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【讨论】内皮祖细胞专业讨论区&[精华]
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丁香园准中级站友
请问荧光Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-ac-LDL）的有效期是多少，我上次是2008年7月买的，而且是跟别人合买，别人分装给我的，因此看不到说明书，想知道，我现在的这支还能不能用。
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我要作小鼠骨髓来源EPCs实验，以前没养过细胞，看文献越看越晕，请教战友几个问题1、分离的MNCs差异贴壁，原理是什么，为什么有人培养贴壁，又有人培养非贴壁细胞2、培养出的EPCs到底应该如何鉴定最有说服力，有的文献说要形态的，表面标记组合，功能上的，有的文献就很简单，细胞培养7 d后进行DIL—acLDL与FITC—UEA一1双荧光染色阳性和表面标记物检测3、早期和晚期EPCs到底是怎么一回事，有文献说早期EPCs中含有晚期EPCs克隆，是不是培养2周后早期EPCs逐渐死亡，随着不断换液，晚期EPCs最后多起来，想作EPCs参与肿瘤血管形成，应选择哪一种EPCs4、哪位战友好心回答一下，能提供几篇权威的外文文献吗谢谢
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本人做大鼠骨髓内皮祖细胞，发现提取后培养5天左右全量换液，换液后贴壁细胞很少，实验室老师说换液后细胞密度根本长不起来，想问各位高手是否遇到这种情况，培养基用的是M199+20%胎牛血清，谢谢了
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我现在也出现这样的问题，外周血取pbmnc， 培养的细胞贴壁少，细胞微贴不长，换液后细胞越来越少，后面的试验不容乐观。我用的EGM-2培养液。
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xiaojuan1220 我现在也出现这样的问题，外周血取pbmnc， 培养的细胞贴壁少，细胞微贴不长，换液后细胞越来越少，后面的试验不容乐观。我用的EGM-2培养液。我也是，很发愁阿，是哪里出了问题？
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请教几个问题：我想从大鼠骨髓中分离EPCs，1、用多大年龄的大鼠较好？2、淋巴细胞分离液是用1.077还是1.083？3、Fn铺板一般多长时间合适？
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benben1980 [火星之缘] 我想请教一个问题.我用密度梯度离心法分离大鼠骨髓单个核细胞,后种在培养瓶中发现,细胞密度很大.但是随着换了两次液,不知道为什么,连已经贴壁的细胞都被洗掉了.细胞越来越少 我也出现类似问题，好像前一个星期细胞越来越少，我想请教EPCs究竟什么时间开始大量增殖啊？在第5天培养基中开始出现内皮样细胞，继续培养10天以上，会有内皮克隆簇形成。。
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七月西藏 我向朋友提供的公司电话打过去问EGM-2,对方是introgen公司,他们说自己没有EGM-2,但是有培养内皮细胞的另一种培养液,Human Endothelial-SFM,不知道园子里的兄弟们用过没有,感觉如何.附上说明书.大家也可以看看.这个培养基我用过，不过是用来养角膜内皮细胞的
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我养脐静脉内皮细胞，为什么消化下来收集的不是呢，我用的一型胶原酶，37度消化的，为什么呢？
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谁用过sciencell的ECGS，怎么样啊，比lonza公司的EGM-2便宜1000多，但是效果怎样，谁用过啊，在哪个试剂公司买的
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qjzhou2000 看来楼主是眼科的吧，我前端时间刚刚查了一些角膜内皮细胞的文献，在此与大家一起讨论。关于角膜内皮细胞能否替代角膜内皮的问题，只有一家单位研究过（在综述上看到的），好像可行，不过没有后续研究。两者的起源似乎有些不同，角膜内皮起源于颅神经嵴细胞（外胚层），虽然中间变成间充质样的形态，迁移到一定位置后才分化成角膜内皮细胞。内皮祖细胞来源于胚外中胚层的一些间充质细胞，当然在成体骨髓中也有存在，但讲其胚胎来源还是有所差异。现在没人可以判断一种类型的祖细胞没有分化成为其他细胞类型的能力，可能只是目前的能力有限或者手段受限制而已。自己的一点理解。我也是眼科的~目前想做诱导干细胞向角膜内皮细胞分化的研究，可是这方面的文献好像没大有啊~~有诱导内皮祖细胞向角膜内皮细胞的研究嘛？
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想问一下各位老师，分离外周血单个核细胞后接种到明胶包被的96孔板培养后，发现细胞存活的数量多，但是好像好多活的细胞都是淋巴细胞和单个核细胞，6天后还有好多细胞存活，这样拿去做流式行么，大家养的内皮祖细胞都是这种细胞的混合体么？需不需要纯化啊，
