冰冻切片法观察不脱钙骨组织的荧光分布 | 骨科在线三种骨组织脱钙方法的比较--《解剖学研究》2016年01期
三种骨组织脱钙方法的比较
【摘要】：骨组织制片是一重要环节,也是技术的一个难点。如果骨组织脱钙方法不当,会直接妨碍制片切片以及染色结果。作者对目前科研常用三种不同的脱钙方法进行了比较,从中筛选出一种较好的脱钙方法。认为10%甲酸-中性缓冲福尔马林脱钙液处理骨组织标本是一种较为理想的脱钙方法,具有很好的应用价值和推广作用。
【作者单位】：
【关键词】：
【分类号】：R361.2【正文快照】：
骨组织制片是一重要环节,也是技术的一个难点[1]。骨和其他钙化组织进行制片,必需脱去钙盐,才可切成薄片。骨组织制片,与一般组织相同,但组织固定后,须经脱钙步骤。如果脱钙方法不当,脱钙时间不完全,组织切片时不仅损坏刀刃,而且切片偏厚,染色时组织易出现脱片等现象,会直接妨
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骨组织脱钙方法的比较
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你可能喜欢递增负荷运动雌性大鼠骨组织形态计量学指标的变化特点--《首都体育学院》2009年硕士论文
递增负荷运动雌性大鼠骨组织形态计量学指标的变化特点
【摘要】：
目的:通过大鼠的递增负荷运动,建造过量运动骨量降低动物模型。在此基础上,观察运动对大鼠胫骨上段骨组织形态计量学参数的影响,探讨递增负荷运动对骨代谢的可能影响机制,为运动性骨量降低及骨质疏松的防治提供实验依据。
方法:将动情周期规律的3月龄雌性大鼠随机分为8组,分组进行2、4、6、8、9、11、13、15周的递增负荷运动,并设立同期对照组和基础对照组。在造模过程中监控体重、体成分、阴道脱落细胞、血生化及骨密度等指标的变化。所有大鼠被处死前13、14天皮下注射盐酸四环素25mg/kg各一次,于处死前3、4天注射钙黄绿素5mg/kg各一次,两次荧光标记间隔10天。实验结束后,取大鼠右侧胫骨上段制成不脱钙骨切片,用图像分析系统进行骨组织形态计量学测定。
结果:①持续15周的递增负荷跑台运动中,大鼠逐渐出现体重、体脂百分比、Hb逐渐下降,BUN逐渐升高,动情周期抑制率增高等过度训练的特征性表现,最终出现BMD下降。②大鼠胫骨上段骨组织形态计量学静态参数表现为,骨小梁面积百分数、骨小梁厚度先轻微上升后下降,呈近似倒“V”字形变化,峰值出现在T11组;骨小梁数量随运动负荷增加逐渐降低;骨小梁分离度前期持平,T11-T15明显增加。③动态参数和细胞参数表现为,骨形成参数(标记周长百分数、骨面积水平骨形成率、骨体积水平骨形成率单位、骨小梁面积成骨细胞数和成骨细胞周长百分数)和骨吸收参数(单位骨小梁面积破骨细胞数和破骨细胞周长百分数)呈先下降后上升的V字形变化,T11组达最低点。
结论:①通过15周的递增负荷跑台运动,本研究成功建立了过量运动骨量降低动物模型。②本研究动物模型所致松质骨骨量的降低,主要源于骨小梁形态结构和数量的改变,具体表现为过量运动负荷使得骨吸收和骨形成均增强,骨吸收大于骨形成,大鼠的骨代谢呈现高转换状态。
【关键词】：
【学位授予单位】：首都体育学院【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2009【分类号】：B843.2【目录】：
ABSTRACT8-9
1 前言9-15
1.1 研究背景9
1.2 研究目的和意义9-10
1.3 研究内容10-11
1.4 文献综述11-15
1.4.1 骨组织学基础11
1.4.2 运动与骨代谢11-13
1.4.3 骨量的评价方法13-15
2 研究对象与方法15-23
2.1 研究对象15
2.2 主要试剂和设备15-16
2.3 动物分组及训练方案16-17
2.4 监测指标及测量方法17-18
2.5 组织取样及前期处理18
2.6 骨组织形态计量学测量18-23
2.6.1 不脱钙骨骨标本的包埋[38]18-20
2.6.2 不脱钙骨组织片的制备20-23
3 数据处理23
4 研究结果23-42
