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北京现货IPTG溶液(50mg/ml)厂家
产品报价：390元
更新时间： 1:16:11
产地：北京
品牌：百奥莱博
厂商性质：生产商
公司名称：
北京百奥莱博科技有限公司
产品关键词：
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北京现货IPTG溶液(50mg/ml)厂家CAS：BL1234规格：5ml品牌：百奥莱博产地：国产|进口提示：本品仅用于科研实验，不能用作医疗及临床诊断。此试剂用于蛋白诱导表达.或者兰白斑筛选.欲了解更多北京现货IPTG溶液(50mg/ml)厂家的品牌、产地、价格及说明书等产品信息，请致电北京百奥莱博科技有限公司，我们将竭诚为您服务，另外，以下产品正在火爆促销:·核黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐编号：SJ0289 英文名称：FAD Na2 规格：10mg·1M Tris-HCl(PH=7.0)编号：BL1434 英文名称：FAD Na2 规格：100ml/500ml·5&-单磷酸胞苷编号：SJ0158 英文名称：CMP 规格：100mg·Hoechst 33342染色液(即用型)编号：BL1115 英文名称：CMP 规格：10ml/50ml 北京现货IPTG溶液(50mg/ml)厂家关键词：IPTG溶液(50mg/ml),BL1234,百奥莱博·胶原蛋白Ⅰ型CAS： 英文名称：Collagen TypeⅠ 规格：1g 说明: 可作为胶?&酶的底物。Ⅰ型胶?&蛋白是皮肤、骨骼、肌腱以及其他纤维连接组织的组成成分。 别名：Collagen from bovine achilles tendon CAS＃：外观：乳白色纤维状溶解性：不溶于水，有机溶济。 储存条件：2-8℃ From Sigma C9879·液体沙氏培养基编号：BL1052CAS： 英文名称：Collagen TypeⅠ 规格：250g 说明：用于真菌的分离培养储存条件：室温·氢化可的松编号：BL1052CAS：50-23-7 英文名称：Collagen TypeⅠ 规格：5g 说明：生化研究。 别名：皮质甾醇；氢化皮质素；氢化皮质酮；17-羟基皮质(甾)酮；可的索11β,17α,21-Trihydroxypregn-4-ene-3,20-dione，17-Hydroxycorticosterone4-Pregnene-11β,17α,21-triol-3,20-dione；Cortisol；Kendall’s compound F 分子式：C21H30O5分子量：362.46CAS＃：50-23-7 外观：白色结晶性粉末 纯度：≥98％熔点：211-214℃溶解性：极微溶于水(0.28mg/ml),略溶于丙酮、乙醇，微溶于氯仿R：63S：36/37储存条件：室温干燥避光保存·AP标记抗体稀释液编号：BL1110CAS：50-23-7 英文名称：Collagen TypeⅠ 规格：10ml/50ml/100ml 说明：生化研究。 别名：皮质甾醇；氢化皮质素；氢化皮质酮；17-羟基皮质(甾)酮；可的索11β,17α,21-Trihydroxypregn-4-ene-3,20-dione，17-Hydroxycorticosterone4-Pregnene-11β,17α,21-triol-3,20-dione；Cortisol；Kendall’s compound F 分子式：C21H30O5分子量：362.46CAS＃：50-23-7 外观：白色结晶性粉末 纯度：≥98％熔点：211-214℃溶解性：极微溶于水(0.28mg/ml),略溶于丙酮、乙醇，微溶于氯仿R：63S：36/37储存条件：室温干燥避光保存北京现货IPTG溶液(50mg/ml)厂家关键词：IPTG溶液(50mg/ml),BL1234,百奥莱博&&IPTG溶液(50mg/ml)如何储存？化学试剂的变质，大多数情况是因为受外界条件的影响，如空气中的氧气、二氧化碳、水蒸气、空气中的酸碱性物质以及环境 温度、光照等，都可使化学试剂发生氧化、还原、潮解、风化、析晶、稀释、锈蚀、分解、挥发、升华、聚合、发霉、变色以及燃爆等变化。经常检查储存中的化学 试剂的存放状况发现实际起过的储存期或变质应及时报告，并按规定妥善处理 ( 降级使用或报废) 和销帐。在正常储存条件下，一般化学试剂贮有不宜超过2年，基准试剂不超1年。为了避免环境和其他因素的干扰，所有化学试剂一经取出不得放回贮有容器: 属于必须回收的试剂或指定、退库、的试剂，必须另设专用容器回收或贮存，具有吸潮性或易氧化，易变质的化学试试剂必须密封保存，避免吸湿解，氧化或变质。 定期盘点，核对出现差错应及时检查原因，并报主管领导或部门处理。·2×SYBR Green PCR Mastermix编号：BL1406 规格：1.25ml(50T)/200T·胃蛋白酶抑制剂编号：BL1406CAS： 英文名称：Pepstatin A 规格：5mg 说明：酸性蛋白酶抑制剂，包括胃蛋白酶、血管紧张肽原&酶和组织蛋白酶D以及很多其他蛋白酶。有效浓度为1μM 别名：抑肽素 分子式：C34H63N5O9分子量：685.89CAS＃：外观：白色粉末溶解性：溶于乙醇，10mg/ml，溶液微浑浊，除去浑浊后，再加50ul冰醋酸/ml乙醇。也可溶于DMSO，25mg/ml熔点：233 ℃S： 22-24/25储存条件：2-8℃From Sigma P4265·杆菌肽编号：BL1406CAS： 英文名称：Bacitracin 规格：1g 说明：杆菌肽是由地衣型芽孢杆菌产生的多肽类抗生素，对大多数革兰氏阳性菌特别是耐药葡萄球菌具有较强的抗菌作用。 分子式：C66H103N17O16S 分子量：1422.69 CAS＃： 外观：白色或μ&黄色粉末 来源：Bacillus licheniformis 溶解性：易溶于水，能溶于乙醇、甲醇和冰乙酸 S：22-24/25储存条件：2-8℃ 干燥保存 From Sigma 11702·非变性组织/细胞裂解液编号：BL1358CAS： 英文名称：Bacitracin 规格：100ml 产品简介：非变性组织/细胞裂解液内含非离子型去垢剂，能裂解细胞并在非变性条件下释放胞浆蛋白和可溶性膜蛋白、核蛋白。非变性条件下的裂解蛋白产物最大限度地保留了蛋白的特性和功能，如抗原-抗体结合或酶学活性，因此适宜于进行免疫共沉淀。另外，有些抗体对非变性蛋白具有更高的结合能力或只能识别非变性蛋白的抗原位点，这种情况应该使用非变性裂解。储存：4 oC避光。本系列试剂随同配送一支PMSF，请收到后-20℃保存。RIPA裂解液4℃保存，如发现有少量沉淀，可常温放置半小时，沉淀可消失，不影响使用。使用裂解液在提取核蛋白的同时，也会将基因组一并释放出来，细胞量高时会造成细胞裂解液粘稠，此时可以直接加入蛋白上样缓冲液，煮沸再离心，离心取上清直接上样电泳；若想测定浓度，可入加少量SDS（1%），煮沸后离心测浓度。本系列蛋白提取试剂所提取的蛋白由于含有去污剂，所以不适合使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒，请选择BCA法或者Lowry法检测蛋白浓度。如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散粘稠状物，随后离心取上清用于后续实验。·姬姆萨染色液(10*原液)编号：BL1193CAS： 英文名称：Bacitracin 规格：100ml/500ml 产品简介：非变性组织/细胞裂解液内含非离子型去垢剂，能裂解细胞并在非变性条件下释放胞浆蛋白和可溶性膜蛋白、核蛋白。非变性条件下的裂解蛋白产物最大限度地保留了蛋白的特性和功能，如抗原-抗体结合或酶学活性，因此适宜于进行免疫共沉淀。另外，有些抗体对非变性蛋白具有更高的结合能力或只能识别非变性蛋白的抗原位点，这种情况应该使用非变性裂解。储存：4 oC避光。本系列试剂随同配送一支PMSF，请收到后-20℃保存。