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借地问下楼上的，你明胶是怎么包被的？我试了总觉得不理想。也曾经养出过梭形细胞的，但也是换液后越来越少，也不知是不是EPC
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也就是拿2%的明胶包被后CO2培养箱中过夜，用时将明胶弃去，然后用培养液清洗一下，吹干就可以用啦，也不知道这样对不对，接种后24小时就可以看到培养板中会有一些一簇一簇细胞团，分布很均匀，在10×0.25低倍镜下看不清楚细胞样子，高倍镜下可以，想问一下大家养的时候发现细胞体积都是这么小么
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我用密度梯度离心外周血单个核细胞。在接种后48小时换液，贴壁细胞继续培养，然后每2天换一次液。但几次均出现了相同的情况：第一次换液时贴壁细胞出现（48小时）；第二次换液贴壁细胞较前增多（4天），并且出现梭形改变；第三次换液（6天）时细胞就变得很少，一个低倍视野中没有多少细胞，也基本没有了梭形细胞。这几次的情况都是如此，简直让人崩溃。知道如何解决的战友能否指点一二？十分感谢
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我也是的，本来梭形细胞就不多，结果越换液越少，现在有20多天了，梭形细胞很少，而且好象静止似的，也不知该不该处理掉。
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请问一下楼上，你是用HFN铺的板还是用明胶啊
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明胶，方法和你一样
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wzmc225 最近课题忙，好久没来。应各位战友要求现在将以前我发的文章链接的帖子汇总再发一次共3篇:I:I:I楼上那篇综述翻译成
《内皮祖细胞的动员、分化、归巢》比较合适同意！
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请教各位我养的原代内皮祖细胞，0.25%的胰酶加EDTA，37度十五分钟都消化不下来啊！
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彼岸花2005 meini wrote:这片文献上有很漂亮的EPC集落 &Granulocyte Colony-Stimulating Factor Mobilizes Functional Endothelial Progenitor Cells in Patients With Coronary Artery Disease&(Arterioscler Thromb Vasc Biol. -301.)是pdf 文件,不知道怎么上传,如果有需要请告诉我邮箱.谢谢，发一份给我把，
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starriveryt 我们的试验中发现EPC是比较难消化的，我们用的0.25％的胰酶＋0.02％的EDTA，效果一般，加上吹打大约能消化下来50％左右的细胞，不知其他人有没有用过更大浓度的我的也消化不下来啊，0.25％的胰酶＋0.02％的EDTA，37度15分钟还是下不来，痛苦死了！！
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wzmc225 大家好像都比较沉寂啊。有谁在做鼠源的EPC（APC)培养啊，能大概介绍下方法么？所用的培养体系？是否要用鼠源的生长因子呢？哪里可以买到？我们用的MCDB131,加20%的FBS，VEGF,双抗，细胞长得还不错，但是很难消化下来。
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harry158 最近看到一篇写得很好的综述，发在blood上的，题目是Unresolved questions, changing definitions, and novel paradigms for defining endothelial progenitor cells，很好的论述了近年来对EPC分离和培养的方法，对EPC最新认识和定义，及近年来的最新研究进展，看了后很有帮助，希望与各位共享，共同进步！我的邮箱,谢谢啊，我打不开链接。:I
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wzmc225 非常感谢版主的置顶今天刚看到一篇发表在PHYSIOLOGY上的由Murasawa S和 Asahara T主笔的综述
《 Endothelial progenitor cells for vasculogenesis》，现将其上传和各位战友一同分享，因时间仓促将摘要简单翻译如下：由于骨髓来源的内皮祖细胞在外周血中被分离得到并被证实参与组织部位生理和病理的血管新生过程，并能分化成成熟内皮细胞；所以出生后血管发生（Vasculogenesis）被认为也参与了成人组织血管新生的过程。而内皮祖细胞做为一种参与血管发生过程的主要细胞，将会在治疗缺血性心脏病中显示出非常良好的应用前景。欢迎大家讨论请你发给我一下好吗，我打不开。我的,谢谢！！
