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【求助】镍柱纯化目的蛋白中咪唑洗脱后用什么去除咪唑
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请问一个问题：在镍柱纯化目的蛋白过程中，用咪唑洗脱蛋白，那么咪唑就会与镍离子结合，那用什么方法去除咪唑呢？查看完整版本请点击这里：
98776langtao ( 17:33:08)
分子克隆上好像写清楚了
怎么进行镍柱的重生的！
fsdd817 ( 17:33:28)
镍柱的使用不是每次都要脱镍再生的。如果纯化的是同一种histag蛋白，当柱载量明显下降或看到柱中镍明显脱落严重时，才需要脱镍再生。如果用的是Ni-NTA，要小心，脱镍再生后可能难耐还原剂了。
fuding6战友的本意可能是问咪唑洗脱完目标蛋白后，咪唑在柱上与镍结合，这个咪唑要不要除去，否则会不会影响下次的吸附纯化。答案是没有关系的，不用特意去考虑这个问题。镍柱纯化过程当中，咪唑的作用就像离子交换柱纯化时的盐一样，是个浓度依赖关系的竞争性结合。只要在使用前用平衡缓冲液充分平衡好柱，就可以进行下一次的纯化了。
实际上，我在使用镍柱纯化时，往往先用高浓度的咪唑将镍全部结合，然后再用平衡缓冲液平衡，这样做一方面可以节省平衡时间，减少平衡缓冲液用量，另一方面可能也有利于减少纯化过程中杂蛋白的弱吸附。
欢迎大家到蛋白版来讨论试验问题！
子衿青青 ( 17:33:47)
请问这个平衡缓冲液是否可以用于纯化结束后冲洗柱子，因为我用的Ni-NTA的柱子，说明书中只说了三种缓冲液：
1×Ni-NTA 结合缓冲液：50mM NaH2PO4，pH 8.0，300mM NaCl，10mM 咪唑
1×Ni-NTA 漂洗缓冲液：50mM NaH2P04，pH 8.0，300mM NaCI，20mM 咪唑
1×Ni-NTA 洗脱缓冲液：50mM NaH2PO4，pH8.0，300mM NaCI，250mM 咪唑
，但不知，最后该用什么缓冲液来冲洗柱子？
fsdd817 ( 17:34:07)
纯化结束后，用高浓度的咪唑缓冲液，如你所写的第三种，50mM NaH2PO4，pH8.0，300mM NaCI，250mM 咪唑将柱子冲洗至基线平稳，然后再用20%的乙醇水溶液冲洗柱子至电导接近零，封好柱接头，4度冰箱保存。
KGZ564 ( 17:34:27)
那请问基线是指什么？基线平稳如何确定？“电导接近零”，又是怎样来确定？做好这些4度保存后，下次用时直接来用就可以了吗？因为初次接触纯化，所以您说的这些概念我不是很清楚，还请指教一下，谢谢！
fsdd817 ( 17:34:48)
基线是指纯化仪器所监测的柱出口流出液的紫外、电导、pH等数值线。
当这些监测线都是成为一条平稳的直线时，就确定基线平稳了。
电导接近零是用纯化仪监测的电导数值接近为零，AKTA、Duoflow等蛋白纯化仪上有。
4度保存的柱子，里面是20%的乙醇水溶液，下次使用时要用柱平衡缓冲液平衡好后才可以用。
你可能没有AKTA、Duoflow之类的好的蛋白纯化仪，所以pH和电导不能在线监测。那就约莫着估计体积，按每种溶液使用量不少于3个柱体积也可以。
cszopen战友最好去找一些关于蛋白质纯化或填料使用说明书仔细看看，对将来的试验有用处。
不客气，乐意为大家解答，欢迎来蛋白版讨论试验问题，大家共同进步！
wsll ( 17:35:08)
我们实验室没有蛋白纯化仪，所以没法做这些。之前做的那次，因为不知该用什么平衡液，就用了最开始的1×Ni-NTA 结合缓冲液，也没有用20%的乙醇水溶液进行处理，不知会不会对柱子有损害？