RIPA裂解液4℃保存，如发现有少量沉淀，可常温放置半小时，沉淀可消失，不影响使用。使用裂解液在提取核蛋白的同时，也会将基因组一并释放出来，细胞量高时会造成细胞裂解液粘稠，此时可以直接加入蛋白上样缓冲液，煮沸再离心，离心取上清直接上样电泳；若想测定浓度，可入加少量SDS（1%），煮沸后离心测浓度。本系列蛋白提取试剂所提取的蛋白由于含有去污剂，所以不适合使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒，请选择BCA法或者Lowry法检测蛋白浓度。如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散粘稠状物，随后离心取上清用于后续实验。&&生物化工学科起始于第二次世界大战时期，以抗生素的深层发酵和大规模生产技术的研究为标志。20世纪60年代末至80年代中期，转基因技术、生物催化与转比技术、动植物细胞培养技术、新型生物反应器和新型生物分离技术等开发和研究的成功，使本学科进入了新的发展时期，学科体系逐步完善。20世纪后期，随着以基因工程为代表的高新技术的迅速崛起，为本学科的进一步发展开辟了新领域，无数前人的工作和我公司的不懈奋斗。造就了高品质的IPTG溶液(50mg/ml)。&&我公司以高效的产品质量，完善的销售体系、快速、安全的产品渠道，优质的客户服务，以诚信的态度，真诚的对待客户、合作伙伴以及各位同仁，欢迎来电咨询IPTG溶液(50mg/ml)！我公司生产供应销售的生化试剂产品正全系列现货促销，满分期待您的垂询选购北京现货IPTG溶液(50mg/ml)厂家。
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该厂商的产品分类非变性细胞裂解缓冲液- 非变性细胞裂解缓冲液 蛋白质研究
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> 分析试剂
产品名称：&&非变性细胞裂解缓冲液 蛋白质研究
产品规格：&&100ml
包装说明：&&瓶装
价格说明：&&660
发布日期：&&
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经营模式：生产型, 贸易型
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展厅地址：
&非变性细胞裂解缓冲液- 非变性细胞裂解缓冲液 蛋白质研究&的 详 细 说 明
特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。 名称：非变性细胞裂解缓冲液 蛋白质研究规格：100ml编号：XH065品牌：百奥莱博产地：国产|进口非变性细胞裂解缓冲液(Nondenaturing Lysis Buffer)内含非离子型去垢剂、盐、和蛋白磷酸酶抑制剂，能裂解细胞并在非变性条件下释放胞浆蛋白和可溶性膜蛋白、核蛋白。非变性条件下的裂解蛋白产物最大限度地保留了蛋白的特性和功能，如抗原-抗体结合或酶学活性，因此适宜于进行免疫共沉淀。另外，有些抗体对非变性蛋白具有更高的结合能力或只能识别非变性蛋白的抗原位点，这种情况应该使用非变性裂解。非变性细胞裂解缓冲液的主要成分为20mM Tris(pH7.5)，150mM NaCl，1% Triton X-100，1% NP-40以及2mM sodium pyrophosphate，25mM β-glycerophosphate，1mM EDTA，1mM Na3VO4，0.5 ug/ml leupeptin等多种抑制剂。可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。非变性蛋白裂解液裂解得到的蛋白样品，可以用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。由于含有较高浓度的Triton X-100等干扰物质，不能用Bradford法测定由本裂解液裂解得到样品的蛋白浓度。保存条件：-20℃保存，一年有效。注意事项：为取得最佳的使用效果，尽量避免过多的反复冻融。可以适当分装后使用。裂解样品的所有步骤都需在冰上或4℃进行。关于裂解液的选择，一方面可以参考我们生产的各种裂解液主要特点、差异，选择合适的裂解液；另一方面也需要通过一些预实验来摸索最佳的适合您实验条件的裂解液。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。使用说明：对于培养细胞样品：1. 融解非变性蛋白裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。2. 对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗)。按照6孔板每孔加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。对于悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。大团的细胞较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。3. 充分裂解后，g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。裂解液用量说明：通常6孔板每孔细胞加入100微升裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到150微升或200微升。对于组织样品：1. 把组织剪切成细小的碎片。2. 融解非变性蛋白裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。3. 按照每20毫克组织加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。)4. 用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。5. 充分裂解后，g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。6. 如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。用于普通的Western、IP或co-IP，我们推荐使用Western及IP细胞裂解液(P1001)，该裂解液已被国内各大研究机构广泛使用，用户普遍反映很好。裂解细胞或组织后，没有非常粘滞的透明状DNA团块形成，不必采用超声
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北京百奥莱博科技有限公司是一家专业的生物试剂销售公司。公司主要经营ELISA试剂盒、血清、抗原、抗体等生物试剂产品，可以为您提供专业的ELISA技术服务，以优良的价格、优质的服务、优先的理念，满足客户的各方面的需求，与国内多家企业、单位建立了良好的长期合作关系，拥有较好的企业信誉和品牌形象。
主营产品:ELISA试剂盒、血清、抗体、抗原、核酸提取、核酸纯化等生化试剂
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【求助】磷酸化WB做不出来，怎么办？
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【求助】磷酸化WB做不出来，怎么办？
我做的磷酸化WB步骤如下：
1、提取细胞总蛋白
细胞裂解液配方如下:
Tris-HCl 50mmol (pH7.5)
TritonX-100 1ml
NaCl 150mmol
EDTA 2mmol
EGTA 1mmol
D4H2O 定容至100ml
临用时加入1 mmol/L NaF ，1 mmol/L Na3VO4，protease inhibitor cocktail (Roche).