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zichuanxu 这是我的细胞在第六天的照片，感觉长得蛮漂亮，大家看一下啊！第六天才这么稀疏的？
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wzmc225 你好yanglong1001站友，说些个人愚见：1.根据你的发帖内容估计你还是没养出晚期EPC，这个方法是有点不同与早期EPC的培养方法，其实在这个讨论区的首帖里就提到2种培养方法，现在想想可能就是早期和晚期EPC的区别，站友不妨可以先看看。（文献已经上传，见我的签名档SOS，文件名EPC）还有篇发表在BLOOD上得经典综述《Unresolved questions, changing definitions, and novel paradigms for defining endothelial progenitor cells》，暂时找不到，稍后上传，文件名EPC2.2.不用这么早传代，晚期EPC养出来后长得很快，长到90％是绝对不成问题。3.这些之类得东西我们都没用过，好像文献上也都没提到:)供参考，GOOD LUCK～请问版主，你的签名档是什么意思？我是新手，不太明白怎么弄到你说的文献。
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本人准备做外周血内皮细胞培养，从杂志上得到些方法，与大家分享。具体方法：（1）分离CD34+细胞种植到带有纤维结合蛋白培养皿中，密度是2 ×106 cells/mL ，培养液IMDM，（ 10%胎牛血清，10%马血清，10-6mol/L的氢化考地松，加入SCGF (100ng/mL; TEBU, Frankfurt, Germany) 和 VEGF (50 ng/mL; TEBU (Sigma))。 常温5% CO2下，细胞孵育14天，（其他细胞因子是否添加取决与细胞增殖情况）用移液器轻轻取出悬浮在培养液上层的细胞，然后换新鲜培养液，计数培养液中增值细胞数，调整为2 × 106 cells/mL ，然后传代进一步观察CD34+分化情况。对粘附、不粘附的CD34+细胞数量进行分析，除去不粘附细胞。（2）分离纯化的CD34+细胞进行培养8-14天，种植在带有0.9%甲基纤维素IMDM半固体培养基中，（30%胎牛血清，1%牛血清球蛋白，10-4mol/L硫氢基乙醇，2 mmol/LL-谷氨酰胺）(complete media from Cell Systems, St. Katharinen, Germany)在平行试验中，培养液中加入相关细胞因子，所有培养基放在37℃，5% CO2 及湿度为 95% 环境中培养，14天后用倒置显微镜观察生长情况。
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sacoma 小弟初涉内皮祖细胞培养，举步维艰，拜读了各位前辈，特别是所罗门的帖子，受益匪浅。
我养的是外周血来源的内皮祖细胞，人动脉血20ml，一般能分出10的7次方个单个核细胞。培养条件为DMEM-F12，FBS20％，VEGF20ng/mL，接种密度4×10 6，24孔板无包被，多次在接种后第一天就能见到大量的小杆状细胞，随液体浮动后可见为椭圆形，不知为何物，继续培养至14天（首次换液为48小时，之后3-4天换液，换液时未加VEGF），可见大量梭形细胞，但无明显的集落，且有很多小圆形杂细胞。不知接种之初的小杆状细胞是什么，与14天时的大量小圆形杂细胞有没有关系？我想问问你，后来换液为什么不加VEGF,是出于什么考虑的？
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bianjian520 我的细胞，大家看看长的怎么样，是否是在分化的内皮祖细胞。谢谢！第10天的这个是不是有点少啊？
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bianjian520 请问一下，做免疫荧光是用多聚甲醛好点吗？我用丙酮的，但细胞好像掉了70％，没剩下几个。还有，dil-ac-ldl的孵育时间和tifc－uea－1的孵育时间都是一个小时吗？我的dil-ac-ldl的说明书上讲要4个小时。你们做这两个的浓度是多少？反正我一直用的多聚甲醛，细胞貌似没有掉呢。
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ssshuiyi 关于祖细胞的流式鉴定，我看见浙江的几个学者单用密度梯度离心CD34就能达到30-50%，很是好奇，我做过一个7天的标本，单阳性也就是5%左右 双阳性才2%左右 还做过一个12天的更低 133几乎不表达 这个我能理解 但是浙江的50%是怎么做出来的呢郁闷中我在浙江，你可不可以告诉我是那几个学者做这个啊？我想搜搜看。希望可以相互探讨。
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qiuming9239 各位好，我是新手，我想请问下：用转染基因的人EPC细胞在小鼠上做研究会有排斥反应吗？能行吗？谢谢！这里的小鼠应该是裸鼠吧，没有免疫力的，我理解。