4.1 过量负荷运动骨量降低动物模型建造监控指标的变化23-28
4.1.1 体重、体成分的变化23-25
4.1.2 Hb 的变化特点25-26
4.1.3 BUN 的变化特点26-27
4.1.4 阴道脱落细胞学检查27
4.1.5 骨密度的变化27-28
4.2 递增负荷运动下胫骨上段松质骨形态计量学的变化28-42
4.2.1 递增负荷运动下大鼠胫骨骨形态计量学静态参数的变化28-34
4.2.2 递增负荷运动下大鼠胫骨上段松质骨动态参数的变化34-39
4.2.3 递增负荷运动下大鼠胫骨上段细胞参数的变化39-42
5 分析讨论42-48
5.1 过量运动骨量降低模型的建造及递增负荷运动对各监测指标的影响42-45
5.1.1 递增负荷运动对体重、体成分影响42
5.1.2 递增负荷运动对Hb 和BUN 影响42-43
5.1.3 递增负荷运动对阴道脱落细胞的影响43-44
5.1.4 运动对大鼠全身骨密度的影响44-45
5.2 递增负荷运动对大鼠胫骨上段松质骨骨形态计量学影响45-48
5.2.1 递增负荷运动对大鼠胫骨上段松质骨静态参数的影响45-46
5.2.2 递增负荷运动对大鼠胫骨上段松质骨动态参数及细胞参数的影响46-48
6 结论48-49
参考文献49-52
附录 英文缩写对照表53
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用于石蜡切片的骨相关酶（TRAP、ALP）的双重染色法
用于石蜡切片的骨相关酶（TRAP、ALP）的双重染色法
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前言了解活体的骨代谢状态是研究相关细胞生理活性的一个有效方法。对骨组织进行碱性磷酸酶（ALP）染色后可以了解成骨细胞的骨形成情况，对骨组织进行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色可以了解破骨细胞的骨吸收情况。若在同一切片上进行双重染色就能同时了解两者的情况。另外，它有一个优点是在脱钙标本里，只要可以双重染色，无需专用的设备，仅用一般的设备就可以方便地观察到骨代谢。在此前提下，我们需要研究探讨双重染色的可行性。实验材料及方法：2.
标准标本的制作用树脂包埋法或冻结切片法制成的标本作为标准标本，与脱钙的石蜡切片作比较。也就是说，酒精固定小鼠肘关节后，用乙二醇甲基丙烯酸甲酯（GMA）包埋，使用硬组织用的切片机制作成2μｍ的切片，然后进行TRAP与ALP染色（图1）。继而，制成脱钙冻结切片（图2）。之后，研究并改良在固定、脱钙、染色各阶段中双重染色的可行性。图1. 标准标本（GMA树脂包埋）照片是小鼠的肘关节的染色标本，作为本实验的标准标本。左上图是TRAP染色，右上图是ALP染色。下图是两者的双重染色。以此作为阳性对照，与脱钙石蜡切片一起进行染色及染色性的评价。图2. 脱钙冻结切片的酶染色用30%的庶糖液浸泡经柠檬酸脱钙的小鼠腰椎及右上肢，然后经OCT复合物的包埋、Tissue-Tek PINO（Sakura Finetek Japan Co.,Ltd.产品）的冻结、Cryo 3（Sakura Finetek Japan Co.,Ltd.产品）的切割，得到5μｍ的冻结切片。切片进行酶染色。不仅可以进行TRAP染色（左图：红色）与ALP染色（中间：褐色）的单染色，还可以进行双重染色（右图）。图3.　经福尔马林进行第一次固定的固定时间及TRAP/ALP的染色性研究①是没有经过福尔马林固定，只用酒精进行第二次固定的样品，ALP染色显强阳性。TRAP染色显阴性。②是经福尔马林16小时固定及③是4天固定后，TRAP与ALP都能很好地染色。然而，经福尔马林固定一个月后的临床样本（骨软骨肿）虽然TRAP染色显阳性，但ALP不能被染色。图4.
不同种类的脱钙溶液对双重染色的影响最左图是选用酸性脱钙溶液中对组织伤害较少的甲酸福尔马林脱钙溶液脱钙3天（Histra-DC,8～16℃）后的大鼠膝关节。TRAP与ALP都不能被染色。与此相反，中间的柠檬酸盐酸盐脱钙溶液及最右的EDTA脱钙溶液都可以使样品脱钙后进行TRAP/ALP双重染色。3.