胰酶消化收集细胞（不知道胰酶对磷酸化有无影响），每10×6个细胞加100μl细胞裂解液，超声破碎，3×15秒，12000rpm，4°c，10min，收集上清。
所有操作都在冰上进行，且快。
蛋白定量用Bradford Assay，测出浓度为4.24mg/ml
用5×上样缓冲液稀释成3ug/ul，100°c，5min煮沸
2、电泳，转膜
蛋白上样15－20μl，8％的分离胶，95v，15min，5％的浓缩胶，165v，75min
有预染marker
转膜 : 恒流 400mA，90min。
预染marker全部转上去了。
3、封闭，一抗，二抗
5%脱脂奶粉，37°c，2小时
TBST洗膜，10min，3次
一抗为santa cruz的p－tyr（PY20），TBST/1%脱脂奶粉配制，1:1000，4°c过夜，TBST洗膜，10min，3次
二抗为pierce的羊抗鼠，TBST/1%脱脂奶粉配制，1:2000，37°c，2小时，
TBST洗膜，10min，3次
4，显影，压片
ECL(pierce，A液B液1:1)4-5min，曝光3 min，显影3-5分钟，压片2小时
没有任何条带，连非特异性条带都没有。
同一组蛋白做其他抗体，条带非常清楚。
不知道什么原因，郁闷中，磷酸化真的象传说中那么难吗？请各位高手出手分析一下，不甚感激！！！
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同一组蛋白做其他抗体，条带非常清楚。
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那是否说明是抗体的问题呢？能否检测一下抗体（尤其是一抗）有没有问题？
比如有没有阳性对照可以试一下，或者干脆做点杂交，把一抗点到膜上，封闭、二抗、显影。。。
如果能出来说明抗体本身没问题，但是抗体不与目的蛋白结合（看看说明书是否适用于该实验）或者没有目的蛋白
如果也出不来就是一抗的问题
没做过磷酸化WB，仅供参考！
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回复 #2 guagua 的帖子
抗体是santa新买的，应该问题不大。
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lz应该是新手吧
没做过磷酸化的蛋白
但是有一点是肯定的
那就是涉及磷酸化的蛋白做WB千万别用脱脂奶粉
建议改用BSA!
原因还是自己去查资料吧
这样会记得很牢的
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之前没做过磷酸化，我也查过BSA，也已经买了，还没用，不知道用多大浓度，说2%3%5%的都有。这个我会尝试的。
楼上的大虾，我的步骤还有什么问题吗？请多批评啊！
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磷酸化蛋白ＷＢ和非磷酸化的一样，并没有什么特别的，考虑以下方面：
1.1 mmol/L Na3VO4配制有没有问题，Na3VO4是磷酸化酶抑制剂，其配置有一实的特点，Homemade phosphatase inhibitor cocktail
Sodium orthovanadate activation:
o in 20 ml lysis buffer add 100 μl of 200 mM stock of sodium orthovanadate activation and final concentration is 1 mM
o 200 mM Sodium orthovanadate activation stock (MW 183.9)
o 0.37 g into 10 ml H2O
o adjust pH to 10 (solution becomes yellow)
o boil solution until it turns colorless (~10 min)
o cool to R.T.
o readjust pH to 10.
o repeat steps 3, 4 and 5 until solution remains colorless and pH stabilizes at pH 10 PRC CORE Page 4 of 9 LAB
o store activated orthovanadate as aliquot at -20°C (300 μL in each aliquot)
如果不按上面的方案来进行，则没有将其激活，那么他是不具备酶活性的，这样你的磷酸化蛋白很快就被去磷酸化，当然检测不到。
2.可能抗体浓度不合适，不然怎么连非特异条带都没有，顺便问一下，有没有泳道。如果没有，很可能操作或抗体有问题。
3.目的蛋白分子量是多大的，400mA会不会把蛋白转过
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1、你在做细胞裂解之前二个小时，加入钒酸钠，目的是抑制磷酸化酶的作用。
2、超声是不是起作用，我感觉没有必要，因为你的细胞裂解液中含有NP40。
3、在加入的loading buffer及转膜过程中要加入钒酸钠
这是我个人与你不同的地方
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我磷酸酶抑制剂的配制可能不正确！
在显影压片后，我把膜用考马斯亮蓝染色观察，发现上面有条带，非常清楚。
做普通的WB，400mA转，预染marker非常漂亮。
也感谢sdjlmu 的建议，我在提蛋白的时候就是一直在考虑，也尝试过，胰酶消化或者细胞刮收集细胞，超声破碎到底有无差异，不超声破碎的话在冰上裂解多久才合适呢？你能说说你提蛋白的步骤吗？不甚感激！
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真的用脱脂奶粉会有那么大的影响吗?我的师兄以前就用脱脂奶粉做出来过的,不过现在做不出来了......
我们会试试换BSA 呵呵
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我在提蛋白的时候就是一直在考虑，也尝试过，胰酶消化或者细胞刮收集细胞，超声破碎到底有无差异，不超声破碎的话在冰上裂解多久才合适呢？你能说说你提蛋白的步骤吗？不甚感激！
这主要是我们实验室的一般的提取蛋白方法：
1、用刮子收集细胞(当然在做磷酸化的时候，要提前加钒酸钠)到15mL离心管中
2、1000g离心3分钟，用PBS洗一次，1500g离心2分钟，弃PBS，加入1mLPBS悬浮到ependorf管中，1500g离心2分钟，真空吸净液体
3、加入细胞裂解液(先用先加钒酸钠)冰浴18分钟(不固定，20分钟也可)，然后高速离心取上清就可以了
在我们室检测磷酸化是很普通的实验，很容易做出的
另外，之所以不用脱脂奶粉，是因为奶粉中的一些特殊物质，导致在显影时背景增高，所以用3%到5%的BSA均是可以的玉米产业区燃料乙醇的产业研究
4、研究目的
4.1、研究目的与意义
