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心室肌细胞的动作电位
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心室肌细胞动作电位的主要特征在于复极过程复杂，持续时间很长，动作电位的降支和升支不对称。1．静息电位是K+的电-化学平衡电位。2．去极化过程(0期)：心室肌细胞受到刺激的作用，使膜的静息电位减小到阈电位(-70mV)时，钠通道被激活，膜对Na+的通透性急剧升高。Na+顺浓度梯度内流使膜内电位迅速上升到约+30mV，此过程称为去极化期。由于钠通道激活迅速，失活也迅速，其开放持续时间很短，因此，将钠通道又称为“快通道”。3．复极化过程：心室肌细胞复极化过程分为四个时期。(1)1期(快速复极初期)：心室肌细胞膜电位在去极化达顶峰后，即快速下降到OmV左右，至此形成复极化l期。此期是由于钠通道关闭，Na+内流停止，而膜对K+通透性增强，K+顺浓度梯度外流而形成。(2)2期(平台期)：此期膜电位OmV左右，且下降缓慢，动作电位图形比较平坦，称为平台期。内向电流(Ca2+内流)与外向电流(K+外流)两者处于平衡状态，膜电位水平变化不大。(3)3期(快速复极末期)：膜对K+的通透性进一步增高，K+迅速外流，而钙通道已逐渐失活，恢复极化状态。(4)4期(静息期)：通过Na+-K+泵和Na+-Ca2+交换体的活动，使细胞排出Na+和Ca2+，摄入K+，恢复静息时细胞内外的Na+、K+的分布；经3Na+-Ca2+交换体Na+顺浓度梯度入胞，Ca2+逆浓度梯度外排。
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感谢楼主分享知识点
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请问下楼主窦房结细胞的动作电位是怎么回事？
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窦房结细胞的动作电位具有以下特点：①最大复极电位与阈电位的绝对值小；②0期去极化的幅度小、时程长、去极化速率较慢；③没有明显的复极1期和2期；④4期自动去极化速度快。1．去极化过程：0期去极L型Ca2+通道激活，Ca2+内流。2．复极化过程：3期复极L型Ca2+通道逐渐失活，Ca2+内流相应减少，及Ik通道的开放， K+外流增加。3．4期自动去极化机制①IK：复极至-60mV时，因失活逐渐关闭，导致K+外流衰减，是最重要的离子基础；②Ica-T：在4期自动去极化到-50mV时，T型Ca2+通道激活，引起少量Ca2+内流参与4期自动去极化后期的形成；③If：窦房结细胞最大复极电位只有-70mY，If不能充分激活，在P细胞4期自动去极化中作用不大。
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血管紧张素Ⅱ对豚鼠窦房结细胞自律性和表达Kv1.5钾通道的调控作用
肾素-血管紧张素系统(RAS)对维持心血管系统正常生理功能发挥重要作用，但该系统功能的失调参与高血压、心力衰竭、动脉粥样硬化等许多心血管疾病的发生，具有重要的病理生理意义。近年，大量的临床报道表明，减少血管紧张素Ⅱ产生的血管紧张素Ⅰ转化酶抑制剂(angiotensin-converting enzyme inhibitors，ACEI)和AngⅡ的Ⅰ型受体AT1受体拮抗剂可明显降低心衰病人心律失常所致的心性猝死(Suddencardiac death，SCD)危险性，成为目前临床治疗高血压、心衰的重要药物。然而，RAS潜在致心律失常的机制尚不清楚。选择性心肌组织过表达AngⅡ基因或AT1受体的小鼠出现明显复极化延迟，伴高发的室性心律失常，年幼的转基因动物在不存在组织肥厚性重构情况下就伴高发的心律失常，提示AngⅡ可能通过直接调控心肌离子通道参与病理情况下心律失常的产生。但目前AngⅡ对心肌电生理活动的直接调控作用了解极少，我们的总体目标是研究AngⅡ对心肌细胞电活动的直接影响，以揭示病理情况下心律失常的产生机制。在前期的研究中我们业已发现，AngⅡ可以抑制豚鼠心室肌细胞的快激活延迟整流钾电流(Ikr)、延迟动作电位复极过程。　　
