疾志贺菌、 鲍曼不动杆菌、 脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、 百日咳鲍特菌 和流感嗜血杆菌培养到 OD600 = 0.8时， 稀释 400倍后取 80μ1加入到 96 孔板中，然后分别向多孔加入 20μ1经等比稀释的实施例 1提供的 Ctryamp 10^ig/ml, ^g/ml, O.^g/mL 阴性对照和阳性对照孔分别加入 20μ1 液体 培养基和 20μ1的卡那霉素 (终浓度为 2(^g/ml); ② 37°C培养 12小时后， 用酶标仪检测 96孔板中各孔的在 600nm波长处的吸光值； ③确定药物 Ctryamp多肽及其同源结构双亲性多肽的 10倍稀释的最低抑制浓度后， 将最低抑制浓度进行 2倍等比稀释，重复试验的前①②步骤。最终确定抗 菌肽 Ctryamp多肽及其同源结构双亲性多肽对细菌的最低抑制浓度。
实施例 1提供的 Ctryamp多肽对对铜绿假单胞菌的 MIC为 8 g/ml、 对大肠杆菌的 MIC为 6.25-12.5 g/ml、对肺炎克雷伯菌的 MIC为 25 g/ml、 对居泉沙雷的 MIC为 12.5 g/ml、 对沙门氏菌的 MIC为 12.5 g/ml、 对志 贺菌的 MIC为 6.25 g/ml、 对鲍曼不动杆菌的 MIC为 6.25 g/ml、 对脑膜 炎奈瑟菌的 MIC为 6.25 g/ml、 对淋病奈瑟菌的 MIC为 6.25 g/ml、 对 百曰咳鲍特菌的 MIC为 3.13 g/ml、对流感嗜血杆菌的 MIC为 3.13 g/ml。 对变形杆菌的 MIC为 6.25 g/ml。 对革兰氏阳性菌的抑制试验：
96 孔板培养法： ①分别将金黄色葡萄球菌 （包括标准株 CCTCC AB94004 和 ATCC25923、 临床分离株）、 曱氧西林敏感凝固酶阴性葡萄 球菌 (MSSCNS)、 溶血性链球菌 （包括标准株、 临床分离株和耐药株） 、 肠球菌、 白喉棒状杆菌、 痤疮棒状杆菌培养到 OD600 = 0.8时， 稀释 400 倍后取 80μ1加入到 96孔板中， 然后分别向多孔加入 20μ1经等比稀释的 实施例 1提供的 Ctryamp多肽及其同源结构双亲性多肽（实施例 2提供 ), 达到终浓度为 lOO g/ml, lO g/ml, ^g/ml, O.^g/mL 阴性对照和阳性对 照孔分别加入 20μ1 液体培养基和 20μ1 的青霉素 (终浓度为 5(^g/ml); ② 37 °C培养 12小时后， 用酶标仪检测 96孔板中各孔的在 600nm波长处 的吸光值； ③确定药物 Ctryamp多肽及其同源结构双亲性多肽的 10倍稀 释的最低抑制浓度后，将最低抑制浓度进行 2倍等比稀释，重复试验的前 ①②步骤。最终确定抗菌肽 Ctryamp多肽及其同源结构双亲性多肽对细菌 的最低抑制浓度。
Ctryamp多肽及其同源结构双亲性多肽对金黄色葡萄球菌的 MIC为 1.63-6.25 g/ml、 Ctryamp多肽对曱氧西林敏感凝固酶阴性葡萄球菌的 MIC 为 3.13-12.5 g/ml、对溶血性链球菌的 MIC为 8-16 g/ml、对白喉棒状杆 菌的 MIC均为 3.13 g/ml、 对痤疮棒状杆菌的 MIC为 3.13 g/ml、对肠球 菌的 MIC为 6.25 g/ml。 对耐甲氧西林葡萄球菌的抑制试验：
耐曱氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA )和耐曱氧西林凝固酶阴性葡萄 球菌 (MRSCNS) ： 江苏省人民医院临床检验中心分离获得临床株、 中南 大学。