传统的淀粉糖化工艺、发酵产乙醇工艺在酿造业已经发展得很成熟。但目前,国内 外对餐饮废物转化为燃料乙醇的技术性研究较少,仅停留在综述水平。传统的技术参数 是在纯原料的基础上得到的,餐饮废物成分复杂,糖化条件、酵母发酵产乙醇的条件也 会受到影响,探索出适合餐饮废物糖化、发酵的工艺参数,可以为后续的研究提供参考。 北京科技大学的晏辉[72]等人用同步糖化发酵法对从餐饮废物生产燃料乙醇进行了研究, 14 虽使用的是价格较贵的糖化酶,但糖化程度低,乙醇产量较低,经济效益不甚理想。因 此,为实现社会效益、经济效益和环境效益的统一,经济合理、高效的转化餐饮废物为 乙醇的方法有待于进一步的研究。 我国的发酵业历史源远流长,20 世纪啤酒从西方的传入,引入了液态发酵产乙醇的 新技术,同时,新工业时代的来临,使糖化工艺和液态发酵产乙醇的技术也得到了快速 的提高,目前,国内外对淀粉转化为乙醇的研究已经很成熟,并且早已规模化、集成化。 最近几年人们对餐饮废物的研究越来越深入,对其组成、性质等进行了深入的研究,国 外很多学者研究得最多的就是餐饮废物的生物制氢。Youssouf [100]、Tao [101]、Naomichi [102] 等从原料来源、产乙醇的能耗、废气的二次排放污染、产乙醇的工艺流程、汽油醇的使 用及价格方面做了全面而科学的探讨和综述。其研究方法和思路值得我们借鉴和参考。 由于原料的地区差异、研究方法、技术手段等的差异,在普遍性和实用性方面亦有不足 之处,针对我国餐饮废物的高含水率、成分复杂的特点,需寻找出优化的餐饮废物转化 为乙醇的一系列工艺参数。本研究拟选用餐饮废物作为研究对象,通过探索原料处理方 式、水解条件研究和发酵条件研究,建立数学模型,为餐饮废物发酵制取燃料乙醇的研 究提供有价值的基础数据。 本研究对餐饮废物的资源化、能源化研究具有重要的理论与实际意义,具体意义在 于: (1) 目前对餐饮废物转化为乙醇的研究很少,本研究为餐饮废物的无害化、有效化 利用提供了一个新的途径和方法; (2) 探索既经济又有实用价值的适合于从餐饮废物转化为燃料乙醇的水解糖化、发 酵条件参数,可为后续的餐饮废物转化为乙醇的更深一步的研究提供理论依据,为燃料 乙醇的生产开辟更好的前景。 15
4.2、研究目的、意义和内容
1.5.1 研究目的与意义1.5.1 研究目的与意义 随着不可再生资源石油的日益消耗,各种因石油产生的社会矛盾也随之加剧,如能源 供应形势严峻,大气污染越发严重,全球温室效应显著等等。因此,能源供应与安全已长 期成为各国关注的话题。另一方面,我国是人口大国,每年因饮食消耗产生的餐厨废弃物 达 6000 万吨以上,数量庞大,难于处理,是城市环境污染的主要因素,且严重浪费了资 源。餐厨废弃物是一种富含游离糖、淀粉质、蛋白质等有机物的固体垃圾,易腐烂变质、 发霉发臭,因而有别于一般的生活垃圾。近年来,关于餐厨废弃物的减量化、无害化与资 源化处理的研究已有众多报导,主要集中在堆肥、沼气、饲料等方面,但用于转化生物乙 醇的前沿性研究仍然报道较少。鉴于此,本论文以餐厨废弃物为原料,采用先进的统合生 物工艺,通过基因重组酵母分泌相关水解酶直接转化利用营养丰富的餐厨废弃物成为乙 醇,一方面实现对餐厨废弃物的减量化和无害化生物处理,另一方面将餐厨废弃物转化为 生物乙醇和高安全性的酒糟营养饲料,进一步增加餐厨废弃物的二次利用价值,希望能够 为我国餐厨废弃物的资源化利用提供一条新途径。 生物乙醇,主要的燃料能源替代品之一,是一种可再生资源,对环境友好,近年来深 受全世界的关注,具有巨大的发展潜力。本研究以基因工程和代谢工程等生物技术手段在 分子水平上对出发菌株 As2.489 进行遗传改造,构建出能够分泌表达 α-淀粉酶与糖化酶的 重组酿酒酵母工程菌;在此基础上以餐厨废弃物为原材料,研究利用重组酿酒酵母快速、 安全处理餐厨废弃物的可行性。论文通过对餐厨废弃物进行成分分析,针对性地采用商业 化酶进行同步糖化发酵,证明了同步糖化发酵产乙醇的可行性;同时重点研究了统合生物 14 工艺,即利用重组酵母工程菌对餐厨废弃物原料进行直接发酵产乙醇的尝试。研究结果表 明,统合生物工艺减少了发酵过程中对商业化酶的使用和依赖,简化了原料的处理和加工 程序,为统合生物工艺在餐厨废弃物转化乙醇的应用研究方面提供了有力的理论依据和实 验基础。
4.3、本课题研究目的和方法
尽管国内外对于多孔介质中预混燃烧技术已经开展了较为广泛的研究,在应用开发 华南理工大学硕士学位论文 14 领域也取得了一定的成果,然而对于多孔介质中的气体燃烧大多集中在贫燃气体的研 究,研究成果主要应用在多孔介质换热器。多孔介质中甲烷富燃料燃烧制氢研究相关的 理论也不是很完善。多孔介质反应器中甲烷预混气体部分氧化燃烧制氢的研究国内刚刚 开展,在多孔介质反应器中乙醇预混气体部分氧化制氢研究没有开展。本文对这两种燃 料的部分氧化制氢方法开展了大量的实验研究,对促进在多孔介质反应器中部分氧化制 氢起一定促进作用。 本文分别首先建立一维稳态燃烧模型,惰性多孔介质反应器中甲烷预混气体富燃料 燃烧制氢进行数值模拟,对不同的多孔介质属性参数和预混气体参数对燃烧过程的影响 进行了系统地研究。通过数值模拟的初步研究,为实验台设计和实验研究提供指导。紧 接着分别对多孔介质反应器中甲烷/空气和乙醇/空气预混气体的部分氧化反应制氢进行 了实验,对比不同的多孔介质(孔径,孔隙率,材料)和不同预混气体流速和当量比, 对各物理参数对燃烧特性和污染物排放的影响进行了分析,总结出了各工况参数对其燃 烧特性及合成气影响的规律,并讨论燃烧制氢效果。
4.4、研究目的和意义
木质纤维原料结构复杂,预处理和水解过程是制备可发酵还原糖的重要环节;水解 液中木糖含量仅次于葡萄糖,微生物利用木质纤维原料生产乙醇,木糖高效转化是其经 济可行的重要环节。近几十年来,对戊糖发酵乙醇的研究主要聚集在选育优良高产菌种、 发酵机理和发酵条件的优化等方面,取得了一定的进展。但是目前的研究大都是在摇瓶 中,而关于发酵罐条件下发酵的研究较少,摇瓶发酵和发酵罐发酵有很大的差别,发酵 罐发酵更接近于工业化生产,因此仍有必要对影响发酵的因素以及预处理方法进行更进 一步深入的研究。本文是以树干毕赤酵母为发酵菌株,在前人摇瓶发酵研究的基础上, 对发酵罐发酵条件优化和预处理工艺进行了研究,以期提高乙醇转化率,为工业化生产 提供理论基础。
4.5、本课题研究目的、意义及技术路线
1.6.1 本课题研究目的和意义1.6.1 本课题研究目的和意义 目前,国内外在以木质纤维为原料发酵生产乙醇已经建立了许多生产工艺,但是其 主要利用的是木质纤维素中的纤维素为原料,而半纤维素这一部分研究的相对较少,且 半纤维素降解产物木糖的糖醇转化率较低。本研究主要是利用玉米秸秆中半纤维素原料, 筛选得到能够利用半纤维素降解产物木糖发酵高效产乙醇的菌株,对于提高以秸秆为原 料的木质纤维素乙醇生产中的原料利用率,降低生产成本具有重要意义。
4.6、本研究的目的和意义
