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两种抗原测定乙肝患者血清中前S1抗体的比较分析
作者： 孙淑丰
【关键词】& 前S1抗体
【摘要】 目的 比较前S1合成肽和基因表达前S1蛋白用于临床检测乙型肝炎病人血清中前S1抗体的价值。方法 从PUC18-HBV双体质粒中酶切前S1基因片段，克隆入pMAL-cRI表达载体，在大肠杆菌中融合表达。采用兔抗前S1抗体和乙型肝炎患者血清中的前S1抗体分析蛋白抗原检测前S1抗体的特异度和精密度。分别以前S1合成肽和基因表达S1蛋白为抗原制备ELISA试剂平行测定189份乙型肝炎患者血清中前S1抗体。结果 基因表达前S1蛋白为抗原测定前S1抗体方法的特异性和精密度均比较高，变异系数小于0.15。用前S1合成肽可以抑制基因表达前S1蛋白与其免疫血清及前S1抗体阳性血清之间的特异性结合。两种抗原测定乙型肝炎患者血清中前S1抗体的阳性率分别为33.33%和34.92%，差异无显著性（P>0.05），符合率为83.6%，测定结果的S/N值呈正相关。前S1合成肽测定前S1抗体的成本是基因表达前S1蛋白的12.5倍。结论 两种抗原均可用于临床检测前S1抗体，基因表达前S1蛋白检测成本更低。
关键词乙型肝炎 前S1合成肽 基因表达前S1蛋白 前S1抗体
Comparison and analysis of detecting anti-PreS1antibody
with two types antigen in the sera of hepatitis B patients
Sun Shufeng，Feng Fumin，Mi Zhibao，et al.
North China Coal Medical College，Tangshan，Hebei063000.
【Abstract】 Objective To study evaluation of PreS1synthetic peptide and gene expression PreS1protein for clinical survery of anti-PreS1antibody in the hepatitis B patient serum.Methods Hepatitis B virus PreS1DNA fragment from plamid PUC18-HBV-dimer was obtained by digestion with restriction endonuckease，and thenwas inˉserted into pMAL-cRI plasmid.The PreS1sequence was overespressed in E.coli as a fusion protein with maltose-binding protein.The specificity and precision were analyzed by using anti-PreS1antibody from rabbit and hepatitis B patients.Anti-PreS1antibody was detected by ELISA kit with PreS1synthetic peptide and gene expression PreS1protein in189hepatitis B patients’sera respectively.ResultsThe specificity and precision of the method that detectˉing anti-PreS1antibodywith gene expression PreS1protein was high.Using PreS1synthetic peptide could inhibit in combination gene expression PreS1protein with immune rabbit serum and anti-PreS1antibody positive serum.The coefficient of variation was under0.15.The positive rates of the two methods were33.33%and34.92%respectiveˉly.There is not asignificant difference between them（P>0.05），and their coincident rate was83.6%.The S/N valˉue was positive correlation by logarithm.The cost of detecting anti-PreS1antibody by using PreS1synthetic peptide was12.5times as much as by using gene expression PreS1protein.Conclusion Both PreS1synthetic peptide and gene expression PreS1protein could be used to detect anti-PreS1antibody in clinic.The cost of gene expression PreS1protein was less for detecting anti-PreS1antibody.
