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鸭病毒性肝炎的防治
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　　1．概述
　　鸭病毒性肝炎是雏鸭的 种传播迅速和高度致死的传染病。肝脏的病变特征是体积增大和有出血斑点，开始发病时的死亡率高达90％以上，造成很大损失。　　鸭肝炎由3种不同病毒引起，分别是鸭肝炎病毒(DHV)I、II、Ⅲ型，最常见的为DHVI型，属肠道病毒；DHVⅡ型呈星状病毒；DHvⅢ型呈小核糖核酸病毒。DHVI、II、Ⅲ型有明显差异，各型之间上交叉免疫性。本病由I病毒感染所致。病毒的大小20-40纳米，能够在发育鸡胚的尿囊内生长繁殖(图版6-1)，但不大适应‘般的细胞培养。病毒对外界环境的抵抗力很强，在污染的育雏室内的病毒至少能够生存10周，阴湿处粪便中的病毒能够存活37天。含有病毒的胚液保存在2?4℃冰箱内，700天后仍保持存活。病毒在2％来苏儿溶液中37℃能够存活1小时，在0．1％福尔马林中能够存活8小时。　　本病主要发生于3周龄以下的雏鸭，4周龄以上尚未见到发病报道，对成年鸭没有影响，鸡和鹅也都有抵抗力。有人发现用鸭病毒性肝炎病毒人工感染日龄和1周龄的雏火鸡、雏鹅及珠鸡，能够产生本病的症状、病理变化和血清中和抗体，并从雏火鸡的肝脏中分离到病毒。本病在雏鸭群中传播很快，上要通过消化道感染。病愈康复鸭的粪便中能够连续排毒1～2个月。目前还投有事实证明病毒能够通过鸭蛋传递。
　　2．诊断
　　2．1临诊症状　　本病的潜伏期很短，人工感染大约24小时。雏鸭均为突然发病，开始时病鸭表现精神萎靡，不能随群走动，眼睛半闭，打嗑睡。随后病鸭不安定，出现神经症状，运动失调，身体倒向?侧，两脚发生痉挛(图版6-2)，死前头向后倒，呈角弓反姿态(图版6-3)。通常在出现神经症状后的几小时内死广。人工感染的病鸭一般都在接种后第4天死广。鸭群感染后在3?4天内全部死亡，绝大多数在第二天死亡。有些发病很急的病鸭往往突然倒毙，常看不到任何症状。本病的死亡率因年龄而有差异，1周龄以的雏鸭的死亡率可高达95％；1-3周龄的雏鸭的死亡率50％左右。
　　2．2病理变化　　本病的上要病理变化是在肝脏。肝脏肿大，质地柔软，呈淡红色或外观显斑驳状，表山有出血点或出血斑(图版6-4)。脾脏有时肿大，外观也呈斑驳状。多数病鸭的肾脏发牛充血和肿胀(图版6-5)。胆囊扩张。胰胨肿大(图版6-6)。其他器官没有明显变化。
　　2．3实验室诊断　　病毒性肝炎在流行病学和症状上的特点足，仪发生在3周龄以下的雏鸭，成年鸭不见发病。发病急骤，传播迅速，病程短和死亡率高.病鸭有明显的神经症状。病理解剖上主要表现在肝脏的变性和出血。根据这些特点，可以作出初步诊断。　　2．3．1　病毒分离　　2．3．1．1病料采集：用无菌于续取患病雏鸭典型肝脏病料放置于灭菌的玻璃瓶，冻结保存作为病毒分离材料。　　2．3．1．2病料处理：将肝脏病料剪碎、磨细．用灭菌生理盐水或灭出PBS液作1：5稀释，悬液经3 000转／分，离心30分钟，取上清液用5％的氯仿在室愠下处理10-15分钟，冉经3000转／分，离心30分钟，取上清液加入青霉素、链霉素，使之每毫升组织悬液各含有1000单位，作为病毒分离接种材料。　　2．3．1．3胚胎接种：将病毒分离材料接种于11?13日龄易感鸭胚或10?11日龄鸡胚6?8枚，每胚绒尿腔接种0.1-0.2毫升。鸭胚一般48-96小时后死亡。鸡胚死亡差异较大，较不稳定，通常在接种后96?162小时死亡。胚胎特征性病变是胚体生长停滞，全身皮肤和皮下亢血、出血，腹部和股部皮下发生水肿，绒尿液增多和变为淡绿色。肝脏肿大，呈淡绿色，或红黄色，表面有淡黄色的坏死灶。死亡时间较长的胚胎中，绒尿液明显变绿，肝脏病变和胚胎发育受阻更加明显。　　2．3．1．4易感雏鸭接种：用病毒分离材料或鸭胚或鸡胚分离毒株的绒尿液接种5-10只，1-7日龄易感雏鸭每只皮下或肌肉注注射0．2?0．5毫升。接种24小时后开始发病和死亡，并具有典型临珍症状和病理变化。