本论文将具有自主转座能力的 AcTPase 加以改造使其能够合成转座酶,但是缺失转 座序列,丧失转座能力。Ds 元件不具有编码转座酶的功能,只有在 Ac 转座酶存在的情 况下才能转座。诱导型表达转座酶基因,可以使转座过程变得可控,既能显著提高转座 16 频率,又能快速稳定插入事件。通过 Ds 的切离和再插入实验可以很好地展开转座子标 签法克隆功能基因的目的,本实验首先在拟南芥上测试两个系统的可行性,然后进一步 应用于玉米。这将有助于人们对整个植物界的认识,改善农作物的品质,提高农作物的 抗逆性以及降低农业生产对环境的影响。 17 2材料和方法 2.1实验材料 2.1.1植物材料 本实验所用材料为拟南芥,种植于温室,玉米材料为A188,齐-319,作为遗传转化 的受体材料以及分析用材料。 2.1.2菌株和载体 本研究所用大肠杆菌菌株为E. coli DH5α,克隆载体为pMD18-T vector(TaKaRa公 司),农杆菌菌株为GV3101和LBA4404,用于拟南芥和玉米遗传转化的表达载体为 pZP211(由山东农业大学李祥老师惠赠)。 2.1.3酶及生化试剂 限制性内切酶、Taq酶、T4 DNA连接酶、TdT、IPTG、X-Gal和DNA Marker(DL2000, DL15000)购自宝生物工程(大连)有限公司产品。RNA提取用TRIZOL试剂购自 invitrogen公司。反转录试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司。UItraSYBR Mixture (With ROX)购自康为世纪公司。纯化试剂盒Wizard DNA Clean-up System购自Promega 公司,DNA胶回收试剂盒AxyPrep DNA Gel Extraction Kit,购自AxyGEN公司。高纯质 粒小量制备试剂盒(离心柱型)购自北京百泰克生物技术有限公司。 2.1.4 PCR引物 PCR引物由上海生物工程有限公司合成,详细引物序列见附录。 2.1.5培养基 培养基包括大肠杆菌、农杆菌培养培养基,农杆菌介导法转化拟南芥所用培养基, 农杆菌介导法转化玉米所用培养基,详细配方见附录。 2.1.6 GUS染色液 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯(X-Gluc);NaH2PO4;Na2HPO4;Na2EDTA; Triton-100;K3[Fe(CN)6](铁氰化钾);K4[Fe(CN)6](亚铁氰化钾),DMSO(二甲基 18 亚砜)。 2.2实验方法 2.2.1质粒DNA的提取 2.2.1.1碱法小量提取质粒DNA 挑取白色菌落接种于LB液体培养基中,过夜培养至对数生长期,收集菌体提取质粒。 步骤如下: 1)取1.5mL培养物置于Eppendorf管,12000rpm,4℃,离心1min回收菌体,重复多 次; 2)将沉淀悬浮于100μL预冷的溶液Ⅰ中,振荡器上振荡,使之充分悬浮; 3)加200μL新配制的溶液Ⅱ于悬浮液中,快速颠倒Eppendorf 5次,切勿振荡,将离 心管置于冰上4 4)加150μL预冷的溶液Ⅲ,反复颠倒Eppendorf数次,使溶液Ⅲ在粘稠的细胞裂解 物中均匀分散呈透明状,之后置于冰上5 5)12000rpm,4℃,离心5min,取上清至另一干净Eppendorf管中; 6)加入等体积的苯酚:氯仿,振荡混匀,12000rpm,4℃,离心5 7)取上清,加两倍体积的无水乙醇或0.6倍体积的异丙醇,混匀,室温或-20℃放置 30 8)12000rpm,4℃,离心5min,收集沉淀,去上清,用1mL70%的乙醇洗涤沉淀, 稍离心,吸干液体,室温下放置片刻,使沉淀干燥; 9)用50μLTE溶解沉淀,加1μLRNaseA(10mg/mL),37℃放置1h去除RNA,-20℃ 保存。 2.2.1.2试剂盒质粒微量提取方案 1)取1.5-4.5mL过夜培养的细菌,9000rpm离心30sec,弃上清,收集菌体,尽可能 的倒干上清; 2)用250μL溶液P1(已经加入RNaseA)重悬菌体沉淀,涡旋振荡至彻底悬浮; 3)加入250μL溶液P2,温和的上下翻转6-10次使菌体充分裂解,直到溶液变得清亮; 4)加400μL溶液P3,立即温和的上下翻转6-10次,室温放置5min,室温13000rpm 19 离心10min,小心的取上清; 5)将吸附柱安置在收集管上,将上一步所得上清液加入吸附柱AC中(吸附柱放入 收集管中,溶液太多可分两次加入),13000rpm离心1min,弃滤液; 6)加入500μL去蛋白液PE,13000rpm离心30-60sec,弃滤液; 7)加入500μL漂洗液WB(已经加入无水乙醇),13000rpm离心30-60sec,弃滤液; 8)重复步骤7一次,13000rpm离心30-60sec,弃滤液。空柱13000rpm离心2min,室 温放置3-5min,除去残留乙醇; 9)取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加60-100μL洗 脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中加热效果更好),室温放置1min,13000rpm 离心1min洗脱DNA,可立即用于下游分子生物学实验或-20℃保存。 2.2.2电泳目的片段的回收 利用多功能纯化试剂盒(离心柱型)(由北京百泰克生物技术有限公司生产)进行 凝胶回收,操作步骤如下: 1)紫外灯下用干净,锋利的手术刀,将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶切下,放 入1.5或2.0mL离心管中,此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶,尽量减小凝胶 体积,提高DNA回收率; 2)称重胶块质量,按1:3的比例(凝胶质量毫克数:融胶液体积微升数)加入Extraction B 3)于恒温水浴或金属浴中50℃温育,一般温育时间为10min,温育过程中每隔2-3min 混匀一次,直到凝胶融化; 4)按1:1的比例(凝胶质量毫克数:异丙醇体积微升数)加入异丙醇,并混合均匀。 如果DNA片段大于500bp,而小于4kb时,不需要加异丙醇; 5)将混合液全部转移到Spin column内,于6000rpm离心1min,并弃去接液管内液体; 6)向Spin column内加500μL Extraction Buffer,于12000rpm离心30-60sec,并弃去接 液管内液体; 7)向Spin column内加750μL Wash Buffer,于12000rpm离心30-60sec,并弃去接液 管内液体; 8)再次于12000rpm离心1min,然后将Spin column转移到无菌的1.5mL离心管中; 20 9)向Spin column内加50μL Elution Buffer、水或TE溶液,并于室温静置1 10)于12000rpm离心1min,微量离心管内溶液中含有目的DNA片段。 2.2.3 DNA片段与载体的连接 2.2.3.1 DNA片段与克隆载体的连接 选用pMD18-T克隆载体,连接体系如下: pMD18-T vector 1μL PCR产物 4μL Ligation buffer 5μL total 10μL 混匀后16℃连接过夜,取2μL进行转化。 