Key words hepatitis B PreS1synthetic peptide gene expression PreS1protein PreS1antibody
乙型肝炎病毒前S1蛋白作为乙型肝炎的一个传染性指标已经被许多学者的研究结果证实 ［1，2］ 。前S1抗原和抗体作为一对指标在乙型肝炎的早期诊断、治疗效果观察和预后估计等方面都具有十分重要的意义 ［3］ ，含有前S1的乙型肝炎疫苗免疫原性更强 ［4］ 。目前，国内前S1抗原和抗体检测均采用ELISA法，而用来检测前S1抗体的抗原有两种:前S1合成肽和基因表达前S1蛋白，用前S1合成肽检测前S1抗体已经被广泛应用 ［5，6］ ，虽然多数合成肽均有20～30个氨基酸，但也有9个氨基酸的研究报道 ［7］ ，基因表达前S1蛋白包括前S1全蛋白表达 ［8，9］ 和第21～47氨基酸及第1～42氨基酸的短肽表达 ［10，11］ 。本文将前S1蛋白第21～47氨基酸合成肽抗原和前S1蛋白全基因表达抗原测定前S1抗体的结果进行了比较，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 血清标本 189份血清来自年3～5月某传染病医院确诊的乙型肝炎患者。
1.2 主要试剂 包被液:0.05M的碳酸盐缓冲液，pH9.6;洗涤液:含0.5%吐温20的0.02M磷酸盐缓冲液，pH7.2;稀释液:含10%小牛血清的洗涤液;封闭液:含1%脱脂奶粉的洗涤液;酶标记抗体:辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG和羊抗人IgG购自华美生物工程有限公司;显色剂:TMB底物和催化剂;终止剂:2M硫酸。
1.3 基因表达前S1蛋白 根据已知的前S1基因序列位点，对PUC18-HBVdimer质粒先用BgⅠⅡ酶切，得到2.329kb片段，经Mung Bean酶削平后再用EcoRⅠ酶切，回收0.324kb的前S1基因片段。pMAL-cRI表达载体经XmnⅠ和EcoRⅠ双酶切，T4DNA连接酶连接载体和前S1基因，构造pMAL-cRI-PreS1表达质粒。转化E.coli JM109，以IPTG诱导前S1蛋白表达，表达蛋白以前S1+甘露糖结合蛋白的融合蛋白形式存在。Page电泳发现54kD的表达蛋白，表达量占10%～15%，经Western Blot实验证实表达蛋白具有特异性。经亲和层析柱纯化，纯化的前S1蛋白用于前S1抗体检测。
1.4 基因表达前S1蛋白检测前S1抗体方法 纯化的前S1蛋白以1μg/孔包被酶联板，4℃过夜。以洗涤液洗板3次，每孔加入150μl封闭液，37℃孵育1h;重复封闭一次。拍干酶联板后加入1:10稀释的待测血清，同时设置2个阳性对照孔、3个阴性对照孔和1个空白对照孔，37℃孵育1h。洗板6次，加入1:1000稀释的酶标抗体（空白孔不加），37℃孵育30min。洗板5次，加入显色剂，置37℃避光10min，加入终止液，酶标仪上以空白孔调零读取各孔的吸光度值。阴性对照孔吸光度值不超过0.10且阳性对照孔吸光度值超过阴性对照孔10倍以上，确认测定结果有效。测定孔吸光度值≥2.1倍阴性对照孔平均值判为阳性。
1.5 前S1合成肽及其测定前S1抗体方法 前S1的21～47aa序列（PLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNP）肽段在430A型自动氨基酸合成仪上合成，HPLC方法纯化，纯度大于95%。测定前S1抗体方法及其特异性和精密度分析见参考文献 ［6］ 。
2.1 基因表达前S1蛋白测定前S1抗体方法的特异性和精密度
