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杂交瘤细胞的克隆化
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3秒自动关闭窗口杂交瘤抗体技术及分泌特异性抗P24抗原McAb的杂交瘤细胞株的筛选―雅培艾滋病HIV检测试纸网
美国雅培艾滋病（HIV）快速检测试纸网
杂交瘤抗体技术及分泌特异性抗P24抗原McAb的杂交瘤细胞株的筛选发布日期：
在HIV-l p24抗原的检测试剂中，抗p24抗原的单克隆抗体是重要的原材料之一。目前单克隆抗体(monoclonal antibody，McAb)制备技术已经非常成熟，但实验步骤复杂、周期长，包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产等步骤。理想的抗体的制备需要实验人员的大量劳动和不断积累的经验。本节将介绍抗p24抗原单克隆抗体的制备及质量控制。
杂交瘤技术的基本原理
杂交瘤抗体技术的基本原理是通过融合小鼠骨髓瘤细胞和经抗原免疫的小鼠脾细胞，进而使得融合细胞同时保持两者的主要特征。脾淋巴细胞的主要特征是具有抗体分泌功能和能够在选择培养基中生长，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即所谓永生性。在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才具有持续增殖的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。
分泌特异性抗p24抗原McAb的杂交瘤细胞株的筛选
选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功、获得高质量的McAb至关重要。免疫方案应根据抗原的特性不同而定，重组表达的p24抗原属于可溶性抗原，分子质量约24kDa，免疫原性弱，一般要加佐剂。常用佐剂有福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂两种。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散成小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前需振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。&&& 初次免疫& 抗原1～50ug加福氏完全佐剂皮下多点、脚掌注射&&&&&&&&&&&&&& ↓(一般O.8～1m1 O.2ml/点)&&&&&&&&&&&&&&&&& 2～3周后第二次免疫& 剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或腹腔注射&&&&&&&&&&&&&& ↓(剂量不宜超过o．5m1)&&&&&&&&&&&&&&&&& 2～3周后第三次免疫& 剂量同上，加福氏不完全佐剂，腹腔注射&&&&&&&&&&&&&& ↓(5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)&&&&&&&&&&&&&&&&& 2～3周后加强免疫&&& 剂量同上，不加佐剂，尾静脉注射或腹腔注射&&& &&&&&&&&&&&&&& ↓3天后&&&&&&&&&&&&& 取脾融合
目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断进步，例如，①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量；②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射；③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原的反应性。