2.2.3.2 DNA片段与表达载体的连接 选用pZP211表达载体,根据载体的设计,选用合适的酶切位点切割载体和片段后, 然后进行连接,连接体系如下: pZP211 载体片段 约 0.03pmol 目的片段 约 0.3pmol 10×T4 DNA ligase 1μL 10×T4 DNA ligase buffer 2μL 总体积 up to 20μL 混匀后16℃连接过夜,取2μL进行转化。 2.2.4大肠杆菌感受态细胞制备 1)从-80℃取出冻存的DH5α细胞,待其稍微融化后取1μL加入到3mL LB液体培养 基中,37℃振荡培养过夜(200rpm); 2)取2mL培养液加入到50mL LB中,37℃振荡培养,直到OD600=0.4-0.6,培养时间 大约2-4h,当培养液变浑浊时开始测定OD600; 3)4600rpm,4℃,离心5min,轻轻倒掉上清,用10mL(1/5体积)预冷的0.1M MgCl2 悬浮细胞; 21 4)4600rpm,4℃,离心5min,轻轻倒掉上清,用25mL(1/5体积)预冷的0.1M CaCl2 悬浮细胞,冰浴中放置20 5)4600rpm,4℃,离心5min,轻轻倒掉上清,用5mL预冷的0.1M CaCl2(含甘油 0.5mL)悬浮细胞,分装,每管中200μL或50μL,-80℃保存。 2.2.5大肠杆菌感受态细胞的转化 1)准备LB/Amp/IPTG/X-gal固体培养基(每板涂浓度为50mg/mL的IPTG溶液和 20mg/mL的X-gal各40μL,室温下放置2-3h); 2)从-80℃冰柜中取出感受态细胞,冰浴中融化。在无菌的1.5mLEppendorf中加入 2μL连接产物,其中一管加入2μLH2O作为对照。取50μL感受态细胞与连接产物轻轻混匀, 冰浴中放置20 3)42℃热激90sec,然后立即冰浴2min,加入950μLLB液体培养基(不含Amp), 37℃摇床振荡培养1.5h(150rpm); 4)离心1min(rpm),沉淀用100μLLB回溶。取适量涂于培养基上,37℃ 倒置培养12-20h,有的菌落为白色,有的变为蓝色,选取白色菌落,提取质粒DNA,做 酶切或PCR鉴定。 2.2.6根癌农杆菌LBA4404/GV3101感受态细胞的制备 1)从-80℃冰箱中取出所要的菌种,在冰浴中融化。在附加利福平的固体YEP培养 基上划线,以便挑单菌落所用; 2)挑取单菌落LBA4404/GV3101,接种于5mL附加有50mg/L的利福平的YEP液体培 养基中,28℃,200rpm,过夜培养; 3)取2mL培养物至液体YEP培养基中,继续培养至OD600为0.5左右; 4)将培养物冰浴30min,4℃,5000rpm,离心5min,弃上清; 5)用10mL0.1mol/L冷的NaCl悬浮菌体;5000rpm,4℃,离心5 6)弃上清,用1mL20mmol/L冷的CaCl2悬浮,分装成50μL/管,液氮中速冻后,-80℃ 保存。 2.2.7冻融法转化农杆菌 1)冰上融化农杆菌LBA4404/GV3101感受态细胞; 22 2)加入3μL带有目的片段的pCAMBIA1300质粒DNA,冰冻30min,液氮中冷冻1min, 然后在37℃水浴5 3)加入950μL无抗生素的YEP培养基,28℃,200rpm/min,振荡培养4h; 4)10000rpm离心1min以浓缩菌液,用100μLYEP回溶菌体; 5)将回溶后的菌体涂于附加50mg/L壮观霉素的固体YEP培养基上,28℃下培养 2-3d。酶切或PCR检测阳性菌落。
4.7、本课题研究目的和意义
1.2.1 国外燃料乙醇生产现状1.2.1 国外燃料乙醇生产现状 燃料乙醇实现工业化生产始于巴西,并且技术相对成熟,燃料乙醇已经是巴西工业生产中不可 或缺的能源之一。巴西是个拥有 1.85 亿人口的国家,全国加油站可供选择汽油、乙醇或优质汽油。 各种汽油都是至少 20%的混合型汽油。巴西发展燃料乙醇首先是基于国内石油资源匮乏方面的考虑, 另外一个重要的方面是国内盛产甘蔗,农业资源相对丰富,为了减少能源的对外依赖程度,有效促进 本国的经济发展,巴西通过立法确立了用燃料乙醇替代汽油的发展方向。巴西是世界上最大的酒精生 产国和消费国,有着丰富的甘蔗资源,使得酒精生产成本很低。其酒精生产能力达 120 万吨 美国也是燃料乙醇的主要生产国,同时把燃料乙醇产业化也是早在上个世纪 70 年代就开始了。 美国 2000 年燃料乙醇的产量为 500 万吨,其中 92%的燃料乙醇混合到汽油中。在未来的十年内, 美国的燃料乙醇产量会增加三倍,燃料乙醇的生产和使用,给美国经济、农业生产和人民生活等多 方面带来了极大的益处。美国发展燃料乙醇出于两个方面的考虑,一是国家的能源安全,另外一个 比较重要的考虑因素便是出于环境的考虑。近年,美国总统布什签署了一项新的能源法案,其中很重 要的一项内容是可再生燃料标淮(RFS)。RFS 要求在汽油总组成中加入特定数量的可再生燃料,而且 3 每年将有递增。燃料乙醇产业对于减少美国国内原油进口依赖,增加农业收入和就业,削减贸易赤 字,以及降低农业生产成本等方面发挥了重要的作用,越来越受到重视。作为再生能源,生物能源 (43%)是世界上仅次于水能 (51%)的第二大能源。从上个世纪 70 年代中期开始,利用生物技 术和可再生资源进行燃料乙醇的工业化生产,并以此作为石油能源的替代物成为各国的研究热点, 北美和巴西走在前列,而且在未来四分之一世纪仍然保持着大规模燃料乙醇生产竞争力. 在其它一些发达国家如欧盟、日本、加拿大,发展中国家如泰国等,都已将燃料乙醇作为重点 发展项目。RFS 要求在汽油总组成中加入特定数量的可再生燃料,而且每年将有递增。日本作为世界 上第二大的汽油消费国,在全球变暖的压力下,正考虑引入一项用酒精掺合汽油来减少汽车尾气污 染的政策。在欧洲,德国已成为世界"生物柴油"最大生产国。"生物柴油"是植物经过高温处理后 形成的"生物液体",是一种高效,清洁的新型燃料。墨西哥制糖业也正在探索使用剩余搪和糖蜜生 产燃料酒精的研究。在其它一些发达国家如欧盟、加拿大,发展中国家如泰国等,都已将燃料乙醇 作为重点发展项目。
4.8、本课题研究的目的和意义
近年来,随着能源危机的加剧和对环境保护意识的不断增强,研究和寻找石油能源的替代品成 为世界技术开发领域亟待攻克的重要课题之一。生物燃料是一种清洁可再生能源,在当前最具可行性 和实用性的生物燃料包括-生物柴油和生物乙醇,随着石油价格的不断飙升,生物燃料越来越受到人 们的重视.可再生能源既解决能源替代问题,又为农业资源,自然资源提供一个新的发展空间,可以有 效的推动农业产业化进程,创造巨大的经济价值,社会价值和生态价值。 作为一种新兴能源,生物燃料的研究历时已久,世界各大发达农业国都争相把希望的目光投放 到这个领域,通过各国科学家的艰苦探索和研究,纷纷取得了阶段性的成绩.2005年,世界生物燃料的 总产量为 462 亿 L,其中美洲占 74.4%,中国产量为 38 亿 L,印度为 17 亿 L,中国是一个农业大国,同时 也是一个人口大国,发展生物燃料产业,能够减少原油进口依赖,增加农业收入和就业,降低农业生产 成本.然而我国的生物燃料生产技术相对落后,能耗、物耗和水耗大大超过国际先进水平,同时生物燃 料的生产规模不大,大型、超大型的生产企业由于受到相关技术的约束而严重滞后,这就在很大程度 上限制了我国在生物燃料的生产能力。 