2.1.1 特异性 分别用前S1合成肽和纯化基因表达前S1蛋白包被酶联板，用间接ELISA方法测定前S1合成肽免疫兔血清及急性乙型肝炎患者恢复期血清结果为阳性。用过量前S1合成肽和基因表达前S1蛋白中和免疫兔血清及前S1抗体阳性患者血清后可以阻断前S1合成肽和基因表达前S1蛋白与免疫兔血清和前S1抗体阳性患者血清的反应。对前S1合成肽的阻断率分别93.4%和84.7%，对前S1蛋白的阻断率分别为79.3%和72.2%。
2.1.2 精密度 用批内变异和批间变异来衡量，选择高值（吸光度≈1.0）、中值（吸光度≈0.6）和低值（吸光度≈0.2）前S1抗体阳性的乙型肝炎患者血清各1份，用前S1合成肽测定11孔的批内变异系数分别为0.064、0.113和0.121，用表达蛋白测定10孔的变异系数分别为0.681、0.105和0.136。将上述3份血清在不同时间用前S1合成肽测定8次的批间变异系数分别为0.077、0.123和0.146，用表达蛋白测定10次的变异系数分别为0.884、0.972和0.158。基本不超过0.15。
2.2 两种抗原检测前S1抗体的结果比较 在两种抗原检测抗体的特异性和精密度相似的前提下，分别用前S1合成肽和基因表达前S1蛋白包被酶联板，同时测定189份乙型肝炎患者血清。对两种抗原检测前S1抗体的数据进行定性比较，结果见表1和表2。
表1 两种抗原测定前S1抗体的阳性率比较
用配对χ 2 检验方法分析两种抗原测定前S1抗体的一致性，发现两种测定结果存在联系，但无差别（表2）。
表2 两种抗原测定前S1抗体的检出结果比较基因
注:两种方法检测结果的关联分析，χ 2 =76.375，P0.05 从表1看出，参照卫生统计学处理方法 ［12］ ，两种抗原检测189份乙肝患者血清中前S1抗体的阳性率无差别;进行配对分析发现，两种方法的检测结果具有关联性，无差别。
2.3 两种抗原测定前S1抗体结果的相关性 在定性分析的基础上，利用两种抗原检测前S1抗体的数值进行定量比较。由图1可见，两种抗原测定189份乙型肝炎患者血清中前S1抗体的S/N经对数转换后呈正相关（r=0.6199，P<0.001）。图1 两种抗原测定前S1抗体结果S/N散点图
2.4 两种抗原测定前S1抗体的成本比较 前S1合成肽的长度为27个氨基酸，这种线性多肽可用氨基酸合成仪进行合成，成本较高，每人份需要0.25元，而基因表达前S1蛋白是先将前S1基因克隆入表达载体中，再转入大肠杆菌体内进行基因表达并收获表达蛋白，成本较低，每人份只需0.02元，前者成本是后者的12.5倍。
研究结果表明，基因表达前S1蛋白测定前S1抗体的方法具有较好的特异性、可靠的精密度。在189份乙型肝炎患者血清中，用前S1合成肽和基因表达前S1蛋白检测前S1抗体的阳性率分别为33.33%和34.92%。从结构上看，前S1抗原决定簇为线性决定簇 ［13］ ，使得用合成肽模拟前S1蛋白成为可能，而且可合成肽模拟相应蛋白检测抗体已经广泛应用于各种传染病的实验诊断中。从检测结果可以看出，两种抗原的检测结果并非完全符合。在189份血清中，单纯前S1合成肽测定为阳性者14份，单纯基因表达前S1蛋白测定阳性者17份，造成两者不符合的原因可能是:（1）与两者的肽链长度有关，前S1基因为线性决定簇，蛋白质的空间结构对抗原性影响不大，肽链越长，抗原决定簇越多，对抗体捕获率越高。基因表达前S1蛋白的肽链长度为119个氨基酸，而前S1合成肽大多为30个
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论文写作技巧体液免疫检测法(assay of humoral immunity)，检测功能的技术。分为体外检测和体内检测。体外体液免疫检测法包括、中各种可溶性免疫因素测定，体内检测为体液免疫测定技术。
包括两大类：抗原抗体反应和可溶性免疫测定。
由于主要存在于中，检测时需要自中分离清为（待检材料），故又名为试验。与具有高度特异性（、针对性），因此只要其中的一种为已知，即可检测另一方。如用已知抗原检测未知抗体，或用已知抗体来鉴定、检测未知抗原。