96 孔板培养法： ①将耐曱氧西林金黄色葡萄球菌和耐曱氧西林凝固 酶阴性葡萄球菌培养到 OD600 = 0.8时，稀释 400倍后取 80μ1加入到 96 孔板中，然后分别向多孔加入 20μ1经等比稀释的实施例 1提供的 Ctryamp 多肽及其同源结构双亲性多肽（实施例 2提供 ),达到终浓度为 lOO g/ml, 10μβ/πι1, 1μβ/πι1, 0.1μβ/πι1ο 阴性对照和阳性对照孔分别加入 20μ1培养 基和 20μ1的万古霉素 (终浓度为 12 g/ml); ② 37 °C培养 12小时后， 用酶 标仪测 96孔板中各孔的在 600nm波长处的吸光值； ③确定药物 Ctryamp 多肽的 10倍稀释的最低抑制浓度后，将最低抑制浓度进行 2倍等比稀释， 重复试验的前①②步骤。最终确定抗菌肽 Ctryamp多肽对耐曱氧西林金黄 色葡萄球菌和耐曱氧西林凝固酶阴性葡萄球菌的最低抑制浓度为 3.13-12.5 g/ml, 或 4-8 g/ml (第三方试验结果）。
对厌氧菌的抑制试验：
96 孔板培养法： ①分别将破伤风梭菌、 产气荚膜梭菌、 脆弱类杆菌 培养到 OD600 = 0.8时， 稀释 400倍后取 80μ1加入到 96孔板中， 然后分 别向多孔加入 20μ1经等比稀释的实施例 1提供的 Ctryamp多肽， 达到终 浓度为 lOO g/ml, lO g/ml, ^g/ml, O.^g/mL 阴性对照和阳性对照孔分 别加入 20μ1 液体培养基和 20μ1的青霉素 (终浓度为 40(^g/ml); ② 37°C 培养 12小时后， 用酶标仪检测 96孔板中各孔的在 600nm波长处的吸光 值； ③确定药物 Ctryamp多肽及其同源结构双亲性多肽的 10倍稀释的最 低抑制浓度后，将最低抑制浓度进行 2倍等比稀释，重复试验的前①②步 骤。 最终确定抗菌肽 Ctryamp多肽对细菌的最低抑制浓度。
Ctryamp多肽对破伤风梭菌的 MIC为 25 g/ml、 对产气荚膜梭菌的 MIC为 25 g/ml、 对脆弱类杆菌的 MIC为 12.5μ^πι1。
抗菌试验结果见表 2、 3、 4。 表 2 西藏特里豚蝎 Ctryamp多肽及其结构同源多肽对标准大肠杆菌和金 黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度 MIC ( g/ml ) 多肽名称 氨基酸序列 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 Ctryamp FIRIARLLRIF 12.5 6.25
Ctryamp-R3K FIKIARLLRIF 12.25 6.25
Ctryamp-R5K FIRIAKLLRIF 6.25 6.25
Ctryamp-R9K FIRIARLLKIF 12.5 6.25
Ctryamp-R3H FIHIARLLRIF 6.25 6.25
Ctryamp-R5H FIRIAHLLRIF 12.5 6.25
Ctryamp-R9H FIRIARLLHIF 6.25 6.25 Ctryamp-1 FIKIAKLLRIF 6.25 6.25
Ctryamp-2 FIKIARLLKIF 6.25 12.5
Ctryamp-3 FIRIAKLLKIF 12.5 6.25
Ctryamp-4 FIKIAKLLKIF 6.25 12.5
Ctryamp-5 FIHIAHLLRIF 6.25 12.5
Ctryamp-6 FIHIARLLHIF 6.25 6.25
Ctryamp-7 FIHIAKLLRIF 12.5 6.25
Ctryamp-8 FIRIAKLLHIF 12.5 6.25 3 西藏特里豚蝎 Ctryamp多肽对革兰氏阴性和阳性细菌、 厌氧菌、 床耐药细菌的抑菌效果
菌（科） 实验菌 属性 实验 最小抑菌浓 属 菌株 度
数 MlC^g/ml) 匍匈 金黄色葡萄球菌 (X m re^) (标准 G+ 1 6.25 球菌属 株 ATCC25923)
金黄色葡萄球菌 (X m re^) (临床 G+ 17 1.63-6.25 分离株）
耐曱氧西林金黄色葡萄球菌 G+ 5 3.13-12.5 (MRSA)
★金黄色葡萄球菌 ATCC 29213 G+ 1 8 女耐曱氧西林金黄色葡萄球菌 G+ 11 4-8 (MRSA)
女耐曱氧西林凝固酶阴性葡萄球 G+ 11 4 菌 (MRSCNS)