[NextPage]　　2．3．1．5细胞培养：在单层鸭胚肝细胞接种病毒分离材料，在室温吸附15分钟，加入细胞营养液于37％温箱培养观察，本病毒能引起细胞变圆等病变。　　2．3．2血清学诊断方法　　2．3．2．1保护试验：用已知抗鸭病毒性肝炎高免血清或抗鸭病毒肝炎特异蛋黄抗体注射5只，1-7日龄易感健康的雏鸭，每只雏鸭皮下注射1～2毫升，12-2A小时后用至少10的3.0次LD50的病毒分离物，或绒尿液皮下或肌肉注射攻毒。未注射抗血清5只对胴组雏鸭同时攻毒。经7天饲养观察，结果注射特异抗体组的雏鸭有80％～100％存活，而对照组雏鸭有80％～100％死亡，即可判定分离毒株为鸭肝炎病毒。　　2．3．2．2被动免疫试验：州经鸭肝炎病毒免疫种鸭1-5日龄5只雏鸭(含母源抗体)和5只日龄易感雏鸭10的3.0次LD50的病毒分离物攻毒。经7天饲养观察，结果免疫组有80％?100％雏鸭存活，而对照组有80％～100％死亡，即可判定为分离毒株为鸭肝炎病毒。
　　2．4鉴别诊断　　2．4．1与鸭瘟鉴别 鸭瘟是由鸭瘟病毒引起鸭的一种高死亡率的急性传染病。虽然各种日龄的鸭均可感染发病，但3周龄以内的雏鸭较少发生死亡，而病毒性鸭肝炎对1?2周龄易感雏鸭有极高的发病率和致死率，超过3周龄雏鸭不发病，这在流行病学上是重要鉴别之一。从患鸭瘟的鸭食道、泄殖胯和眼睑黏膜呈出血性溃疡和假膜为主要特征性病变，与鸭病毒性肝炎完全不同，可作为重要鉴别之一。用抗鸭瘟病毒高免血清和抗鸭病毒性肝炎高免血清，在易感1-7日龄雏鸭作交叉中和试验，或交叉保护试验，可作为重要鉴别之二。必要时用鸭胚和鸡胚作为病毒分离检验。　　2．4．2与鸭巴氏杆菌病鉴别 由多杀性巴氏杆菌引起的急性败血性传染病，发病率和死亡率很高。青年鸭、成年鸭比雏鸭更易感，尤其是3周龄以内的雏鸭很少发生，这在流行病学上是重要鉴别之一。鸭巴氏杆菌病的鸭肝脏肿大，有灰白色钊头大的坏死灶和心冠沟脂肪组织有出血斑，心包积液，十二指肠黏膜严重出血等特征性病变，与鸭病毒性肝炎完全不同，可作为重要鉴别之二。肝脏触片，心包液涂片，革兰氏或美蓝染色见有许多两极染色的卵圆形小杆菌。用肝脏和心包液接种鲜血培养基能分离到巴氏杆菌，而鸭病毒性肝炎均为阴性，可作为重要鉴别之三。
　　3．预防措施
　　在流行鸭病毒性肝炎地区，可以用活疫苗免疫产蛋母鸭。力法足在每只鸭开产之前2?4周肌肉注射0．5毫升未经稀秆的胚液，这样母鸭所生的蛋中即含有多最母源抗体，孵出的雏鸭获得被动免疫，田而能够抵抗感染，免疫力能维持3周。这是一种方便、有效的预防方法。此外，用无致病力的病毒株制成疫苗(弱毒苗)直接免疫刚孵出的雏鸭。鸭病毒性肝炎的防制措施，最重要的是雏鸭群，特别是3周龄以内的雏鸭群必须严格隔离饲养。
　　4．治疗方法
　　康复病鸭的血清和高度免疫血清中都含有能够中和病毒的抗体，可以用来治疗病鸭或作为被动免疫之用，效果很好。当雏鸭群刚开始流行病毒性肝炎时，立即给每只雏鸭肌肉或皮下注射康复血清或高免血清0．5毫升，能够防止感染发病和降低死广率。　　此外，应用鸭高免蛋黄匀浆(卵黄抗体)治疗病鸭作为被动免疫，效果也较满意。有的用鸭病毒性肝炎疫苗免疫母鸡，采用高免鸡蛋蛋黄匀浆代替鸭蛋蛋黄，供治疗和被动免疫之用，电获得丁良好效果。它的优点是能避免应用同源蛋黄匀浆可能带来的疾病传播。&