抗原与抗体在体外反应，可因抗原的性状不同或参与反应的成分不同而表现各种反应现象，如、沉淀、以及中和反应等。此四种反应类型即所谓“经典”的血清学反应。在此基础上进行技术改良，又衍生出很多快速、敏感及微量的抗原抗体反应，在实际应用中已极为广泛。
在血清学反应的基础上，近代技术中又迅速地建立了标记技术，包括标记技术、免疫技术、标记技术、－技术及发光免疫技术。
①。即（如完整的、、及悬液等）与相应抗体结合后，在一定条件下出现肉眼看见的凝集团块或颗粒。包括直接凝集反应、间接凝集反应及反应等。
直接凝集反应即颗粒性抗原与相应抗体在有电解质存在的适合条件下直接结合，出现的凝集现象。这类反应常用于测定、的鉴定等，如诊断或的维达尔（曾译肥达）氏试验等。
间接凝集反应是在直接凝集反应的基础上衍生而来。即将（或抗体）先吸附于一种与本免疫试验无关的、有一定体积的颗粒状物质(称为载体)表面，然后再与相应的抗体（或抗原）作用，在电解质存在的适宜条件下发生凝集。可供做载体用的有人“ O”型红细胞或某些动物（如绵羊、兔等）的红细胞及某些隋性颗粒，如乳胶颗粒或等。由于载体颗粒增大了可溶性抗原的反应面积，当颗粒上吸附的抗原与微量抗体相结合后，就足以出现肉眼可见的凝聚反应，因此其敏感性比直接凝集要高出数倍至数十倍，可以测定克水平。另外，吸附在载体上的抗原与相应抗体发生特异性结合时使载体被动地凝集在一起，故又称为。将抗原吸附于载体之上，然后再与相应抗体相结合出现凝集反应者称为正向间接凝集反应，可用于测定某些的相应抗体（如的粪抗体）或检测某些的(如、性因子、抗抗体等)。反之，将抗体吸附于颗粒载体之上与相应抗原结合，则称为反向间接凝集反应。有高度敏感性和特异性，可用于某些、的早期诊断，检测()、、、、、布鲁斯氏等微量抗原。若将可溶性抗原先与抗体反应，然后再检测抗体能否与吸附于颗粒载体上的抗原发生凝集反应，如果抗体已与先加入的抗原结合，那么就没有或仅剩少量抗体再与载体上的抗原结合，因此不出现凝集反应或反应很微弱，这称为间接，常用来检测可溶性抗原。
抗球蛋白反应又称桥梁凝集反应。用于测定（又称抗体），如G()，是一种极为敏感、可靠的方法。机体接受后除产生完全抗体(抗体长，体积大)外，还能产生不完全抗体（抗体短，体积小），只能与一方结合，而不能同时与另一方抗原决定簇联接，因此不能出现直接可见的凝集反应。库姆斯等首先根据“抗体存在于，球蛋白本身注入异种动物亦是抗原”的原理，把产生不完全抗体的人的正常到异种动物如兔、绵羊等体内，使之产生，将抗球蛋白抗体加到抗原与不完全抗体的中，使其起搭桥作用，就能出现可见的凝集反应。此试验亦称库姆斯氏反应。
库姆斯氏反应可分为直接反应和间接反应。直接库姆斯氏反应是检测在以红细胞为抗原的表面上的不完全抗体（即自身红细胞抗体）最有效的方法之一。利用抗球蛋白为反应。当抗球蛋白抗体与红细胞表面上粘附的不完全抗体结合后，就提供了一个较长的臂（桥梁），使红细胞出现可见的直接凝集现象。本法常用于诊断溶血性疾病和。间接库姆斯氏反应是检测血清中的游离的不完全抗体。将病人血清加入有相应抗原的一定浓度的红细胞悬液中，在一定条件下相互作用，然后加入抗球蛋白试剂。若病人血清中有不完全抗体存在，则红细胞出现可见的凝集反应。本法常用于的判定、血型抗体的检测和鉴定，以及前的血型相溶性试验。
②沉淀反应。指可溶性抗原（如、滤液、细菌浸出液、组织浸出液等）与相应的抗体在有电解质存在的条件下结合，经过一定时间后，形成肉眼可见的白色沉淀物。参加反应的可溶性抗原为、、类脂等，可溶性抗原与相应抗体比较，前者分子小，单位体积内所含的抗原分子多，与抗体结合的总面积大，沉淀物的形成主要通过将抗原分子交叉联接所形成。为了使抗原与抗体之间的比例适合，一般可稀释抗原并以仍可出现沉淀反应的抗原最高稀释度为抗体血清的。