另外，我用这个柱子纯化时，开始纯化的超声后的上清，用的咪唑浓度是10mM、20mM、250mM来纯化的，最后分四次洗脱，可是除了最后一次洗脱物中有蛋白之外，其他的都没有，而且杂带白也是在最后一步与目的蛋白一起洗脱下来的。整个结果与没纯化之前没太大变化。后来纯化的包涵体用的咪唑浓度是20mM,40mM,100mM,250mM，包涵体也是在最后一次才洗脱下来，而且情况跟前面那次差不多，还是很多杂带，而且在穿过峰中也有明显的目的带，请帮忙分析一下，该怎样优化条件比较合适？另外我见有人在纯化的同时进行复性，就做了一次，用的尿素浓度为6M、5M、4M、3M、2M、1M、0M，结果洗脱液中没有任何蛋白。 而是最后用变性缓冲液把蛋白洗下来了，但有很多杂带。
fsdd817 ( 17:35:26)
20%的乙醇水溶液保存是为了抑制细菌在柱内的生长，因为胶的基质是糖类，容易引起细菌生长。不过如果一次两次时间不长，放在4度冰箱问题不大的，放心吧。
你的镍柱纯化工艺我没有看明白，特别是“开始纯化的超声后的上清，用的咪唑浓度是10mM、20mM、250mM来纯化的，最后分四次洗脱”这句关键的话。
柱上复性看着很美，实际可操作性不高。一般能够柱上复性的蛋白，用透析或稀释法都可以完成。
杂蛋白问题我在你另一个帖子中已回复。
wsll ( 17:35:47)
我纯化工艺就是按照上面说过的结合、漂洗、洗脱三种缓冲液，他们之中的唑浓度分别是10mM、20mM、250mM，最后的洗脱是分四次进行，而结果跑SDS后只在最后一次洗脱中有条带出现，且含有杂蛋白。
fsdd817 ( 17:36:04)
那最后的洗脱是分四次进行是什么意思呢？
wsll ( 17:36:20)
就是洗脱液分四次加入，每次0.5ml，分别回收跑胶。
fsdd817 ( 17:39:33)
就是洗脱液分四次加入，每次0.5ml，分别回收跑胶。
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我明白了，你是用1ml的小柱加注射器方式做纯化的，下次把问题讲清楚哦。
纯化体系太小了，条件不容易重复的。
而且很可能你没有用紫外在线监测，这样，每次不同的溶液洗柱时，是否洗完全根本无法判断。很有可能在杂蛋白没有清洗充分的情况下你就开始了目标蛋白的洗脱。
另外，Ni柱纯化也不是万能的。当表达水平不高时，Ni柱纯化的纯度也不会很好。要结合其他的纯化手段综合运用。
wood533 ( 17:39:57)
想问下，楼主最后怎么确定除去了咪唑？谢谢。
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His-tag蛋白纯化柱子洗脱液中除去咪唑的办法
请问蛋白溶解在250mM咪唑、50mM磷酸二氢钠、300mM氯化钠中的蛋白洗脱液怎样才能除盐将蛋白改溶解在PBS中呢？
透析的话用什么缓冲液透析呢？透析袋浸泡在哪里？我以前用PBS透析有蛋白在透析袋里面析出，好像是咪唑从透析袋出去之后PH变酸了。分子筛柱的话不是应该大蛋白先出来吗？是除盐啊，怎么换缓冲液呢？:hand:
请问超滤的话咪唑和其他无机盐都是等体积滤出吗？那最后咪唑浓度也没有降低啊
稳妥的透析是逐步降低咪唑和盐浓度，到你希望的浓度为止
分子筛的小分子(水，盐，有机小分子，这些跟蛋白不是比大小的关系，不是一个数量级的)肯定先跑出来，如果够浓缩的话，换buffer一步到位，而且还可以进一步纯化蛋白
透析是说将250mM咪唑、50mM磷酸二氢钠、300mM氯化钠配成的洗脱液逐级降低当做透析袋外面的溶液吗？这样就可以？还是只降低咪唑浓度？
呃，弱弱的问一句，分子筛和除盐小柱一样吗？我们实验室以前有人用Thermo的Zeba脱盐离心柱除盐，那个可以吗，请问有用分子筛更换缓冲液的实验步骤吗？
可以加上你要换的buffer，几次之后，buffer就被置换了，大分子的蛋白是被截留的，损失也有，但不太大。