作为一种未来理想的能源替代物,被美称为 21 世纪"绿色能源"的燃料乙醇,因其不仅可以 作为一种性能优良的可再生燃料,同时它还可以作为一种很好的燃油品质改善剂,受到人们极大的 青睐,预计今后世界对燃料乙醇的需求将越来越大。燃料乙醇也称生物燃料、燃料酒精、汽油醇、 乙醇汽油等,是以玉米、木薯、小麦等谷物类物料或植物秸秆、糖蜜等原料经过蒸煮发酵,进一步 脱水处理加上适量的变性剂后,得变性燃料乙醇[10]。 (1)农作物秸秆及其产量 所谓农作物秸秆是指各类作物在获取其主要农产品(籽实)后所剩留下来的地上部分的茎叶或 藤蔓;主要是禾本科作物秸秆和豆科作物秸秆。在我国,属于禾本科作物的秸秆主要有小麦秸、稻 草、玉米秸、大麦秸、高粱秸、养麦秸、黍桔、谷草(粟轩)等;属于豆科作物的带秆或藤蔓荚壳) 主要有黄豆秆、蚕豆秆、豌豆秆、花生藤等。此外,还有红薯,马铃薯和瓜类藤蔓等。 农作物秸秆是世界上最为丰富的物质之一。据统计,全世界每年秸秆产量约为 29 亿多吨,其中 小麦秸占 21%,稻草秸 19%,大麦秸 10%,玉米秸 35%,黑麦秸 2%,燕麦秸 3%。谷草(粟秆) 秸 5%,高粱秸 5%。小麦秸以亚洲、欧洲和北美洲的产量为最高。稻秆以亚洲为最多,大麦桔以欧 洲为最丰富,亚洲和北美训次之,玉米秸以北美洲为最多,亚洲和欧洲次之,南美洲和非洲较少。 又据报道,全世界作物秸秆的总产量为 2941 亿吨,其中非洲为 36 亿吨占 8.02%,北美洲 8 19 亿 吨,占 27.85%,南美洲 1.83 亿吨,占 6 22%,亚洲 11.14 亿吨,占 37.88%,欧洲 40 亿吨。占 13.6 %,大洋洲 0.36 吨,占 1.22%,其他地区 1.53 亿吨,占 5.2%[10]。 (2)制约植物秸秆燃料乙醇生产的关键问题 6 国内外对利用生物质尤其是秸秆纤维来生产燃料乙醇进行了大量的研究,但该技术一直未能在 规模生产中推广应用,究其根本,主要是因为现阶段的技术中还存在着严重制约秸秆纤维燃料乙醇 生产的关键问题。 秸秆的化学组成中,纤维素、半纤维素和木质素含量最高,三种组分的总和(也称粗纤维)约占 秸秆总重量的 80%,其中纤维素含量一般为 30-35%,半纤维素含量一般为 25-30%,木质素的含量 一般为 10%左右。纤维素是不溶于水的均一聚糖,由葡萄糖基通过 β-1,4 葡萄糖苷键连接起来的链 状高分子化合物。半纤维素是由两种或两种以上的单糖基组成的不均一聚糖,大部分带有短的侧链, 构成半纤维素的糖基主要有木糖、葡萄糖、甘露糖,阿拉伯糖,半乳糖及它们的各种衍生物,秸秆 的半纤维素组成主要是聚阿拉伯糖基葡萄糖醛酸木糖。木质素是一类由苯基丙烷结构单元通过碳一 碳键和醚键连接而成的具有三度空间结构的高分子聚合物。纤维素、半纤维素和木质素这三类物质 都是高分子化合物,有很高的稳定性,不经处理或降解很难被动物直接吸收利用。 在秸秆中,纤维素、半纤维素和木质素等物质共同形成细胞壁结构。在细胞壁结构中,纤维素 分子链有规则地排列聚集成原细纤维,原细纤维进一步组成微细纤维,微细纤维组成细小纤维,原 细纤维之间填充着半纤维素,微细纤维周围包裹着木质素和半纤维素,且木质素和半纤维素间存在 化学连接键。这样在细胞壁中纤维素以微细纤维形式构成纤维素骨架,木质素和半纤维素以共价键 方式交联在一起,形成三维结构,把微纤维束镶嵌在里面,形成复杂的难以降解的细胞壁结构。细 胞壁的外边,即两个细胞之间的胞间层,主要由木质素组成,少量为果胶,把两个细胞粘接在一起 [11]。 植物秸秆化学结构复杂, 纤维素、半纤维素不但被木质素包裹, 而且半纤维素部分共价和木质 素结合, 纤维素具有高度有序晶体结构, 只有经过预处理,才能解除木质素对纤维素的包裹,从而把纤 维素暴露出来,利于酶水解及后续发酵过程,含纤维物料的预处理对其最终转化成低成本的糖以及其 他的有用产品至关重要。最优化的预处理方式是那些既经过物理的也经过化学的操作,同时在这一 反应过程中对原料的损伤和营养价值的损失要求达到最小。并且能得到很好的酶作用的底物减少了 材料的损失[12]。 在生产燃料乙醇时,原料中的纤维素和半纤维素可以在酸或酶的作用下转化成可发酵性糖类, 并经微生物发酵产生燃料乙醇。但具有特殊结构的木质素很难分解,同时也无法形成可发酵性糖类, 因此利用秸秆生产燃料乙醇实质上就是利用其中的纤维素和半纤维素成分。但由于纤维素、半纤维 素和木质素这 3 种成分均呈不连续的层状结构,彼此豁结又互相间断,木质素和半纤维素是微细纤 维之间的填充剂和勃结剂的特殊结构;同时依据波尔屯模型可知,木质素虽对纤维素分解物质(如酶) 反应没有阻碍作用,但它阻止纤维素分解物对纤维素的进攻,因而对秸秆进行预处理,除去木质素, 或破坏木质素层,尽量使纤维素结晶度降低,提高纤维素的转化率是生物质燃料乙醇生产的关键步 骤。 (3)秸秆前处理优化方式 植物秸秆结构复杂、纤维素、半纤维素不但被木质素包裹,而且半纤维素部分共价和木质素结 合、纤维素具有高度有序晶体结构,因此必须经过预处理,使得纤维素、半纤维素、木质素分离开, 切断它们的氢键,破坏晶体结构,降低聚合度。常见预处理方法有以下几种目前植物秸秆的前处理 方法很多,球磨、高温水汽爆破法, 低温氨爆破法, 常温二氧化碳爆破法, 电子射线、γ射线 、稀 酸处理法等。 然而传统的物理化学方法对秸秆进行的处理一方面成本较高,另一方面其处理效果不佳。使用 超剪切式粉碎机对经过蒸汽爆破法处理过的秸秆进行超细粉碎处理参数决定了在短时间内获得相对 大量的超细粉碎产品,因此提高了它在经济上的可行性。蒸汽爆破法处理过的秸秆中的酶的水解、 化学成分、纤维特性以及多细胞组织的粉碎以及粉碎蒸汽爆破法处理过的秸秆残渣显示出大的差异 性。超细粉碎产品的酶的水解的酶的水解获得了最高的酶的水解率和产出最多的糖份,同时超细粉 7 碎产品的残渣的糖含量甚至低于未处理的秸秆的糖含量。结合低蒸汽爆破和超细粉碎方法对秸秆进 行预处理是对秸秆进行分馏最容易处理的方法。 (4) 研究秸秆超大量湿法粉碎技术的意义 我国植物秸秆年产量大约5亿吨,玉米秸秆主要由植物细胞壁组成,细胞壁基本组成是纤维素、 半纤维素、木质素,纤维素和半纤维素被木质素层层包裹,纤维素是一种直链多糖,多个分子平行 排列成丝状不溶性微小纤维,而半纤维素主要是木糖以及少量阿拉伯糖,半乳糖、甘露糖组成,而 木质素是以苯丙烷及其衍生物为基本单位构成的高分子芳香族化合物,半纤维素较易水解为五碳糖, 纤维素较困难水解为六碳糖,而木质素一般作为燃料。 用可再生资源植物秸秆为原料生产乙醇燃料,对缓解我国能源紧缺、减少环境污染和解决"三 农"问题都具有重大的现实意义和战略意义。在乙醇燃料生产中,采用新型湿法粉碎工艺对生物质 原料植物秸秆进行超大量湿法粉碎,不仅可优化发酵工艺、减少粉尘污染,而且可提高产品得率和 降低成本。但目前所用的湿法粉碎设备(诸如砂磨等)均不能适应生产需求,尤其植物秸秆这一具 有强韧性纤维状物料的粉碎细度达不到要求,从而造成发酵系统堵塞和得率降低等多种问题的发生。 山东九九有限公司采用针磨、砂磨和胶体磨对玉米湿法粉碎,由于单台设备处理量小、玉米皮渣、 植物秸秆纤维破碎粒度大,给正常生产带来了很大的困难;河南天冠集团上海研发机构花巨资从德 国购进植物秸秆粉碎装备,效果并不明显,同时处理量也远远达不到工业化大生产的要求。吉林天 河集团、安徽丰原集团等正在建设年产 30 万吨乙醇燃料生产线,所用湿法粉碎设备均拟从国外进口, 这必将会带来易损件供货困难和成本过高的问题。 研究可连续运行、单台时处理 70m3以上超大量植物纤维类物料湿法粉碎装备,来满足乙醇燃料 生产需要,是企业集团一致愿望,也是研究部门重大课题。解决这一问题,不仅对乙醇燃料生产项 目具有积极促进作用,而且必将对味精生产中大米的湿法粉碎、植物秸秆纤维物料的湿法粉碎等农 产品深加工项目提供技术装备的有力支持。其它行业,如造纸、油漆、化工等新材料行业,都存在 大量的纤维超细粉碎需求。本课题在植物秸秆超细粉碎关键技术与装备方面的研究方法、研究成果 将对上述这些行业能提供一定的借鉴和指导作用。