沉淀反应技术由于特异性很强，而被广泛应用于鉴定混合物中分，鉴定菌型，诊断疾病以及在法医上鉴定血迹等。如检查抗体的康氏反应。
沉淀反应主要有环状沉淀反应(对抗原的定性试验)、絮状沉淀反应（测定及等）。目前应用广泛的是扩散试验，可用以测定免疫球蛋白，各组分的含量，分析和鉴定复杂的抗原物质成分，测定抗原、抗体提取后的纯度等。
环状沉淀反应是在细口径的小内先加入已知抗体血清，再将经过适当稀释的待检可溶性抗原沿管壁小心加在抗血清表面，使形成界面清晰的两层。数分钟后，若在两层液面交界处出现白色沉淀环，即为阳性反应。本试验可用于抗原的定性试验，诊断，检测媒介昆虫的嗜血性，测定C，并广泛应用于食品卫生检验、考古及法医等。
琼脂扩散试验为可溶性抗原与相应抗体在含有电解质的半固体（琼脂或）中进行的一种沉淀试验。琼脂在实验中只起网架作用，含水量为99％，可溶性抗原与抗体在其间可以自由扩散，若抗原与抗体相对应，比例合适，在相遇处可形成白色沉淀线，是为阳性反应。沉淀线在凝胶中可长时间保持固定位置并可经后干燥保存。沉淀线（带）对抗原与抗体具有特异的不可透性，而非特异者则否。所以一个沉淀线（带）即代表一种抗原与抗体的沉淀物，因而本试验可对溶液中不同系统进行分析研究。
本试验包括单向、双向琼脂扩散两种基本类型。若结合技术进行定向扩散，可加快扩散速度、提高反应灵敏度，因而又衍生出、火箭电泳、及电泳等。琼脂扩散可在试管、平皿或玻片上进行，一般实验室常采用玻片法。
双向琼脂扩散试验是在含有电解质的半固体琼脂板上，将可溶性抗原和抗体分别加入具有一定距离和孔径的小孔内，使其在一定条件下相互扩散，两者在比例合适处相遇，形成白色沉淀线（带）。当存在多种抗原抗体系统时可出现多条沉淀线，然后可根据沉淀线的数目、位置、形状对抗原抗体系统进行分析。
反应的基本类型有下列几种，当抗原与相应抗体相互扩散即形成一条沉淀线。两种抗原相同时表现为融合沉淀线。两种抗原完全不相同时形成独立的沉淀线，同时两条沉淀线可出现交叉，属非同一性反应。两种抗原有部分相同时，与相应抗体进行扩散后，可形成两条既相互联接又有其中一条多出一小段的沉淀线。抗体与含有多种及部分相同的两种抗原相互扩散后，除形成一条同一性的弧形融合沉淀线外，又形成两条非同一性反应的沉淀线。
沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性，而且与浓度、分子的大小及扩散速度有关。本试验的优点为特异性强，缺点是时间长，灵敏度低。
单向琼脂扩散又称单向环状，是一种定量测定抗原的方法。常用来检测标本中各种免疫球蛋白及血清中各种补体成分的含量。灵敏度高，可对作辅助诊断。
针对琼脂扩散试验的时间长、灵敏度较低的问题，根据有些携带电荷的物质如、、蛋白质等在电场作用下可向相反电荷的移动的原理，建立了免疫电泳技术。常用的有电泳、、对流免疫电泳、火箭电泳、免疫电泳及交叉免疫电泳等。
对流免疫电泳是在双向琼脂扩散的基础上进行电泳。即在含电解质的半固体琼脂板上将抗原抗体分别加入具有一定距离和孔径的小孔内，然后将此琼脂板置于电场下，在一定条件下抗原向阳极移动，抗体在电渗作用下向阴极移动，两者在最适比例处相遇而形成沉淀线。由于电场能限制抗原抗体的自由扩散倾向，使两者只能向一定方向移动，因此提高了试验的灵敏度并缩短时间。本试验常用于检测血清中 (HBsAg)、甲胎蛋白，各类免疫球蛋白的定性和半定量。缺点是无，当待检抗原（血清）中存在两种以上成分时则形成重叠沉淀线造成无法分辨。
火箭电泳又称电泳免疫扩散。是单向免疫扩散和电泳相结合的方法。是一种定量试验。在电场作用下抗原在含有一定量抗体的琼脂板中形成锥形沉淀峰，形似火箭，故名。沉淀峰的高低与抗原浓度成正比，从标准曲线中可查出被检测样品中抗原的含量。此试验快速、敏感，相似于。若抗原中加入少量放射性核素标记，可作放射免疫自显影检测微量抗原。本试验常用于定量检测免疫球蛋白、、、甲胎蛋白及其他蛋白质的含量。