2．细胞融合
(1)饲养细胞的制备
在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其他活的细胞才能使其生长繁殖，加人的细胞称为饲养细胞(feeder cell)。常选用腹腔渗出细胞(主要是巨噬细胞和淋巴细胞)，其优点是：一方面作饲养细胞；另一方面，巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞的生长创造良好的环境。腹腔渗出细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠，也可以是其他种类的小鼠，如C57鼠、昆明小白鼠等。
主要步骤为拉颈处死小鼠后暴露腹腔，用注射器将4ml培养液注入腹腔，用手指轻揉1min，仍用该注射器回抽腹腔液体加入离心管中，离心弃上清后用HAT(或HT)选择培养基调整细胞浓度，按每孔0.1ml加入96孔培养板，即可供细胞融合和克隆之用。如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少，则可以在细胞换液时再加入一些。
(2)融合前骨髓瘤细胞的准备
骨髓瘤细胞SP2/0一定要确保无细菌、霉菌及支原体污染时方可用于细胞融合，融合前用HAT培养液检测骨髓瘤细胞的敏感性是必要的，当发现较多细胞逆转时需用8-AG处理。一般在融合前两周左右，复苏骨髓瘤细胞，使细胞大量增殖，并达到对数生长期。融合前夜或融合当天上午，更换新鲜完全培养基液使细胞达最佳生长状态。
(3)融合前脾细胞制备
小鼠颈椎脱臼处死后分离出脾脏，用注射器芯在筛网上研磨得到脾细胞悬液，与骨髓瘤细胞混合。
(4)细胞融合
将两种细胞的混合液离心，混匀，加入预温的50％PEG4000作用90s，然后用无血清培养基进行稀释。离心后，用HAT完全培养基悬起细胞接种至96孔板，置37℃5％～10％CO2箱中培养。
3．杂交瘤细胞的检测和克隆选择
细胞融合后一般在5天以后出现新的克隆，未融合的在一周后逐渐死亡。一旦形成杂交瘤，应尽早对其分泌的抗体进行特异性鉴定，以便对抗体分泌阳性的杂交瘤细胞进行克隆和扩增。
检测杂交瘤细胞分泌抗体的方法应以快速、灵敏、简便为宜，目前常用的是间接ELISA方法。将重组p24抗原以适宜浓度包被酶标板，封闭液封闭后加入培养液上清孵育，然后加入HRP标记的抗小鼠二抗，最后加入底物显色、终止。根据结果将阳性孔进行及时的克隆化。
细胞克隆常选用两种方法：有限稀释法和软琼脂法。本文主要介绍前一种方法。当抗体分泌孔的细胞生长到一定面积(一般占小孔的1/3～1/2)，用HAT(或HT)完全培养基将细胞稀释成5个/0.2ml或1个/O.2ml，每孔接种0.2ml细胞悬液。一个融合细胞株至少需要三次有限稀释培养才能获得比较稳定的单克隆抗体细胞株。软琼脂克隆法是将杂交瘤细胞按上述量培养在0.5％琼脂的细胞培养液的平皿中，此法的优点是可直接挑选出单个的杂交瘤细胞。
一般用HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。通常经过三次筛选和克隆，阳性率达到100％即可建株。
4．杂交瘤细胞的冻存与复苏
(1)杂交瘤细胞的冻存
在建立杂交瘤细胞的过程中，为了防止细胞在克隆过程中丢失分泌抗体的特性，需要把其中一部分细胞冻存起来；另一方面，为了防止实验室可能发生的意外事故，如停电、污染、培养箱的温度或CO2控制器失灵等，通常尽可能早地冻存一部分细胞。在杂交瘤细胞建立以后，更需要冻存一大批，以备今后随时取用。