窦房结是心脏自律性发源地，其起搏功能对维持心脏正常的泵血功能至关重要。慢性心衰病人常常伴有明显窦房结电生理重构，导致其储备功能降低，有资料显示，由此形成的缓慢型心律失常造成的SCD可高达住院病人SCD的42％。因此，了解窦房结自律性产生机制及其调节具有重要意义。半个世纪以来普遍认为心脏节律开始于窦房结起搏细胞膜表面各种电压依赖的离子通道，起搏细胞动作电位的产生正是这些离子通道共同作用的结果。由于膜离子通道的开放与关闭受膜电位的影响，因此该过程又称为膜钟(membrane clocks)。近年有人提出，细胞内Ca2+释放是窦房结自律性产生的另外一个机制，即在窦房结起搏细胞中，细胞内Ca2+([Ca2+]in)的循环诱导了membrane clocks的发生，构成了自动去极化的重要起因，人们将这一机制称为钙钟(Ca2+ clock)。迄今为止，关于AngⅡ对窦房结细胞自律性及其对上述膜钟、钙钟的影响报道较少且不一致。KCNA5基因编码的Kv1.5通道蛋白构成了心房细胞超速激活的外向整流钾电流(Ikur)通道，为心房细胞特有的钾通道，在心房细胞动作电位复极过程中发挥重要作用。目前关于AngⅡ对Kv1.5通道的直接调控作用尚不清楚。　　
本实验利用全细胞膜片钳电生理记录技术，在急性分离的豚鼠窦房结细胞观察了AngⅡ对窦房结自发起搏频率的影响，并分析了对膜钟、钙钟的调控；在表达Kv1.5的人胚胎肾细胞(HEK293)上，观察AngⅡ对hKv1.5的直接调控作用，并初步分析其作用机制。以其为全面了解AngⅡ的心肌电生理效应提供试验依据。　　
第一部分 AngⅡ对豚鼠窦房结细胞的电生理影响　　
目的：观察AngⅡ对豚鼠窦房结细胞自发起搏频率及膜离子通道电流的影响　　
方法：在急性分离的豚鼠窦房结细胞，常规全细胞膜片钳技术记录并观察AngⅡ对窦房结动作电位(AP)、超极化激活起搏电流If、延迟整流钾电流慢成份Iks及L型钙电流ICaL影响。　　
用于窦房结细胞自发动作电位记录的细胞外液组成(in mM):NaCl138，KC14，MgCl21，CaCl22,NaH2PO40.33,glucose10，和HEPES10（用NaOH调pH至7.4）．；电极内液成分包括(in mM)：KC1140，MgCl25，K2ATP1，和HEPES3(用KOH调pH至7.2)，电极内液中加入两性霉素B(240μg/ml)。　　
记录If的细胞外液为(in mM):NaCl132，KC14，MgCl21.2，CaCl21.8，glucose5，and HEPES，10（用NaOH调pH至7.4）；电极内液成份为(inmM)：KCl150，K2ATP1，MgCl25，和HEPES3(用KOH调pH至7.2)。电极内液中加入两性霉素B(240μg/ml)。将窦房结细胞钳制在-40mV，从-50mV开始以阶跃电压-10mV的方式逐步超极化至-110mV，持续3s，然后复极至-40mV,记录到If电流。该电流可以被2mM CsCl完全阻断。　　
记录Iks的细胞外液(in mM)：NaCl，132;KC1，4；CaCl2，1.8;MgCl2，1.2;glucose，5和HEPES10(用NaOH调pH至7.4)；加Nimodipine(1μM)加到外液中用于阻断ICaL、加入2μME-4031阻断Ikr。电极内液(in mM)：potassium asparate70, KCl50, KH2PO410, Na2ATP3，LiGTP0.1,EGTA,5和HEPES5(用KOH调pH至7.2)。将细胞钳制在-50mV，从-40mV以阶跃电压10mV的方式去极化至+50mV,维持2s，然后复极至-40mV，诱发Iks外向尾电流。　　