免疫电泳是琼脂与双向琼脂扩散两种方法的结合，用来分析抗原组分的分析技术。根据沉淀弧的数量、位置和形状与已知标准抗原在同一琼脂板上所形成的沉淀弧进行比较即可分析待检样品中所含成分及其性质。本试验的特点为检测样品用量小、分辨力高、特异性强，但敏感度较弱。可用于分析血清蛋白成分，也可用于分析抗原、抗体提纯程度，研究抗体成分、免疫后抗体组分的动态变化等。
交叉免疫电泳是免疫电泳与火箭电泳的结合。即先将抗原（待检样品）进行区带电泳，然后再进行火箭电泳，在电场作用下形成独立锥形沉淀峰。对抗原中各组分容易进行比较，可定性，也可半定量。
③补体参与的抗原抗体反应。补体一旦被结合后，即不再游离，故可利用此特点进行的研究。实验室常用的补体多来源于豚鼠的新鲜血清。
补体参与的抗原抗体反应在实验室经常应用的有：反应与反应、及免疫粘附等。
补体的溶血、有赖于抗体的存在。红细胞抗原与相应的红细胞抗体（又称）结合，在电解质溶液中可发生凝集反应，但在有补体参与红细胞可被溶解，这称为免疫溶血。在输血时血型不合亦可致溶血反应。体外抗体形成检查法又称溶血空斑试验，是在细胞水平动态观察检测抗体产生情况的一种溶血反应。在产生抗体的周围，出现一个因红细胞溶解形成的透明区，此抗体生成淋巴细胞称为。所形成空斑的数量可精确地反映机体的体液免疫功能状态。
当抗原为某些细菌(如)的，与相应抗体结合后，若有补体参与则细菌可被溶解或破坏，这称为溶菌反应。
补体结合试验是在补体参与下，以绵羊红细胞与溶血素作为指示系统的抗原抗体反应。这种反应包括两个系统、五种成分：即指示系统及实验系统；绵羊红细胞、溶血素、补体、待检血清(或已知抗体)、已知抗原（或待检抗原）。借助指示系统是否出现来说明试验系统中的抗原与抗体是否有特异性反应。从试验系统中加入已知抗原及补体，若其中存在待测抗体，则补体被用完。将这系统放入4℃冰箱过夜，再经37℃水浴30分钟，又加入指示系统中。当指示系统不出现溶血现象，为补体结合试验阳性，溶血则为阴性反应。本试验敏感性、特异性均较高，但实验操作较繁琐。常用来检测血清中的抗体，如诊断、梅毒及等;也可用来鉴定自病人体内分离的病原微生物如、立克次氏体等，如检查梅毒的瓦瑟曼氏反应。
免疫粘附血凝试验原理是抗原抗体复合物能固定补体，当具有补体(C3b)的细胞（如人O型红细胞）存在时，则抗原抗体上的C3b与红细胞表面C3b受体结合而引起。是检测抗原、抗体或补体量的高度敏感方法，比补体结合试验的敏感度高数倍至数百倍。常用于检测乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）。
④免疫标记技术。是将放射性核素、或物质标记于抗体或抗原表面，能使在一般实验方法中不能观察到的抗原抗体反应得以显示出来。不仅可大大提高抗原抗体反应的敏感性，同时可对微量物质进行定性、定量检测，并可结合、电镜技术对待检物质作出组织内或细胞内的精确定位，对医学基础研究、临床理论探讨及临床均提供了有利手段和重要工具，应用极为广泛。
根据质与方法的不同包括多种。
放射性核素标记抗原抗体反应是将放射性核素分析的高度灵敏性和抗原抗体反应的特异性两大特点相结合而建立的检测技术。敏感性高、特异性强，尤其具有很高的精确性，能检测到μg/ml以至ng/ml水平。常用的放射性核素有3H、14C、35S、32P、15N、131L和 125I等。其中3H和14C应用最多。3H标记掺入快、游离少、短、定位准确，14C只放射出β粒子，具有足够能量，测定较易，外照射弱，半衰期长，适于长时间的连续示踪试验。放射性核素标记法可分为内标记法和外标记法。内标记法是用3H、14C等标记或。将标记物加入含有细胞的中，细胞在合成蛋白质或核酸过程中摄取携带标记3H(14C)的氨基酸或核苷酸，使细胞内含有物。利用此方法能研究DNA、和的位置及动态，研究遗传物质的复制，细胞的融合，功能，及等。外标记法是将131L或125I直接结合到抗原或上，采用T法。氯胺T为一种缓和氧化剂，在氨胺T作用下，碘分子与分子中的主要结合，蛋白质被放射性核素标记。
