癌细胞体外培养需要什么条件？ - 知乎24被浏览5443分享邀请回答519 条评论分享收藏感谢收起45 条评论分享收藏感谢收起查看更多回答1 个回答被折叠（）关注今日：54 | 主题：516795
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【求助】请教癌细胞培养死亡的原因
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这个帖子发布于8年零237天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我是初入实验室的菜鸟，近期养了前列腺癌pc-3细胞。第一次传代后发现细胞内有空泡，请教原因。细胞扎堆生长，为使其贴壁均匀些，对其消化但未分装，第一此置入胰蛋白酶3分钟后绝大多数细胞仍贴壁；隔日再次消化时置入胰蛋白酶约5-6分钟，次日细胞全部死亡。请教死亡可能原因。还望各位高手多多指点。多谢！！
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转载的，希望有用...附:丁香园网友kj7156084的培养方法：本室的PC－3来自上海细胞生物所，种是ATCC的。以10％FBS＋1640或F12培养，0.25%胰酶消化。塑料瓶或玻璃瓶都可以，当然，前者效果较好。复苏时最好用塑料瓶。5－7天传一次（1：2），2－3天换一次液。尽量高密度传，因为PC－3细胞喜欢扎堆长，如果过了两三天细胞长得不均匀，可以消化离心一下。传代后一到两天不要动它，要有耐心。人前列腺癌细胞PC－3（高密度）
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转载的，希望有用...人前列腺癌细胞PC－3（低密度）
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转载的，希望有用...详细内容在一
人前列腺癌细胞 PC－3M－1E8的传代（转）培养液：RPMI-1640＋10％小牛血清。消化液：0.05%typsin+0.02%EDTA。
本细胞是贴壁生长的细胞，具有高度转移的性质，贴壁 不牢，故需要的消化时间较短，常温消化即可。为避免消化过，通常加入消化液后使其迅速扑满瓶底，摇晃几下即倒出，仅靠残余的少量消化液完成消化。
此外曾遇到过消化后出现絮状物的情况，无法吹打成单细胞悬液。尝试过不使用消化液，即以PBS洗细胞后，直接用培养液吹打细胞，可解决上述问题，但会造成部分细胞丢失。 二
贴壁细胞消化传代的简单方法———丁香园大家谈转载，希望有用。。丁香园网友jinliangyang的观点为：贴壁细胞消化传代时通常采用两种方法：一、加入胰酶等细胞脱落后，再加培养基中止胰酶作用，离心传代；二、加入胰酶后，镜下观察待细胞始脱落时，弃胰酶，加培养液分瓶。但前者太麻烦，而后者有可能对细胞施加胰酶选择，因为总是贴壁不牢的细胞先脱落，对肿瘤细胞来说，这部分细胞有可能是恶性程度较高的细胞亚群。
本人介绍一种简单的消化传代方法和各位共享。加入PBS洗去血清或加入胰酶先中和血清的作用（30s），弃之，再加入适量胰酶作用10s-40s（根据细胞消化的难易程度），弃之，这样依赖残余的胰酶就可将细胞消化单细胞。丁香园网友victoh的观点为： 1、洗去血清 2、加1/5V PBS/D-Hank‘s，2到3次 3、1/10V 胰酶 4、镜下观察，见突起缩回（细胞间隙增大）即加含血清培液 5、吹打后（加培液） 6、分种（时间）丁香园网友yibadao的观点为：对于较难消化的细胞，可以用2%利多卡因消化5-8分钟，然后再弃去，加培养基吹打也可以，对细胞的影响不大。丁香园网友midas的观点为：1、弃去旧培养液，PBS或D液清洗2－3遍（除去旧培养液中血清的影响）； 2、加入0.125% (0.25%也可以) 胰酶6滴（25cm2的培养瓶），使胰酶刚刚可以布满整个底；3、作用1min左右,用含10%血清的培养液3-5ml中和；4、轻柔吹打细胞脱壁, 离心。丁香园网友annemouse的观点为：赞同不用PBS也不用Hanks洗，只要把旧培养液吸的干净一点，直接加酶消化应该不会有什么问题。 丁香园网友yingyu的观点为：我认为还是要PBS洗一下 丁香园网友狮心的观点为：我对付难消化细胞的做法是弃取培养液后，用0.04%的EDTA冲洗一次，再用1/4v的0.04%的EDTA室温孵育5min，弃取大部分EDTA，加入与剩余EDTA等量的胰酶（预热）总体积1/10v。消化到有细胞脱落。不过有人说EDTA对细胞不好。丁香园网友司马的观点为：EDTA对细胞有损伤作用，我们一般也是在难消化的细胞才和胰酶合用，用了EDTA后把细胞离心后洗几遍洗去EDTA。 