关于固定ALP染色使用不是由福尔马林固定的新鲜材料，因此若不在短时间内固定，就会失去其酶活性。我们建议使用80%的酒精去固定。请验证以下情况：①
小鼠的膝关节不进行第一次固定，直接用酒精浸泡进行第二次固定组。②
经福尔马林（4％多聚甲醛溶液）第一次固定小鼠腰椎16小时后，再用酒精进行第二次固定组。③
经福尔马林进行第一次固定小鼠腰椎4天后，再进行第二次固定组。④
临床的样本经福尔马林进行第一次固定小鼠腰椎一个月后，再进行第二次固定组。各组进行TRAP、ALP的双重染色,并检验染色是否可行。图3是染色的研究结果。在本实验中，福尔马林固定时间为16小时至4天的可以进行TRAP、ALP的双重染色。4.
关于脱钙ALP是含有金属（Zn）的蛋白。脱钙作用会使Zn也一并被除去而导致酶失去活性。为了弥补这个缺点，加入硫酸锌（ZnSO4），使ALP活化。每100ml的脱钙溶液加入0.4ml 1%的ZnSO4 溶液，以补充Zn。并且，在作为脱钙溶液柠檬酸盐酸盐缓冲液中添加Zn的同时，加入相同量螯合剂EDTA溶液的相关研究在进行中。也有研究在酸性脱钙溶液（甲酸福尔马林溶液）中的酶是否能反应。结果显示脱钙溶液与柠檬酸一样，在EDTA溶液中能很好地染色。相反，在甲酸福尔马林溶液中不能使酶染色（图4）。此外脱钙方法是用超声波脱钙装置（Histra-DC，普通光度）在8-16℃的低温下，连续操作3-6天，使样品脱钙。脱钙后用甘氨酸与佛罗那 （Veronal）缓冲液(pH7.4)洗净，用磷酸钙在组织上吸附，防止沉淀。5.
关于染色染色法使用的是Lorch的Gomori法。本实验使用的是同时采用偶氮染色法和偶联反应法的TRAP/ALP染色试剂盒（和光纯药，产品编号294-67001）。关于切片的厚度，Lorch建议为8μm，同时也研究过普通的4μm切片是否能染色、双重染色的顺序应该先染TRAP和ALP中的哪一个、封片剂是否必须选水溶性封片剂等问题。染色法的结果是偶氮染色法中，切片过厚就会有酶扩散现象，即骨基质的TRAP染色倾向染成红色。即使是4μm的切片，只要增强了反应条件（反应温度及反应时间），也能充分染色。也就是说，TRAP染色反应温度为室温至37℃，反应时间为30分钟至45或60分钟。ALP染色可在37℃下反应45分钟至3小时，也可在室温（10~15℃）下延长反应时间至一晚。最后，可以得到两者色调平衡、良好的染色结果（图5）。但是，增强反应条件会使ALP染色的切片上产生更多的色素颗粒（图2）。而TRAP与ALP的染色顺序从任意一方开始都可以。但是，先ALP再TRAP染色时，阳性部位呈现明显红色，使用新鲜的破骨细胞染色，能得到相对好的标本。但是ALP的反应原产物因TRAP溶液而产生白色混浊颗粒状体，会在组织上沉淀。因此，先TRAP染色再ALP染色的话会比较好。封片：用甲基绿，几秒即可使核染色，水洗后在37℃下干燥，经二甲苯透明，经屈大麻酚(Marinol)永久封片。有文献建议在透明前使用酒精脱水，但这会使反应产物浸出及扩散。图5. 脱钙石蜡包埋切片的TRAP/ALP双重染色使用1岁小鼠腰椎的EDTA脱钙石蜡切片进行TRAP/ALP双重染色。破骨细胞的TRAP染色呈红色，细胞活性强的细胞（成骨细胞、软骨细胞）ALP染色为褐色。（上面：弱扩大，下面：强扩大）6.
结语TRAP与ALP两种酶在每次固定、脱钙、染色后，只要经过若干改良，就可以使脱钙后的石蜡标本染色。但是，酶扩散现象，特别是在TRAP染色时这种现象更明显。影响因素有多种，主要应该是受固定的影响，若固定不充分，脱钙时很容易出现问题，从而导致酶扩散现象的发生。此外必须注意脱钙自身的影响，也就是说，与非脱钙标本相比，脱钙标本观察到的扩散现象较多。说明标本脱钙很可能导致酶扩散。另外，也应考虑切片的厚度或双重染色的顺序影响。今后我们将向这个方向研究。
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