★曱氧西林敏感凝固酶阴性葡萄 G+ 5 4 球菌 (MSSCNS) 链球菌 月申炎链 ?求菌 ( S. pneumoniae ) G+ 1 3.13 属 无孔链球菌 ( S. agalactiae ) G+ 1 25
★链球菌 ATCC19615 (标准株） G+ 1 8
★红霉素敏感化脓性链球菌 G+ 16 (β-hemolytic streptococcus)
女耐红霉素化脓性链球菌 G+ 11 8-16 肠球菌 屎肠 G+ 1 25 属 粪肠球菌E. faecal is) G+ 1 50 奈瑟菌 脑膜炎奈瑟菌 (N. meningitidis) G" 1 6.25 属 淋病奈瑟菌 (N. gonorrhoeae) G" 1 6.25
大肠埃希菌 coli) ATCC25922 G" 6.25
肠道杆 (标准株）
菌科 大肠埃希菌 co/z)(临床分离株） G" 6.25-12.5
★ATCC25922 (非产 ESBLs) G- 1 4
★ATCC35218(产 ESBLs) G" 1 4 女产 ESBLs大肠埃希菌 G- 10 4-8 ★非产 ESBLs大肠埃希菌 G- 4-8 志贺 ^(dysentery bacilli) G" 1 6.5 沙门菌 G" 1 12.5 月巿炎克雷白菌 peneumoniae) G" 1 25 产酸克雷伯菌 oxytoca) G" 1 12.5 枸橼酸杆菌 （ Citrobacter ) G" 1 12.5 阴沟肠杆菌 cloacae ) G" 1 12.5 居泉沙雷氏菌 （ X fonticola ) G" 1 12.5 厌氧细 破伤风梭菌 (C. tetani) G+ 1 25 菌 产气荚膜梭菌 (C. perfrimgens) G+ 1 25 脆弱类杆菌 G+ 1 12.5 棒状杆 白喉棒状杆菌 ( C. diphtheriae) G+ 1 3.13 菌属 痤疾棒状杆菌 (C. acnes) G+ 1 3.13 假单胞 ★铜绿假单胞菌 (P. aeruginosa) G- 8
菌属 ATCC27853 (标准株）
★铜绿假单胞菌 （IPM-S株） G- 4 8-16 ★铜绿假单胞菌 （IPM-R株） G- 8 8-16 不动杆 鲍曼不动杆菌 (A bi7MWi>>2Z ) (临床 G" 2 12.5 菌属 分离株）
鲍特菌 百曰咳鲍特菌 (β. pertussis) G" 1 3.13 属
嗜血杆 流感嗜血杆菌 influenzae) G" 1 3.13 菌属
分枝杆 ★结核分枝杆菌 (M tuberculosis) G+ 1 25
注： ★表示该菌的最小抑菌浓度试验结果为委托第三方试验进行。 实施例 4: Ctryamp多肽抗菌制剂的制作
1 ) 处方： 实施例 1制备的西藏特里豚蝎抗菌多肽 Ctryamp 0.01-1 .5g、 丙三醇 5g、 羟丙曱基纤维素 7g、 乙醇酸 0.1g、 EDTA O. lg, 无菌 水加至 100g。
2 ) 制备： 将羟丙曱基纤维素洒于液面 （60mL左右） ， 隔夜后成为凝 胶剂基质， 静置后真空脱泡， 将乙醇酸与其余药物混勾， 逐渐加 入到浆料中混勾， 避免剧烈搅拌混入过多气泡。 分装， 即得抗菌 凝胶制剂。
3 ) 空白对照凝胶剂： 制剂中除了不含有 Ctryamp多肽外， 其余处方和 制备同以上制剂。 备注： 羟丙曱基纤维素 (Hydroxypropyl Methyl Cellulose, HPMC)。 丙 三醇、 羟丙曱基纤维素、 乙醇酸、 EDTA均为药用规格。 实施例 5: Ctryamp 多肽抗菌制剂对标准大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌、 MRSA和铜绿假单孢菌的抑制作用
1 ) 将实施例 4提供的成品凝胶剂按照 1:49的比例溶解在灭菌的生 理盐水中， 且进行等比稀释 10个浓度， 置于 4°C水箱。
2 ) 将保种的标准大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌、 MRSA和铜绿假单 孢菌接种到 LB培养基中, 37°C过夜培养。