丁香园网友eeflying的观点为：首先，EDTA对细胞肯定有伤害，EDTA可以与细胞膜上很多大分子蛋白上的中金属成分发生螯合，致使蛋白变性影响蛋白质的生物活性而发生损伤。但是，这种损伤是可逆的。就细胞传代所用的浓度和时间条件下，还不致对细胞产生过大影响。其实Hyclone的胰酶中就有EDTA。因此在一般细胞操作中不能用TE代替PBS洗细胞。如果EDTA对细胞的伤害不是可逆的，想象一下，过去重金属中毒时用EDTA解毒岂不是又喝了一种毒药！ 丁香园网友lysin的观点为：培养的BASMC：倒掉旧培养液，加入少量胰酶冲一下，倒掉，再加入0.125-0.25%胰酶约6-10滴或1ml（25ml bottle）消化，再加入适量新培养基中和，并分瓶这种方法简单、省事；效果很好并且不损失细胞！丁香园网友jianfj的问题为：我的细胞消化要用EDTA加胰酶消化20分钟，有什么好办法？丁香园网友llblmllblm的观点为：先用PBS把细胞洗两遍，使瓶内没有血清了，减少对胰酶的中和，然后用新配的0.25%的胰酶加入3ml左右，放在37度，然后可以在细胞有些消化下来时，拿着瓶口，运用手腕的力量轻轻震荡瓶内液体，这样细胞很快就下来了，还不需要吹打，分散也均匀 丁香园网友orchidgy的问题为：消化细胞后都用什么洗涤呀？带血清的PBS，还是直接用PBS，或者是用培养液呀？我原代培养的细胞二次接种后总是有些细胞铺不开，有些又铺很好，不知是什么问题，求教一下 丁香园网友fonfon的观点为：不管是进口血清或是国产血清，都用PBS直接冲洗三次即可，没有必要用DMEM或加血清的培养液。见意你查查胰酶消化的原理，本论坛中就有，加了血清胰酶怎么消化呀。细胞铺不开，原因有二：一是消化时离心管中的细胞没有吹打开，解决方法是离心后的细胞加3ml左右的培养基，用吸管轻轻吹打，吹打开后，再加培养基，这样细胞不会成团，培养基太多，细胞不容易吹打开。二是接种时，培养瓶中先加培养基，再接种细胞，接种后轻轻晃动摇匀。先加细胞后加培养基或不晃动摇匀，其结果就是细胞铺不开。丁香园网友muren1982的观点为：我养MSCs，传代时候胰酶消化过后，用加血清的培养液终止消化，再离心。弃上清夜，再加入含血清培养液，重悬浮细胞，吹打均匀，计数，安所需密度接种。先用少量培养液，比如1到2ml，润湿培养瓶，然后再接种细胞原因是如果直接接种细胞的话，肯定有的地方接触了较多培养液，而有的地方几乎就没有培养液，细胞当然不会在没有营养的地方待着了。总之，先用少量培养液润湿应该是一个解决办法。丁香园网友zhoues的观点为：1、不洗的细胞传代后，次日一般要换液一次，除去没有贴壁的死细胞．如果是悬浮生长的细胞则不用处理。2、用离心洗涤来出去残留胰酶是不必要的，增加污染机会，也造成细胞丢失，还会使些一些细胞死亡。丁香园网友shanxizyx的问题为：以前一直养悬浮细胞，现在养贴壁细胞，总感觉消化时间老是把握不好，有时候消化过头了，损失很多细胞；有时又消化不充分，导致吹打时候困难，恳请各位给予指点！丁香园网友lovefantacy的观点为：消化时间和细胞类型、消化液的消化能力、细胞的密度等多种因素有关。一般养一种新的细胞要摸索一下消化时间，掌握细胞消化到什么程度恰到好处。新配的消化液消化能力较强，配好后可分装成小管，一次用完，其余冻在－20℃，以保持酶活力。消化液只需铺满瓶底即可，可放入培养箱中，因外在37℃时酶的活力高于常温，有利于缩短消化时间。还有一种方法，就是将胰酶铺满瓶底后，轻摇培养瓶，使胰酶与细胞充分解除，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段时间，待细胞间空隙增大，瓶底呈花斑状即可。细胞生长到覆盖70～80％瓶底时消化较好，若细胞密度过大则消化后细胞易成团。 丁香园网友摩天崖的观点为：消化时间不应超过5分钟，否则对细胞损害很大。消化液覆盖细胞，成一薄膜，然后反复倾斜，使消化液冲刷细胞，当细胞收缩，部分细胞脱落时，可用完全培养基马上中和，同时吹打壁上细胞。应该没问题。丁香园网友yannantian的观点为：我也觉得消化的时间不能一概而伦，要看你的细胞的种类，即使同一种细胞，在不同的细胞株也回出现消化的时间不同的现象，象我们实验室以前的VERO细胞就很好消化，一般就是2-3分钟左右，现在重新拿了一株新的VERO细胞平均每次消化在5分钟以上；其次要看你配的胰酶的质量，如果配的比较好，消化的时候就要好消化一点，反之就久一点。还要在你看到消化过头的情况下，如果细胞下来的比较多了，这时你把CMF或PBS连同细胞弃去是很浪费的，你还不如就连同CMF或PBS加上营养液一起传，因为营养液中有血清，胰酶一遇到血清就会自动终止消化，当然这样对你的细胞是有一定的影响的，但是这也是补救的唯一方法，我消化过头的时候都是这样处理的，只要你的血清质量够好，细胞一般都会张的较好。 