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请教大家一个问题：在做吞噬DIL-AC-LDL时，是用完全培养基稀释DIL-AC-LDL还是用PBS?那么FITC-UEA呢？请做过的朋友不吝指教哈！
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最近一直在研究从兔子外周血中提取EPC，欢迎大家交流，QQ：
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关于丁香园两种不同内皮祖细胞的分离培养与鉴定--《现代生物医学进展》2015年26期
两种不同内皮祖细胞的分离培养与鉴定
【摘要】：目的:探讨从小鼠骨髓中分离、培养、诱导分化及鉴定两种内皮祖细胞的方法,为进一步研究和临床应用奠定基础。方法:密度梯度离心法分离小鼠骨髓单个核细胞,接种于内皮祖细胞条件培养基,通过贴壁培养法培养出早期内皮祖细胞和晚期内皮祖细胞,并在0 d、6 d、10 d流式鉴定早期内皮祖细胞,在第8周流式鉴定晚期内皮祖细胞。结果:通过体外贴壁扩增培养,从小鼠骨髓细胞中成功培养出EEPC(早期内皮祖细胞)和EOC(晚期内皮祖细胞),表达CD34+/CD133+/VEGFR2+的EEPC比例从最初的0.08%能够增长至70%;EOC大约出现于3-4周,5-8周时呈现指数增长,具有典型的内皮细胞鹅卵石样形态,表达CD31、VEGFR2等内皮细胞表面标志而不表达CD34、CD133等干细胞表面标志。结论:确立了内皮祖细胞体外分离培养和诱导分化的实验方法,为进一步研究奠定基础。
【作者单位】：
【关键词】：
【分类号】：R329.2;Q813【正文快照】：
Chinese Library Classification(CLC):R-33;Q813 Document code:AArticle ID:15)26-5015-04前言内皮祖细胞(EPCs)具有缺血区定向归巢并分化为成熟内皮细胞、促进受损组织的内皮修复、血管新生等重要作用。临床前研究也证明其能够治疗肢体缺血、心肌梗死等缺血性
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【请教】有关内皮祖细胞消化的一个问题
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这个帖子发布于11年零41天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我们实验室用0.02%EDTA 消化，但得到的细胞数总是很少，与消化前观察到的细胞数不相符，请知道的高手帮我们分析一下，先谢了
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flamerking edited on
用纤维连接蛋白选择性贴壁培养法培养内皮祖细胞，内皮祖细胞贴壁比较牢固，特别是梭形细胞，很难消化下来，建议消化时间长些，中止时多吹打，特别是培养板周边，消化完后，可在倒置显微镜下看还剩多少细胞没消化下来，以便调整消化时间，吹打时间，次数。
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我一直用 1mM EDTA in PBS 消化 EPC, 效果还可以，一般分2－3次消化，每次大约6分钟左右。将前一次消化下来的细胞移到离心管中用PBS稀释,这样可以减少吹打和EDTA对已经消化下来细胞的损伤。再根据倒置显微镜中观察到的残存的细胞数决定下一次的消化和吹打的时间。
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我们消化内皮祖细胞时都不敢直接加Trypsin/EDTA,细胞会死的。通常要用Hank's液稀释5倍以上（有师兄稀释T/E10－20倍），消化时间为5分钟内，如果吹打后仍有贴壁细胞，可以像楼上说的那样收集悬浮细胞再消化顽固的贴壁细胞，确实有时很郁闷，给细胞传个代要花半个小时以上。建议细胞密度种大一点，那样传代间期较短，细胞比较容易消化。
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wzzbq 我们实验室用0.02%EDTA 消化，但得到的细胞数总是很少，与消化前观察到的细胞数不相符，请知道的高手帮我们分析一下，先谢了我们也遇到了类似问题，最一开始接种时有10的7数量级，而消化完只剩10的5数量级，少了100倍。而且每次消化完显微镜观察时培养瓶中也基本不剩什么细胞，不知道怎么回事，好像细胞都凭空消失了一样，郁闷！请高手指点，谢谢！
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丁香园荣誉版主
starriveryt 我们也遇到了类似问题，最一开始接种时有10的7数量级，而消化完只剩10的5数量级，少了100倍。而且每次消化完显微镜观察时培养瓶中也基本不剩什么细胞，不知道怎么回事，好像细胞都凭空消失了一样，郁闷！请高手指点，谢谢！在离心过程中也会丢失部分.你可以做下对比,就你所用的酶,再同样的消化条件下,离心一次和二次,对细胞传代后的状态有无太大影响,如果没有,可以只离心一次.如果是离二次,尽量保持二次离心参数一致.