3 ) 将过夜培养的菌液用新鲜的 LB培养基稀释到 OD600=0.002。 4 ) 96孔培养板中每孔加入 80μΕ的上述菌液。
5 ) 向菌液中加入 20μ 上述不同浓度的成品凝胶剂溶液。
6 ) 同时做凝胶剂和生理盐水的阴性对照以及原料多肽和抗生素的 阳性对照试验。
7 ) 将 96孔板置于 37°C、 250rpm的振荡仪上培养 16小时。
8 ) 16小时后取出 96孔板， 冷却至室温， 置于酶标仪上 630nm波 长测其吸光值。
9 ) 以完全没有光吸收的孔的溶液浓度作为最小抑制浓度。
10 ) 抗菌结果表明， 抗菌制剂对标准大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌、 MRSA和铜绿假单孢菌有高效抑制效应， 其对大肠杆菌、 金黄色葡萄球 菌最小抑菌浓度 MIC为 6.25 g/mL(针对该制剂中有效成分多肽来计算）， 而与原料药多肽具有一致的最小抑菌浓度（原料药 Ctryamp及其同源结构 双亲性合成多肽对大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌的 MIC为 6.25 g/mL ); 其 抗菌制剂对 MRSA的最小抑菌浓度 MIC为 6.25 g/mL、 对铜绿 ?单孢菌 的最小抑菌浓度 MIC为 8 g/mL(原料药 Ctryamp及其同源结构双亲性合 成多肽对 MRSA和铜绿假单孢菌的 MIC分别为 6.25 g/mL、 8 g/mL ), 而空白制剂没有抗菌活性。
抗菌试验结果见表 4。 表 4 西藏特里豚蝎 Ctryamp多肽外用凝胶制剂对革兰阴性、 阳性和耐药 菌的最小抑菌浓度 MIC
实马全细菌菌 最小抑菌浓度 MIC 大肠杆菌 6.25
大肠杆菌 6.25
金黄色葡萄球菌 6.25
金黄色葡萄球菌 6.25 耐曱氧西林金黄色葡萄球菌 （MRSA ) 6.25 铜绿假单胞菌 (P. i/erag wo^X临床分离株） 8 产气荚膜梭菌 (C. perfrimgens) 25
注明： 按照制剂中有效成分 Ctryamp多肽或其结构同源多肽计算。 实施例 6: Ctryamp多肽抗菌制剂对创面细菌感染患者的临床治疗试验 1 ) 病例一般资料： 治疗组病人 82例， 男性 38例， 女性 44例； 年龄 最小 4岁， 最大 76岁； 病种分类： 擦伤创面 28例， 小型烫伤创 面 12例， 烧伤残余创面 10例， 2级糖尿病慢性溃疡 12例， 皮瓣 手术围手术期 12例， 面部大范围激光治疗术后创面 8例。 对照组 病人 74例， 男性 36例， 女性 38例； 年龄最小 5岁， 最大 78岁； 病种分类： 擦伤创面 28例， 小型烫伤创面 13例， 烧伤残余创面 10例， 2级糖尿病' f曼性溃疡 8例， 皮瓣手术围手术期 10例， 激光 治疗术后 5例。
2 ) 实验组治疗方法：釆用给予实施例 4提供的 Ctryamp多肽外用凝胶 (简称蝎肽抗菌凝胶)的药剂外用。 所有伤口或溃疡面用蝎肽抗菌凝 胶外擦， 厚度约 l-2mm, 每日 1次， 或使用蝎肽抗菌凝胶浸润纱 布敷于创面， 每 3 曰换药 1次。 擦伤创面、 浅 II度烫伤创面均先 用 3%过氧化氢溶液冲洗后， 用灭菌生理盐水冲洗至创面清洁。 清 除坏死组织后再用灭菌生理盐水冲洗创面， 0.2%活力碘消毒周围 皮肤， 以无菌棉球将创面拭干后， 使用蝎肽抗菌凝胶均勾涂抹于 创面， 厚度约 l-2 烧伤残余创面、 2级糖尿病慢性溃疡留取标 本做细菌培养， 了解创面感染情况， 按以上方法清创， 先均匀涂 抹蝎肽抗菌凝胶， 待肉芽组织长出， 点状植皮， 再均勾涂擦蝎肽 抗菌凝胶， 厚度约 l-2mm, 网眼纱覆盖住， 加压包扎， 3天后第一 次更换敷料。 慢性糖尿病患者， 长期监控调整血糖， 使之接近正 常值， 最好空腹血糖 (Fasting plasma glucose, FPG)在 8mmol/L以 内； 皮瓣手术围手术期， 清创后， 直接均勾涂擦蝎肽抗菌凝胶保 护创面， 厚度约 l-2 激光治疗术后， 生理盐水清洗创面后直 接均匀涂擦蝎肽抗菌凝胶， 厚度约 l-2mm。 ) 对照组治疗方法： 所有伤口或溃疡面清创后纱布包扎， 3天后半暴 露治疗， 保持创面干燥。 ) 疗效结果与比较： 治疗组 82例患者创面均一期愈合， 未出现感染 及创面延迟愈合， 未出现过敏反应及其他不良反应。 根据国家卫 生部 2007年颁布的抗菌药物临床试验指导原则判断疗效。 结果治 疗组 82例中显效 80例， 有效 2例， 有效率 100%。 对照组 74例 中显效 50例， 有效 20例， 无效 4例， 有效率 95%, 两组经统计 学 F检验， P & 0.05。 两组促进创面愈合时间比较见表 1 , 经过统 计学 F检验， P & 0.05 (表 5 )。 临床治疗结果表明， 本发明提供的 外用凝胶能有效的预防和治疗细菌感染， 同时能显著的促进伤口 的修复愈合。 蝎肽抗菌凝胶对 MRSA和铜绿假单胞菌亚胺培南耐 药株（IPM-R株）有高效的杀菌作用， 对体表慢性难愈合感染创 面疗效独特（治疗组 82例中， 有 8例细菌培养为 MRSA感染， 有 5例细菌培养为铜绿支单胞菌 IPM-R株， 经蝎肽抗菌凝胶治疗均 有效）。 表 5 蝎肽抗菌凝胶和常规换药的平均愈合时间及其比较 *
^ ] 例数（例 ) ~~愈合时间（天) ~~平均愈合时间 ~
(天） 蝎肽抗菌凝 82 5^20 12.14士 2.96 胶
常规换药 74 7-28 18.85士 2.78
* : 两组比较卩& 0.05。 实施例 7: 多肽抗菌制剂对痤疮患者的临床治疗试验
1 ) 病例选择： 入选病人均来自武汉大学人民医院皮肤科门诊， 经临床 确诊的痤疮病人。 排除对克林霉素、 奎诺酮类有过敏史者， 15 天 内使用过其他抗痤疮药物者， 严重的肝肾功能不全者， 以及孕妇 哺乳期妇女。
2 ) 实验分组： 将 258 例病人釆用多中心开放平行对照观察方法， 分 为实验组、 对照组。 实验组： 168人， 男性 76人； 女性 92人， 年 龄 20岁到 38岁 。 对照组： 90人， 男性 46人： 女性 44人， 年龄 22岁到 39岁。 2组间年龄性别、 病期以及皮损程度等各项指标值 相比， 差异均无明显意义， 具有可比性。
3 ) 实验方法：实验组釆用给予实施例 4提供的 Ctryamp多肽外用凝胶 治疗痤疮的药剂外用； 对照组： 给予 5 %的硫横霜（武汉大学人民 医院制剂室制作） 外用。 用药方法： 用温热水和皂液或^ ^黄药皂 洗脸， 将面部油灰充分洗净， 再用手指蘸药， 反复轻轻涂抹于患 处， 每日早晚各涂抹一次， 连续 2周为一疗程。
4 ) 疗效观察和判断标准： 258例参研者每 1周随访观察一次，复诊时， 详细填写观察表格， 记录患者面部痤疮皮损数目、 变化和不良反 应。 按痤疮各种损害 （粉刺、 炎性疤疹、 脓疮、 结节、 嚢肿）减 少的总百分率统计疗效。 痊愈： 皮损消退 100%; 显效： 皮损消退 76-99%; 有效： 皮损消退 50-70%; 无效： 皮损消退 & 50 %。 疗程 结束后， 用计量方法计算治疗后痤疮的百分数， 进行疗效评估。 同时， 对不良反应进行观察， 观察有无局部刺激及全身症状， 部 分病人临床实验前后作血尿常规检查和肝、 肾功能检查。
5 ) 对照疗效统计分析： 实验组 168例， 痊愈 112例， 占 66.7%; 显效 51例， 占 30.4%; 有效 5例， 占 2.98% ； 无效 0 例， 占 0 %; 总 有效率 100 %。 对照组： 90例， 痊愈 5例， 占 5.6%; 显效 14例， 占 15.6%; 有效 20例， 占 22.2%; 无效 51例， 占 4%; 总有效率 43%。 对照疗效分析， 实验组与对照组差异有高度显著性， 说明实 马全组对治疗痤疮疗效优于对照组。
6 ) 不良反应： 实验组 168例患者中无 1例不良反应。 对照组 90例患 者中有 5 例涂药后局部灼热感， 潮红停药后， 自行緩解， 未作处 理。 此外， 实验组治疗前后共观察了 10例血尿常规、 16例肝功， 8例肾功能检查， 均无异常改变。 实施例 8: Ctryamp多肽抗菌制剂对湿