常用的技术有和放射免疫沉淀自显影法。
是以荧光素为标记物，标记于抗体分子上，不影响抗体的免疫学特性。以标记荧光素的抗体作为标准试剂，用来检测未知的抗原，在下观察呈现荧光特性的抗原抗体复合物的存在部位。是将免疫学反应的特异性、敏感性与显微镜技术的准确性相结合。应用广泛。荧光素为一种染料，在紫外光或蓝紫光照射下能吸收光量子而被激化，放出波长较激发光长的荧光。最常用的荧光素有异硫氰荧光素和。
分为三种。直接法为最简单、最基本的方法。是将抗体直接加到待检标本上，在荧光显微镜下直接观察有荧光特性的抗原抗体复合物。此法特异性最强，但敏感性较差，同时因抗体种类繁多，而又需各个标记，因而相对又很复杂。间接法是首先将荧光素标记抗球蛋白抗体（又称为），然后将待检测抗原与相应抗体相互作用，最后再与荧光素标记的抗球蛋白抗体作用，阳性反应可形成抗原—抗体—荧光素标记抗球蛋白抗体复合物。可用来鉴定未知抗原。敏感性高于直接法，操作简便，只需制备一种荧光素标记的抗球蛋白抗体即可检测同种动物的多种抗原抗体系统，但本法易产生非特异性荧光现象，而影响特异性。
补体法与间接法原理相同。即利用补体能与的特性，将荧光素标记于。方法是将抗体、补体与待鉴定抗原作用后，再与荧光素标记抗补体抗体作用。阳性反应可形成抗原—抗体—补体—荧光素标记抗补体抗体大分子复合物。优点为应用方便，只需制备一种标记抗补体抗体即可检测多种抗原抗体系统，抗体来源不受动物种属限制，敏感性高于间接法，但操作过程较繁琐，易出现非特异性反应。常用于检测组织内补体沉淀，及固定补体的抗体等，可借以诊断免疫复合物性疾病及。
免疫酶技术是以酶作为标记物，即酶标记抗体（或抗原）检测相对应的抗原(或抗体)的一种定位、定性和定量技术。是将抗原抗体反应的特异性与酶的高效专一的能力结合而建立的一种新的血清学反应。用方法处理，使酶与抗体（或抗原）结合，标记物并仍保持抗体（或抗原）的免疫特异性和酶活性。当酶标记物与相应的抗原（或抗体）相反应而形成酶标记物—抗原（或抗体）的免疫复合物后，在遇到相应酶底物时可进行催化其水解、的反应，生成有颜色的产物。酶降解底物的数量与所呈现的色泽浓度成正比。由此可计算出被检测的抗原（或抗体）的含量。经常被选作标记物的酶有过氧化物酶(HRP)，及6-等，目前多采用HRP。
免疫酶技术可分为免疫酶染色和。免疫酶染色与免疫荧光技术相似，但标记物不同。当酶标记抗体（或抗原）与相应抗原（或抗体）特异结合后，在加入酶底物时，底物在酶的催化下生成不溶性沉淀物并发生反应而产生有颜色物质，可在下观察。出现颜色反应的部位即是酶标记抗体与相应抗原特异结合的部位，亦即所检测的抗原（或抗体）存在部位。利用本试验可进行组织或细胞内抗原或抗体定位及半。酶免疫测定 (EIA)在酶免疫组织化学法和放射免疫测定法的基础上发展建立，是用来检测体液中的微量抗原或抗体的定量方法。用酶标记已知抗体或抗球蛋白抗体（抗抗体）或抗原，再与待检测的材料混合，反应后加入酶的底物，若生成可溶性有颜色产物可根据呈色程度用肉眼观察，为定性测定；或用来测定，可进行定量测定。
在酶免疫测定法的基础上经改进后建立(ELISA)和酶放大免疫试验。
酶联免疫吸附试验又称酶标法，是将可溶性抗原或抗体吸附在固相载体上（如聚苯乙烯板、管、珠），再与酶标记抗体或抗原相结合，然后根据检测分解酶底物量的差异计算被检测的抗原或抗体的含量。常用的有间接法、双抗体夹心法、竞争抑制法。
酶放大免疫试验是利用竞争原理直接检测子抗原的一种快速简便方法，即将酶标记与相应抗体及待检样器混合作用后检测酶活性，若样品中不含半抗原，则酶标记半抗原与相应抗体结合，酶活性被抑制;反之，待检样品中含有半抗原，则酶标记半抗原与样品中的半抗原共同竞争有限的抗体，而使酶活性受抑制减少，然后通过测定酶活性的多少来反映待检材料中是否存在半抗原及其含量。此试验可直接、快速检测体液物、的浓度。