4.9、目的基因的克隆
根据 NCBI 公布的 α-淀粉酶和糖化酶基因序列,设计引物 amy-PORFup 与 amy-PORFdown 以及 ga-PORFup 与 ga-PORFdown,分别以黑曲霉和米曲霉的 cDNA 为模 板进行 PCR 反应,所扩增序列均包含基因自身携带的信号肽序列,大小总长分别为 1500 bp(amy)和 1923 bp(ga)。扩增产物经 1.0%琼脂糖凝胶电泳分析,分别在 1.5 kb 和 1.9 kb 处 有明显特异性扩增条带,符合预期目的片段大小(图 2-3)。 图 2-3 黑曲霉 ga 与米曲霉 amy 基因的 PCR 扩增图 Fig.2-3 PCR amplification results of ga and amy genes M:Marker DL2000 1:黑曲霉 ga 基因片段,全长 1923 bp 2:米曲霉 amy 基因片段,全长 1500 bp 19 将扩增的目的片段经纯化试剂盒回收后,分别克隆进 pMD18-T 载体,转化大肠杆菌 感受态细胞。用菌落 PCR 筛选转化子(图 2-4),并提取质粒 pMT-amy 与 pMT-ga 进行限 制性内切酶酶切鉴定。 图 2-4 菌落 PCR 鉴定转化子 (a 以 amy-PORFup 与 amy-PORFdown 为引物;b 以 ga-PORFup 与 ga-PORFdown 为引物) Fig.2-4 Identification of transformants by colony PCR M:Marker 2000DL 1:阴性对照(未添加任何模板) 2:阳性对照(以 PCR 产物为模板) 3:阳性重组子 质粒pMT-amy经BamH I与Spe I双酶切,得到2692 bp与1500 bp两条带,质粒pMT-ga 经 Bgl II 与 Spe I 双酶切,得到 2692 bp 与 1923 bp 两条带,表明目的片段均已成功连入 pMD18-T 载体(图 2-5)。 20 图 2-5 质粒 pMT-amy(a)与 pMT-ga(b)的酶切鉴定图 Fig.2-5 Restriction endonuclease analyses of pMT-amy and pMT-ga M:Marker 15000DL a1:BamH I 与 Spe I 双酶切 pMT-amy(2692bp、1500bp) b1-3:Bgl II 与 Spe I 双酶切 pMT-ga(2692bp、1923其中 2 号与 3 号为正确质粒) 将验证正确的阳性克隆测序结果与 GenBank 数据库(NCBI)公布的 amy、ga 核苷酸 序列进行比对。分析结果显示,所得目的片段分别与登录号 XM_、 XM_ (4980642 gla A)的核苷酸序列同源性达到 100%与 99%(图 2-6)。本实验 室所选用黑曲霉菌株的 ga 序列(三个克隆测序结果一致)与 GenBank 上已经发表的登录 号为 XM_ 的黑曲霉糖化酶基因序列有一个碱基的差异。将该基因命名为 glaA1, 并提交其 CDS 序列到 GenBank 进行注册,获得注册号 HQ848664。 21 22 图 2-6 glaA1 与 glaA(gene ID:4980642)序列同源性比对图 Fig.2-6 Sequence homology analyse of gla A1 and gla A 23
4.10、研究目的及意义
本研究旨在应用ET技术评价不同饮酒量及不同饮酒年限对血管内皮功 能的影响,为及早发现血管内皮功能的异常、防治动脉粥样硬化、提高人 们保健意识等具有深远的意义,亦有利于减少和控制心脑血管疾病的发病 率和死亡率。 6 第 3 章 资料与方法
4.11、目的基因的 PCR 扩增
本课题中所用到的相关基因的 PCR 扩增条件和体系如表 2.5 和 2.6 所示: 表 2.5 本研究中所用的 PCR 体系 Table 2.5 Reaction mixture in this investigation 目的基因 ddH2O 10×Buffer dNTP 模板 引物DNA 聚合酶 GPD2 upG1F、G1R 各 0.5 stream37.5 μL 5 μL 4 μL酒精酵母染色体 2 μLμL0.5 μL GPD2 down stream37.5 μL 5 μL 4 μL酒精酵母染色G2F、G2R 各 0.5 体 2 μLμL0.5 μL PGK1 37.5 μL 5 μL 4 μL质粒 pMGKRPGK1F、PGK1R 2 μL各 0.5 μL0.5 μL HyBR 37.5 μL 5 μL 4 μL质粒 pSH47-HyrF、HyrR 各 HyBR 2 μL0.5 μL0.5 μL POS5 37.5 μL 5 μL 4 μL酒精酵母染色POS5F、POS5R 体 2 μL各 0.5 μL0.5 μL FPS1 up stream 37.5 μL 5 μL 4 μL酒精酵母染色FP1F、FP1R 各 体 2 μL0.5 μL0.5 μL FPS1 down stream37.5 μL 5 μL 4 μL酒精酵母染色FP2F、FP2R 各 体 2 μL0.5 μL0.5 μL Bler37.5 μL 5 μL 4 μL质粒 pGAPZABleF、BleR 各 0.5 2 μLμL0.5 μL 表 2.6 本研究中目的基因的扩增条件 Table 2.6 Reaction conditions used in this investigation GPD2GPD2FPS1FPS1 程序updownPGK1 HyBR POS5updownBler streamstreamstreamstream 预变性 95 ℃5 min 5 min 5 min 5 min 5 min 5 min 5 min 5 min 变性 94 ℃ 30 s 30 s 30 s 30 s 30 s 30 s 30 s 30 s 退火 1 min 53 ℃ 53 ℃ 52 ℃ 53 ℃ 53 ℃ 52 ℃ 52 ℃ 52 ℃ 1 延伸 72 ℃ 20 s 20 s 2 min 1 min10 s 1 min10 s 20 s 20 smin15 s 循环数 30 30 30 30 30 30 30 30 14
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