杂交瘤细胞冻存的原理和方法与普通细胞一致，细胞在加血清和二甲基亚砜的培养基中以一定的缓慢速度降温(-20～0℃，每分钟下降1℃；-40～-20℃，每分钟下降2℃)，可在-196℃液氮或液氮蒸气中长期保存。
(2)杂交瘤细胞的复苏
杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞或其他细胞在液氮中保存，若无意外情况时，可保存数年至数十年。复苏时融解细胞速度要快，使之迅速通过最易受损的一5～0℃，以防细胞内形成冰晶引起细胞死亡。
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馨徒嵯赴??骨奠瘤细胞??诤稀⒁?《咀H镜龋???瓿鱿值缛诤稀&蠢?酶哐沟?击融合小鼠脾细胞和臂■瘤的方法,为??芯刻峁┝擞辛κ侄巍???褂?研究利用卵白紊介导电融合,选择性地融合激活的裹面有免疫球蛋白和生物素化的骨■瘤细胞。融合率高.阳性几乎达到???ィ甁口?亲和力高.这种方法缺点是需要特殊的设备,抗原必须与卵白素共价结合。活性免疫球蛋白一卵白素复合物必须用殊方法分离等.还有研究应用冻存后复苏脾细胞进行融合“”.冻存复苏的牌细胞立即融合.融合事较高,短期培养后融合率则变得很低.可能是因为脾细胞在培养中存活较短,或者冻存复苏后比效敏感.也有可能是细巍内的???鹆擞欣?淖饔茫?炒娴钠⑾赴?赡苡?响特异性克隆的百分率.融合产生的抗体?鞲?啵?利用??侗餞??辛俅舱锒虾椭瘟埔丫?玫胶艽蠓⒄埂啊啊啊?”,但是许多病人形***抗小鼠抗体,这种反应影响了各种???挠τ谩啊保??源化??蚝苌儆忻庖咴?浴保?=饩鍪笤葱詍?的免疫原性问题,人们除对原有技术进行改造外,还解决鼠源性??拿庖咴?晕侍猓?嗣浅??原有技术进行改造外,还努力在基因水平上改造抗体结构.一方面生产更接近于人免疫球蛋白的嵌台抗体和人源化抗体,以减少鼠抗体蛋白的免疫原性,克服小鼠??谌颂逵τ玫木窒扌詉另一方面生产各种新型小分子抗体和多功能抗体,使抗体更容易渗入目标组织.符合药物动力学特性.?年代早期开始了基因工程抗体即第三代抗体的研究.人们利用基因
木?薮篝『鞘况晌辉絡文?年代初出现了抗体库技术。”,即用细菌克隆取代?赴?寺±幢泶?基因,建立了离效的抗原筛选系统.据推测,抗体库技术将取代传统的杂工程技术成功地发展了各种抗体片段.人源化抗体又称改形抗体,特点是除了构成抗原结合部位的轻重链各三个???鞘笤葱缘囊酝猓?溆嗑??人源的“”.但人源化抗体常达不到原先鼠源性??那缀土ΑN???%””.单域抗体制备和应用上有优点,但是特异性及亲和力均受到影响??????,没有糖基化的问题,而且有?眦也便于检测.细菌表达的??哂?和酶解获得的??嗤?墓δ堋??逗峡固灞A袅嗽?词笤葱詍?的特异性,人抗小鼠抗体反应有所减弱.因为其??鞘笤葱缘模?匀颂迦匀挥?一定的免疫原性?.单链抗体优点是分子量小,易于穿透组织和清除,制作方便,便于发展其它效应.如连接***,融台表达免疫***等.但亲和力常比完整的抗体和??汀??髦只?蚬こ炭固寤挂;?谛∈笤咏涣觯?抗体谱.这种技术称为抗体库.是区为可能组合不同的抗体数可达?“.达到了库的容量,但不同于原先的?赴?猓?蛭G嶂亓椿?蚴撬婊?楹?的.一个细菌克隆不等于原先的一个?赴?寺。??强梢酝珺细胞一样,从中筛选到针对各种抗原的特异性抗体???.抗体库技术综合了近年发展的新技术:在细菌中衰达功能性的抗体片段?肞?来分离抗体可变区交痼单克隆抗体技术.但是,抗体库技术只是建立在现有的?赴?幕??上,不包括引发突变的过程.尚未解决体内再次应答时抗体亲和力成熟问题.由此出现了体外亲和力成熟技术.????咎匦灾?皇蔷哂锌乖?缀托裕??侵挥?.???甀%的批?注射后定位到肿瘤细胞“。”.因为肿瘤内部压力较高,存在血瘤屏障.???选择性地与血管最近的肿瘤细胞结合等园紊,即使提高血浆药物浓度,??由于两条链问的非极性相互作用所以很稳定.虽有??但常用的是???鼠源性蛋白的阔愿没有彻底解决.?