免疫酶技术有特异性、敏感性、快速简便实用、经济，可在普通实验室及现场进行，广泛用于、免疫学、、学、、肿瘤学、、血液病、与传染病中。
生物素—亲和素试验是较新的方法。生物素—亲和素系统是70年代后期发展起来的一种新型反应放大系统。此系统有特殊放大作用，可显著地提高检测的敏感性，同时又具有高度的特异性与稳定性，故广泛应用于酶、荧光素、放射性核素、等标记反应中。
生物素广泛存在于动植物体内，结构简单，为小分子物质，一旦后可以方式蛋白质、核酸和物质、细胞膜表面物质及其他标记物，结合十分稳定。
亲和素分子为，亲和素与生物素之间有很强的亲和力，结合十分稳定难以，也不受酸、碱及影响。亲和素为，可直接偶联各种标记材料如酶、荧光素、放射性核素及铁蛋白等。因此生物素—亲和素系统可以它的一端偶联大分子反应物质，另一端联接标记物或支持物而产生多极放大作用，建立一种灵敏度高、特异性强、快速而又经济的检测方法。
常用的实验为ABC酶标记法。亲和素(A)与小分子生物素(B)之间有高度亲和力，一个A可与4个B结合，而B又可与酶标记物(P)结合，A作为桥梁将B-P联接在一起，完成酶标记免疫染色检测。
发光免疫技术 (LIA)即将与免疫测定法相结合的技术。特点是利用化学或发光系统作为抗原抗体反应的指示系统，借以确立检测抗原或抗体的方法。发光物质既可直接作用于抗原或抗体的标记物，也可以游离的形式用于催化剂（酶）和辅助剂标记的抗原或抗体的发光反应中。此法简便、快速、灵敏、重复性好、设备简单，故发展迅速。根据发光物质应用方式不同，发光免疫测定法有以下几种，即发光免疫测定法、发光酶免疫测定法、发光酶放大免疫测定法、发光辅助因子免疫测定法等。
①人血清中补体水平的测定。常用方法有测定活性(CH50)及补体各种成分的测定。
新鲜人血清中含有补体，当它与以绵羊红细胞为抗原及相应抗体（溶血素）相互作用后，在一定条件下发生溶血反应。溶血的程度与血清中含有补体的量成正比。根据产生50％溶血所需要的最小补体量计算出血清中活性并以CH50单位/毫升表示。人血清总补体活性的正常值为30～40CH50单位/毫升。
在补体的各种成分中C3不但含量高，而且在经典活化途径或旁路活化途径中均起着承前启后的枢纽作用，因而测定C3含量具有重要的生物学意义。测定方法可利用单向免疫扩散法。C3的含量变化对某些疾病的诊断、预后等有所帮助，如免疫复合物性疾病、、等。
②免疫球蛋白定量测定。测定方法很多，常用的方法为单向免疫扩散法，可测定血清中 IgG、、的含量，其正常值IgG10±2mg/ml、IgM0.4～2mg/ml、IgA1.4～4mg/ml。
③的检测。正常情况下形成的免疫复合物能被机体的防御系统所清除。但在一定条件下，免疫复合物为可溶性，并不能为吞噬系统清除而能随血液流经身体各部位，在某些部位如壁内、组织内沉积。由于抗原抗体复合物能激活补体，从而引起一系列连锁反应，最终导致免疫复合物性疾病。检测组织内或体液中的免疫复合物有助于对某些疾病如 (SLE)、类风湿病、性等的诊断。组织中免疫复合物的测定多采用和免疫荧光法。体液中免疫复合物的测定方法有抗原非特异及抗原特异方法，目前多采用前者。
包括以下两类。
如异种动物，皮肤试验（为，借以了解机体的敏感性）。
如希克氏试验（注入皮内，以同样毒素加热破坏其，注入另一侧前臂作对照。阳性反应表示对白喉无免疫力，缺乏IgG抗白喉抗体；阴性反应为有免疫力）和狄克氏试验（将小剂量毒素注射前臂屈面皮内，24小时后局部出现红疹，则表明体内无相应抗体，若局部无红晕则表明有免疫力）。
出自A+医学百科 “体液免疫检测法”条目
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