丁香园网友cn430028的问题为：本人用胰酶冷消化细胞后，终止消化后，发现絮状的组织细胞怎么也吹不散，都不容易移入培养瓶。是为什么呢？丁香园网友hooyie的观点为：我们实验室使用胰酶消化细胞时胰酶并不预热，而是直接从4摄氏度冰箱中取出在室温中直接使用，对消化效果影响不大。不过我想可能有几个原因：其一：细胞生长过度，也就是在有限的空间里面细胞数量太多，相同时间内消化进行不彻底，导致大量细胞间连接没有破坏掉。其二：消化时间不够。其三：楼上所说的情况我还没有经历过，可能也存在吧。不过我想应该取决于楼主用胰酶消化的细胞的性质。丁香园网友lovefantacy的观点为：我在培养人前列腺癌细胞PC-3M时也遇到过类似问题。当时是准备做流式，看药物对细胞周期和调亡的影响。首先排除了药物对细胞的影响，后来发现可能是由于细胞属高度转移的细胞系，贴壁不牢，常规消化会破坏细胞膜，出现非常难吹散的白色絮状物。于是尝试了以下两种方法：1、加入消化液使其扑满瓶底后迅速将其倒出，缩短消化时间。2、不使用消化液，用培养液直接将贴壁细胞吹打下来。此法会造成细胞丢失，但完全避免了消化液消化过度的影响，在细胞量较大时可尝试。此外，还在文献上看到常规消化后，加入含血清的PBS洗细胞，终止残存消化液的作用，我没有亲自尝试过。 丁香园网友tonnyue的观点为：其实冷消化和热消化都无所谓，当然一般热消化会比冷消化要好一点，因为胰酶在加热时活性高一些，这取决于你的细胞．出现絮状物可能是你的细胞破碎后DNA释放造成，你可以试用ＤＮａｓｅ把它裂解掉．我也曾遇见过类似情况，加ＤＮａｓｅ就没有了．当然也可能是其它原因，你可以摸索一下．ＤＮａｓｅ使用浓度一般２０－３０ｕ／ｍｌ，你可以在配胰酶时直接加到胰酶中． 丁香园网友pengp1999的问题为：我培养的是卵巢癌患者腹水中提取的原代肿瘤细胞，现在已经铺满瓶底。今晚消化传代时，发现用胰酶后消化15分钟，也只有少部分细胞变圆飘起，大部分细胞稍有皱缩，但是贴壁还是很劳。吹打也掉不下来。我的胰酶是3－28配的，配好后一直放在4度冰箱。是不是胰酶失效了？还是原代细胞就是难消化？ 丁香园网友kimi的观点为：胰酶配好分装后，置－20度备用，使用之前37水浴溶解，25cm2的培养瓶用2ml的胰酶，所以分装时，尽量考虑到每次的用量，一次拿出来就用完。避免胰酶反复冻融超，易失效。胰酶消化时，要在37度培养箱内，一般0.25％胰酶2～3分钟，0.05％胰酶－EDTA 3～5分钟，贴壁细胞即可完全飘起。象你这种情况，估计是胰酶失效，3月28到今天4月17日，你只是把胰酶放在4度保存，时间和温度都不合适。也有一种可能性：生长状态不好的细胞，消化时间也会延长。但我们还没有消化超过5分钟还不能work的情况。
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大家养细胞遇到困难时也可以到ATCC网站，如果ATCC有这株细胞，可以在这个网站上查到详细的处理方法等。
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关于丁香园癌细胞弄到伤口上了，对身体有影响吗？ - 知乎579被浏览313274分享邀请回答42575 条评论分享收藏感谢收起13046 条评论分享收藏感谢收起查看更多回答14 个回答被折叠（）细胞细菌污染处理方法
全部答案（共1个回答）
1.使用抗生素。2.挑选未被污染的部分，换培养基培养。
维持菌细胞渗透压梯度和进行细胞内外的物质交换。(2)
进行细菌的电子转运与氧化磷酸化&(3)
是细菌某些成分生物合成的场所。(...
用盈诺YNM型一次性脉冲冲洗器对伤口及创面进行同冲同吸，可清除并回收创口带菌组织、碎屑、及手术残留物，还可缩短清创时间，减少感染率和手术并发症。
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答: #重庆途家斯维登服务公寓（南坪翡翠明珠）#同样是双床房为什么有的一百多有的二百多？内宾标准价什么的有什么区别？房间有区别吗？
答: 2008年4月在苏州举办第十八届中国园艺与盆景艺术培训一、培训班由中国盆景艺术家协会、中国花卉盆景杂志社主办，苏州市盆景协会和苏州市虎丘山风景名胜区管理处承办，...
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这个不是我熟悉的地区癌细胞有不死性吗？为什么？ - 知乎101被浏览34400分享邀请回答11141 条评论分享收藏感谢收起65 条评论分享收藏感谢收起查看更多回答