记录ICaL的细胞外液(in mM):NaCl135，CsCl10，MgCl21，CaCl21.8，glucose，10，HEPES5和tetrodotoxin0.003(用NaOH调pH至7.4)．；电极内液(in mM): aspartic acid90,NaCl10,CsOH100,CsCl30,MgCl22，EGTA5，CaCl22，HEPES10，ATPNa22和GTPNa20.1(用KOH调pH至7.2)。将细胞钳制在-50mV，从-40mV以阶跃电压10mV的方式去极化至+50mV,维持300ms，然后复极至-40mV，诱发内向ICaL电流。　　
以上实验均在36±1℃条件下进行。　　
结果：灌流外液中加入AngⅡ后可明显降低窦房结细胞的自动起搏频率，抑制作用在第3min出现，10min左右达到稳态，冲洗后抑制作用不能完全恢复，Ang11(100nM)使自发起搏频率和舒张期去极化频率分别从171±5beats/min和150±5mV/s降至113±8beat/min(P＜0.05)和70±6mV/s(P＜0.01)。以自发起搏频率抑制率为纵座标做出AngⅡ作用的量效曲线，经Hill方程拟合后得到IC50为8.34nM。AT1受体阻断剂valsartan(1μM)拮抗AngⅡ对自发起搏频率的抑制作用，而AT2受体阻断剂PDμM)并不影响AngⅡ的作用。AngⅡ并不明显影响If电流幅值，但可显著增大Iks去极化外向电流及复极时的尾电流，当去极电压为+50mV时，尾电流由给药前的7.0±0.5pA/pF增大到9.0±0.5pA/pF(n=6，P＜0.01)，分析通道动力学发现，AngⅡ可显著增大去活时间常数。此外，AngⅡ可显著抑制ICaL电流，当去极电压为+10mV时，AngⅡ（100nM）使ICaL电流密度峰值由给药前的11.3±1.6 pA/pF降低到7.5±1.0pA/pF(n=6，P＜0.05)。　　
小结：AngⅡ通过增大Iks、抑制ICaL降低豚鼠窦房结起搏频率，这种抑制作用由AT1受体介导。　　
第二部分钙钟机制在AngⅡ减慢窦房结自律性中的作用　　
目的：观察AngⅡ是否通过影响窦房结细胞内Ca2+调控自发起搏频率。　　
方法：(1)在急性分离的豚鼠窦房结细胞上，利用共聚焦显微镜观察AngⅡ(100nM)对细胞内Ca2+的影响。分离窦房结细胞后，4℃静置1小时后，用钙荧光探针flu-3AM(1uM)孵育细胞20分钟后，将细胞置于36±1℃恒温灌流槽中，记录给药前后钙荧光强度的变化。(2)用全细胞膜片钳技术记录窦房结自发动作电位，观察细胞内Ca2+被BAPTA螯合或Ryanodine抑制Ca2+释放对AngⅡ抑制自发起搏频率作用的影响。　　
结果：　　
(1)首先用激光共聚焦显微镜观察阳性对照药异丙肾上腺素(ISO)对细胞内钙的影响。与给药前(Control)比较，1μMISO可显著性增大细胞内Ca2+51％(荧光强度102.2±4.71vs.154.5±4.13，P＜0.01，n=5)；与Control比较，100nM AngⅡ可显著性增大细胞内Ca2+37％（荧光强度111±2.53vs.152.4±4.22，P＜0.01，n=5）。　　
(2)利用全细胞膜片钳技术记录窦房结细胞自发动作电位，通过吸破细胞膜，使电极内液中20mMBAPTA进入细胞胞浆。随着BAPTA在胞浆中透析，自发动作电位频率逐渐减慢，在吸破细胞膜第60s，自发动作电位完全消失。电极内液中加入1mM BAPTA，破膜后自发动作电位频率减慢，4分钟后趋向稳定，由176±10次/分钟下降至86.2±5次/分钟（减少51％）(P＜0.01，n=6)，在此基础加入100nM AngⅡ，细胞自发起搏频率进一步下降至38.72±4次/分钟(与给药前比较减少78％)，与不加BAPTA情况相比，100nM AngⅡ抑制作用显著性增强。电极内液应用2μM Ryanodine，窦房结起搏频率显著性降低(P＜0.01，n=6)，从182±12次/分钟减少至91±6次/分钟，约减慢50％，10min后，再应用100nM AngⅡ，AngⅡ对起搏频率不再进一步抑制。改用低浓度Ryanodine(100nM)，自发起搏频率由180±5次/分钟降低至122.4±7次/分钟，下降32％(P＜0.01，n=6)，10min后，作用稳定，再应用100nM AngⅡ，自发起搏频率由122.4±7次/分钟降低至100.8±6次/分钟，与不存在Ryanodine情况相比，100nM AngⅡ抑制作用显著性增强。　　