可以使用透析、超滤先除去不要的小分子，再加入需要的小分子，包括新的缓冲溶液，也可以使用分子筛更换缓冲液。
使用使用分子筛更换缓冲液的具体试验方法，请见：
吕宪禹 主编，蛋白质纯化实验方案与应用& & & & ，化学工业出版社，，全书下载：http://emuch.net/bbs/viewthread.php?tid=6307126&fpage=1&target=blank
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【求助】纯化His-tag 蛋白 不同咪唑浓度梯度洗脱 蛋白电泳图
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用Ni sepharose 6 fast flow纯化His-tag 蛋白，刚开始做，先做了咪唑浓度梯度的优化，用了20，60，100，200，300mM的咪唑浓度洗脱，但看了蛋白电泳图，还是找不到合适的咪唑浓度，20-200之间都有目标蛋白和杂蛋白出现
电泳跑的不好？
请大家帮助分析分析，不是应该在低咪唑浓度洗脱不下目标蛋白吗，而我的结果是都能洗出来，而100和200mM更多一些，并且有两个条带，很不解啊！谢谢大家了~查看完整版本请点击这里：
shanzhapia696 ( 13:07:38)
QUOTE:原帖由 eric930 于
13:07 发表
明显200mM的好啊，非特异性带明显少了很多了 我刚开始做，也不是很懂，我是想200mM下还是有杂蛋白，这样纯化出来的蛋白不纯啊
而且目标蛋白在60mM时就开始被洗下来了，这样正常吗？
NBA ( 13:08:00)
怎么看你这图好像反了？
youyou99 ( 13:08:25)
用Ni sepharose 6 fast flow纯化His-tag 蛋白，刚开始做，先做了咪唑浓度梯度的优化，用了20，60，100，200，300mM的咪唑浓度洗脱，但看了蛋白电泳图，还是找不到合适的咪唑浓度，20-200之间都有目标蛋白和杂蛋白出现
电泳跑的不好：????
请大家帮助分析分析，不是应该在低咪唑浓度洗脱不下目标蛋白吗，而我的结果是都能洗出来，而100和200mM更多一些，并且有两个条带，很不解啊！谢谢大家了~
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你试一下先用含10mM Binding Buffer 平衡一下柱子，降低一些非特异性吸附，然后重新梯度洗脱测试，如50，100，150，200，300mM看看
youyou99 ( 13:08:47)
我刚开始做，也不是很懂，我是想200mM下还是有杂蛋白，这样纯化出来的蛋白不纯啊
而且目标蛋白在60mM时就开始被洗下来了，这样正常吗？
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前面杂蛋白都洗出来了，所以你200mM看上去相对较纯，先将样品调到咪唑浓度10mM左右，再重新进行梯度洗脱试试吧。
8princess8 ( 13:10:16)
先用10-20mM咪唑的缓冲液多洗洗，再洗脱
shanzhapia696 ( 13:10:44)
QUOTE:原帖由 NBA 于
13:08 发表
怎么看你这图好像反了？ 呵呵，刚开始做不知道怎么算正怎么算反哦？
应该是什么样的啊？
shanzhapia696 ( 13:11:02)
QUOTE:原帖由 youyou99 于
13:08 发表
用Ni sepharose 6 fast flow纯化His-tag 蛋白，刚开始做，先做了咪唑浓度梯度的优化，用了20，60，100，200，300mM的咪唑浓度洗脱，但看了蛋白电泳图，还是找不到合适的咪唑浓度，20-200之间都有目标蛋白和杂蛋白出现
电泳跑的不好：????