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再请教wzmc225战友两个问题： 1、一个底面积是25平方厘米的塑料培养瓶长满是大概一般有多少细胞？ 2、悬浮的死细胞过几天会不会崩解消失，培养液外观会有什么改变吗？谢谢！
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我今天刚数了一下，25cm培养瓶长满（100％）的总细胞数量为2×10^6悬浮的死细胞过几天会崩解的不过似乎对培养液外观影响不大吧
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丁香园荣誉版主
starriveryt 再请教wzmc225战友两个问题： 1、一个底面积是25平方厘米的塑料培养瓶长满是大概一般有多少细胞？ 2、悬浮的死细胞过几天会不会崩解消失，培养液外观会有什么改变吗？谢谢！1.我们一直是用的培养板,所以这个问题不大好回答,不过在细胞培养(司徒版)上写着25平方厘米的塑料培养瓶长满可获细胞数量5*106.2.赞同dugurui 看法,悬浮的死细胞会崩解,但我想在这之前基本上被我们换液换掉了.培养液外观个人感觉没什么变化.除非量多.
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谢谢各位战友！
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本人培养EPC的经验是加入胰酶消化后，FN并不会脱离培养瓶，所以细胞可以传入原瓶和一个新的培养瓶，这样细胞就不会丢失，效果不错。
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我也碰到类似的问题，细胞都没有了，真是很心痛，分一次细胞实在是工程很浩大呀，就这么都没有了！
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不知道用什么浓度的胰酶比较合适，时间是多长？
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常规用0.25的Trypsin消化,一般情况下贴壁细胞比较难消化下来,可以37度抚育,具体多少时间只能通过随时观察细胞的形状,如果梭形细胞变少明显,就可以吹打,此时细胞较容易吹打下来.一般要消化5min左右.剧有些报道:消化过长可以影响epc的表面标致,因此要尽量在短时间内终止消化.
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谢谢fanglijian519站友！
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消化内皮祖,我做了几次,个人体会是应该分次消化,一般想一次就把所有的细胞消化下来不太可能,分成两到三批是差不多的,离心力的大约八百到一千转五到十分钟就可以,离心力大了对细胞的损伤很大,每离心一次细胞都会有损失
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我培养的大树外周血分离的EPC养了10天，用0.125%trypsin+0.01EDTA消化，第一次约12min，经终止吹打估计细胞下来不到一成（未见到梭形细胞和卵圆形细胞变形）；再加上述消化液约10min，总共消化下来不到两成。将消化下来的细胞另行接种，原25cm2培养瓶继续培养。次日原瓶细胞全部皱缩，第三天全死了；新种的一瓶也全死了。我知道每次消化时间较长，即便如此人有大部分细胞不下来。望各位指教为谢！！
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yanglong1001 edited on
diasy 我一直用 1mM EDTA in PBS 消化 EPC, 效果还可以，一般分2－3次消化，每次大约6分钟左右。将前一次消化下来的细胞移到离心管中用PBS稀释,这样可以减少吹打和EDTA对已经消化下来细胞的损伤。再根据倒置显微镜中观察到的残存的细胞数决定下一次的消化和吹打的时间。 请问你是单用EDTA,不加胰酶吗？EDTA怎么消毒？谢谢！
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anan82战友：EDTA和胰酶解宜选择过滤除菌
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我想请教一个低级的问题：分次消化具体是怎么操作的？是几次消化完了一块中止还是中止以后再重新消化然后再中止再消化？
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看来细胞的消化的确是个问题！！！！！！！！！最近我的经验是分两次消化，先用0.5％trypsin+0.01EDTA消化15分钟（随时观察，看细胞消化情况）。待大部分消化（主要是培养孔周边的先下来）。立即加培基终止，稍微吹打，收集悬液。再在原孔中加同量的消化液，大概5分钟孔中间的细胞就全下来了。大功告成～～～～～～我的经验仅供参考！！
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harry158 用纤维连接蛋白选择性贴壁培养法培养内皮祖细胞，内皮祖细胞贴壁比较牢固，特别是梭形细胞，很难消化下来，建议消化时间长些，中止时多吹打，特别是培养板周边，消化完后，可在倒置显微镜下看还剩多少细胞没消化下来，以便调整消化时间，吹打时间，次数。 你现在还在养内皮祖细胞吗？大概到30天左右，细胞增殖速度减慢的话可能是什么原因呢
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