(3)电极外液应用非特异性PLC抑制剂U-nM)10分钟可完全取消AngⅡ对自发起搏频率的抑制作用。　　
小结：AngⅡ可增加细胞内Ca2+浓度，螯合细胞内Ca2+或抑制Ca2+释放可增强AngⅡ的作用，提示膜钟和钙钟机制共同影响了AngⅡ对窦房结细胞起搏频率的抑制作用，对膜钟的调控降低细胞自律性，而对钙钟的调控可增加细胞自律性，其中以对膜钟的调控作用占主导地位。AngⅡ对膜钟和钙钟的调控均通过激活PLC实现。　　
第三部分 AngⅡ对表达Kv1.5通道的影响　　
目的：分析AngⅡ对异源表达的Kv1.5通道电流影响及其分子机制　　
方法：采用脂质体瞬时转染方法，HEK293细胞共转染人Kv1.5cDNA及人AT1受体基因，观察AngⅡ对通道电流的影响。　　
记录hKv1.5的细胞外液包括(in mM)NaCl140，KC15.4，MgCl21，CaCl22，glucose10，HEPES10(用NaOH调pH至7.4)．电极内液包括(inmM)KC1140，Mg-ATP4，MgCl21，EGTA5，HEPES10(用KOH调pH至7.2).将细胞钳制在-70mV，从-60mV以阶跃电压10mV的方式去极化至+80mV,维持100ms，然后电压复极至+40mV，诱发外向尾电流。细胞钳制在-100mV,短暂去极至40mV,然后超极化至-100mV,持续2s，然后从-70mV开始以阶跃电压10mV的方式逐步去极化至30mV，维持5s，然后细胞最终去极至40mV并持续1s。以在40mV的最大电流进行标化，用Boltzmann方程拟合得到失活曲线，　　
结果：AngⅡ（100nM）可著性抑制hKv1.5电流，应用AngⅡ后，第3分钟左右尾电流幅值减小，20分钟左右抑制作用达到稳态，冲洗后不能恢复。在去极电压为80mV下，AngⅡ使尾电流由18.22±0.4pA/pF减小3.06±0.5pA/pF(P＜0.01，n=6)。以最大尾电流电流密度标准化后用Boltzmann方程拟合得到激活曲线，AngⅡ对Kv1.5通道的半数激活电压没有影响。AngⅡ显著性减小hKv1.5通道的激活、去激活时间常数(P＜0.01，n=6)。应用hKv1.5特异性阻断剂E-4031(2pM)可完全阻断复极时的外向尾电流。细胞钳制在-100mV,短暂去极至40mV,随后超极化至-100mV,持续2s，然后从-70mV开始以阶跃电压10mV的方式逐步去极化至30mV，维持5s，然后细胞最终去极至40mV并持续1s。以40mV的最大电流进行标化，用Boltzmann方程拟合得到失活曲线，V1/2由-20±1.94mV变为-19.4±4.33mV，无显著性差异。表明AngⅡ对Kv1.5通道的稳态失活无明显影响。PKC抑制剂staurosporin(Stau)(100 nM)存在下，AngⅡ(100nM)对hKv1.5的抑制由对照的85.0％减少到11.8％，提示PKC通路介导AngⅡ对hKv1.5的抑制作用。　　
小结：AngⅡ激动AT1受体对Kv1.5电流产生抑制作用，这种抑制作用主要由PKC通路介导。　　
结论：　　
1 AngⅡ通过增大Iks抑制ICaL降低豚鼠窦房结起搏频率，这种抑制作用由AT1受体介导。　　
2 膜钟和钙钟机制共同影响了AngⅡ对窦房结细胞起搏频率的抑制作用，其中以膜钟的调控作用占主导地位。　　
3 AngⅡ激动AT1受体对Kv1.5电流产生抑制作用，这种抑制作用主要由PKC通路介导。　　
本实验结果提示，AngⅡ通过激动AT1受体对窦房结细胞及心房hKv1.5通道具有直接的电生理调控作用，为病理状态下心脏AngⅡ水平升高引发电生理重构、从而易发心律失常提供了一个可能的解释。
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