第臼军量大拳磺士学位论丈也不可能进入一个实体瘤的每一个细胞”“?.单纯应用??不可能杀灭播可在除去大的肿瘤后用???泵鸩杏嗟牧鱿赴?薄保?固逵Υ鸸?讨杏星缀?力成熟的现象。再次应答抗体的亲和力明显高于初次应答的抗体.近年来发现.再次应答抗体的??虿煌?谠?炔捎玫呐呦祷?颉7⑸?送槐洌??????衔?乖?碳ず螅?贐细胞中引起的体细胞突变是高亲和力抗体产生的基础“”.研究表明,如果能分析推测出抗体关键部位的氨基酸,定点突变技术能有效改进亲和力???箍刹捎盟杌?槐浼际酢?等。研究者设想用人的?基因组取代小鼠?的基因组,以后便可以免疫小鼠而获得人抗体.有研究应用基因打靶和取代方法培育小鼠,免疫后产生嵌合抗体,血清满度和亲和力无异于野生型小鼠“”。还有报道能产生各种完整的人抗体的小鼠.其导入的???未螅?⒛茉谛∈驜细胞内进行???嘏牛?泶镌贐细胞表面,免疫后发生高突变并表现亲和力成熟和?类别转换?.抗体库技术的突磁性进展是噬茸体抗体技术“???谏秆∈奔觳獾降?不是细菌克隆的可溶性裹达产物。而的嘴菌体载体转化细菌后,融合表达在噬菌体颗粒表面上的??騍??3莆J扇滋蹇固澹?勺绿蹇固蹇饧际?与杂交瘤技术比较.其筛选范围从几千扩增到几百万或几亿,而时问可从几个月缩短到几周.获得的是人源的抗体???.有报道应用该技术获得商亲和力人???.噬■体抗体技术方法简单快速高效.选择范围广泛,模拟了天然免疫系统亲和力成熟过程,可不需人体免疫接种;可制备对人自身抗原和其它非免疫原性抗原的抗体;可替代动物的多克隆抗体.大规模生产方便,能生产出完全的人抗体和南度人源化的小鼠抗体.但是,目差距.筛选需用纯化抗原,对含量很少的如细胞膜表面抗原来说?炕??散转移病人身上的?“个恶性细胞.所以??皇浅9嬷瘟频母ㄖ?侄危?前己获得噬菌体抗体的亲和力为?.???胩烊豢固辶坷氲??岸ⅰ?啾然褂??
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下载次数：分泌抗NDV和H9N2亚型AIV单抗杂交瘤细胞株的建立--《中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会论文集》2007年
分泌抗NDV和H9N2亚型AIV单抗杂交瘤细胞株的建立
【摘要】：用H9N2亚型禽流感病毒(AIV)、LaSota株新城疫病毒(NDV)加入特殊免疫增强剂作为混合免疫原,免疫小鼠后采用一次融合、分别筛选的方法,分别获得2株稳定分泌抗AIV单克隆抗体的杂交瘤细胞株和4株稳定分泌抗NDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。同时用纯化的H9N2亚型AIV和LaSota株NDV作为单一免疫原,各自分别免疫小鼠,采用传统杂交瘤细胞技术,最后从单一抗原免疫组分别获得3株稳定分泌抗AIV单克隆抗体的杂交瘤细胞株和2株稳定分泌抗NDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。各株杂交瘤细胞培养上清及小鼠腹水单抗ELISA效价最高分别可达1:400以上,单克隆抗体亚型均为IgG2类分子。连续传代25次和三次冻存复苏后,各杂交瘤细胞抗体分泌能力略有下降,但仍能稳定分泌抗体。单克隆抗体的稳定性均较高,抗酸、碱、热的能力较强。AIV特异性单克隆抗体腹水对H9N2亚型AIV具有较高的HI效价,但在鸡胚中不表现中和活性。应用AIV特异性单克隆抗体做免疫荧光检测,结果表明具有较高特异性。利用小鼠腹水单克隆抗体建立了检测AIV的抗原捕获单抗介导夹心间接ELISA(AC-ELISA)方法,用于检测AIV抗原具有良好的特异性和稳定性。本试验应用混合免疫、一次融合、分别筛选的新方法,获得的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体,与传统方法制备的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体相比,效价相似,特异且稳定。与用单一纯化抗原免疫小鼠的传统方法相比,本研究建立的混合免疫、分别筛选方法,仅一次免疫、一次融合就可筛选出分别稳定分泌针对两种甚至更多种不同抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,不仅节约了实验材料、降低了成本,而且节省了时间和人力,大大提高了建立杂交瘤细胞株的工作效率,是一种建立杂交瘤细胞株的高效方法,对杂交瘤技术的学术研究和实际应用均具有重要意义。
【作者单位】：
【分类号】：S852.65
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