... 是说进行二次纯化吗？
还是说上样前先用含10mM Binding Buffer 平衡一下柱子？做的时候上样前有用含10mM Binding Buffer 平衡过柱子
shanzhapia696 ( 13:11:26)
QUOTE:原帖由 8princess8 于
13:10 发表
先用10-20mM咪唑的缓冲液多洗洗，再洗脱 用10-20mM咪唑的缓冲液多洗了之后，直接用高浓度咪唑洗目标蛋白吗？
bs4665 ( 13:12:03)
呵呵，刚开始做不知道怎么算正怎么算反哦？
应该是什么样的啊？
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把这图垂直翻过来才对
bs4665 ( 13:12:22)
是说进行二次纯化吗？
还是说上样前先用含10mM Binding Buffer 平衡一下柱子？做的时候上样前有用含10mM Binding Buffer 平衡过柱子
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就是刚破完菌后，往样品里添加咪唑使终浓度为10mM左右。然后上样前柱子也要用含10mM咪唑Binding Buffer平衡一下，减少一些非特异性吸附
BUK ( 13:13:06)
不知道你最终要求多少的纯度的？
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个人觉得只靠一个NI柱请亲和的纯化几乎是不可能做到特别高的纯度的。
hulu呼噜 ( 13:13:24)
缓冲体系，pH及盐浓度
对于一些作用力弱的蛋白不能选择带氮原子的的一些缓冲体系，如Tris-HCl等，适当提高缓冲液pH可以增加吸附效果，同样原理可以降低pH洗脱一些咪唑洗不去的杂带。为避免由于电荷作用的干扰，平衡缓冲液中需要加0.1-1M氯化钠，而在平衡缓冲液添加0.1-0.5%吐温或者triton可以降低由于疏水相互作用导致的非特异吸附。
standbyme ( 13:13:52)
我刚开始做，也不是很懂，我是想200mM下还是有杂蛋白，这样纯化出来的蛋白不纯啊
而且目标蛋白在60mM时就开始被洗下来了，这样正常吗？
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你在洗脱前，先用20mM咪唑的洗涤液洗2~3遍再用200mM的咪唑洗脱
shanzhapia696 ( 13:14:29)
不知道你最终要求多少的纯度的？
个人觉得只靠一个NI柱请亲和的纯化几乎是不可能做到特别高的纯度的。
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想在纯化之后做一下蛋白的Km值，最适pH，还有最适温度之类的表征
做这些是不是需要很纯的蛋白呢？
Ni柱纯化后的蛋白可以做这些表征吗？
shanzhapia696 ( 13:14:52)
缓冲体系，pH及盐浓度
对于一些作用力弱的蛋白不能选择带氮原子的的一些缓冲体系，如Tris-HCl等，适当提高缓冲液pH可以增加吸附效果，同样原理可以降低pH洗脱一些咪唑洗不去的杂带。为避免由于电荷作用的干扰，平衡缓冲液中需要加0.1-1M氯化钠，而在平衡缓冲液添加0.1-0.5%吐温或者triton可以降低由于疏水相互作用导致的非特异吸附。
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谢谢，我再调pH试试~
感觉很难得到很纯的蛋白啊
shanzhapia696 ( 13:15:12)
你在洗脱前，先用20mM咪唑的洗涤液洗2~3遍再用200mM的咪唑洗脱
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以前用的10mM，现在改成20mM的试试
zsxan1990 ( 13:16:36)
我感觉你蛋白挂柱有问题。挂的不多。
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