（作者：佚名）&
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鸭肝炎病毒（DHV
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【中文摘要】采用不同方法对鸭胚增殖的DHV-1进行病毒纯化，并比较几种方法的纯化效果，利用纯化的DHV-1抗原制备特异性的兔抗DHV-1 IgG，用SDS-PAGE检测DHV-1完全病毒粒子的结构蛋白，Western-bloting分析其抗原相关蛋白。同时，在了解小RNA病毒普遍共性的基础上，对DHV-1的基因组结构进行生物信息学分析。初步了解DHV-1的分子生物学背景，为明确其分类地位，更为开发DHV-1基因工程疫苗，建立方便快捷的诊断方法提供理论依据。获得如下结果：1．鸭胚增殖的DHV-1的提纯及提纯方法比较DHV-1 H株种毒(ELD_(50)为10~(6.5)／0.2ml)经鸭胚尿囊腔途径增殖后，收集含毒尿囊液及胎衣，分别采用超滤浓缩法、PEG 6000包埋浓缩法、差速离心法和PEG 6000包埋浓缩+差速离心法进行提纯比较，以PEG 6000包埋浓缩+差速离心法获得较纯的病毒粒子。收获的DHV-1蛋白含量为15.761mg／ml，OD_(260)／OD_(280)值为1.063，能用于免疫血清的制备和SDS-PAGE检测。各种方法纯化的DHV-1，毒力均能维持在10~(6.5)左右，且对1日龄雏鸭的致死率均在87.5％以上。透射电镜检测结果显示，超滤浓缩法提纯的病毒样品中可观察到少数病毒粒子，杂质较多；PEG 6000包埋浓缩法的样品病毒粒子较多，但杂质也较多；氯仿处理后直接进行差速离心法提纯的样品虽然杂质较少但只能见少量单个病毒粒子；而PEG 6000包埋浓缩+差速离心法提纯的病毒样品所观察到的病毒粒子最多，杂质较少。2．兔抗DHV-1 IgG的制备、纯化及检测应用免疫删减技术，以正常鸭胚尿囊液和环磷酰胺对试验兔进行预处理，再将DHV-1抗原灭活、乳化后对预处理兔进行多次免疫，并采集兔血进行琼脂扩散试验，至检测血清效价达1：64以上时，开始收集兔抗DHV-1血清为实验材料。用正辛酸―饱和硫酸铵(SAS)法粗提兔抗DHV-1血清，然后用重组蛋白A FF琼脂糖凝胶亲和层析法纯化兔抗DHV-1 IgG。SDS-PAGE检测表明，纯化后的IgG在8％非变性SDS-PAGE图谱中显示为1条分子量为160kDa的蛋白带，在12％变性SDS-PAGE图谱中显示为2条分子量分别为55kDa和25kDa的蛋白带。同时，纯化后的兔抗DHV-1 IgG病毒中和抗体效价达1：2000。表明所制备的兔抗DHV-1 IgG具有高纯度、特异性。3．鸭肝炎病毒(DHV-1)结构蛋白及抗原相关蛋白检测与分析对纯化的DHV-1与正常鸭胚尿囊液进行平行SDS-PAGE，筛减二者差异性。在12％SDS-PAGE图谱中筛选出2条分子量在20～30kDa的DHV-1结构蛋白带，在15％SDS-PAGE图谱中筛选出4条分子量在7～30kDa的DHV-1结构蛋白带。利用专业凝胶图象扫描软件Quantity One~(?)，对照标准蛋白质Maker进行分子量测算，12％SDS-PAGE图谱中筛选的2条蛋白带分子量分别为27.43kDa和20.56kDa，15％SDS-PAGE图谱中筛选的4条蛋白带分子量分别为27.43kDa、25.59kDa、20.56kDa和7.72kDa。Western-bloting检测表明，分子量为27.43kDa的蛋白带为DHV-1抗原相关蛋白。对截止到2007.04 NCBI数据库中公布的DHV-1全基因组进行生物信息学分析，结果表明DHV-1具有典型的小RNA病毒基因组结构特征。DHV-1含单股正链RNA，全长nt(包括3’poly A尾)。RNA基因组的顺序依次为5’UTR、COS和3’UTR。其中5’UTR长600～626nt，不含帽子结构；3’UTR长269～341nt，含6～21nt不等的3’poly(A)尾；ORF长6750nt，编码2249个aa，表达病毒的多聚蛋白。9株DHV-1核苷酸序列同源性为94.4％～99.5％，多聚蛋白氨基酸序列同源性高达97.1％～99％。各株DHV-1的ORF均从600～626nt处以ATG开始翻译，在nt处以TGA结束。9株DHV-1多聚蛋白共有138个氨基酸有差别，占全部氨基酸数的6.1％，其中发现4个完全保守的氨基酸区域，3个变异最集中的氨基酸区域和11个变异最大的氨基酸位点。在DHV-1多聚蛋白的第aa位，均出现小RNA病毒3C蛋白酶(3C~(pro))的高度保守基序Gly-Ser-Cys-Gly-Gly(G-X-C-G-G)，推测这一区域将编码产生DHV-13C蛋白。NCBI数据库中公布的8株DHV-1 VP1区长度均为714nt，编码238个aa，预测分子量为26.4kDa左右。除ZG-A株外，其他几株核苷酸序列同源性高达99.3％～99.9％；SY1、SY2、SY3和SY6株氨基酸序列同源性为100％，SY4株仅第49位Ser被Leu取代，AV2111株第29位His被Arg取代，SY5株第10、232位Glu被Gly取代；ZG-A株与其他各株氨基酸同源性较低，共有10个氨基酸发生变化。同时发现VP1的50～122aa区域完全保守，其潜在的抗原决定簇广泛分布在整个VP1区，除ZG-A株外，其他几株DHV-1 VP1区抗原决定簇的氨基酸序列相当保守，推测它们均属同一血清型。DRL-62、R85952、S、ZJ和H株的核苷酸序列亲缘关系较近。5886、DRL-62、03D、C80和JX株的多聚蛋白氨基酸序列亲缘关系较近。同时，DHV-1在小RNA科病毒多聚蛋白氨基酸序列进化树上是一个独立的进化分枝，该分枝与埃可病毒属(Parechovirus)亲缘关系较近，显示DHV-1可能是小RNA病毒科的一个新属病毒。预测DHV-1全长多聚蛋白总共被切割成12个成熟产物，形成其结构蛋白与非结构蛋白。切割位点分别为：1A／1B(VP4／VP2)、1AB／1C(VP0／VP3)、1C／1D(VP3／VP1)和3C／3D为Q／G，1D／2A1为E／S，2A1／2A2为NPG／P，2A／2B、2B／2C、2C／3A和3A／3B为Q／S，3B／3C为E／T，这与小RNA病毒多聚蛋白加工特点相符。测算DHV-1结构蛋白VP4含75个aa、VP2含181个aa、VP3含237个aa和VP1含238个aa，分子量分别为7.72、20.56、26.59和27.02kDa，这与本研究中的DHV-1完全病毒粒子SDS-PAGE检测结果基本一致。
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鸭肝炎病毒的纯化及其单克隆抗体的制备与鉴定
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