蚓激酶肠溶胶囊有哪些疗效作用 主治功能有哪些
　　可以说，每一种药物都会有一个主治的功能。而且这一个主治的功能举足轻重，因为，人们可以通过主治功能去区分药物。那么，下面由笔者为你介绍，蚓激酶肠溶胶囊有哪些疗效作用?主治功能有哪些?
　　蚓激酶肠溶胶囊适用于缺血性脑血管病中纤维蛋白原增高(纤维蛋白原一种由肝脏合成的具有凝血功能的蛋白质。纤维蛋白是在凝血过程中，凝血酶切除血纤蛋白原中的血纤肽A和B而生成的单体蛋白质。简单地说，就是一种与凝血有关的蛋白质，即凝血因子)及血小板(血小板在长期内被看作是血液中的无功能的细胞碎片，在止血、伤口愈合、炎症反应、血栓形成及器官移植排斥等生理和病理过程中有重要作用)凝集率增高的患者。
　　蚓激酶肠溶胶囊的疗效作用是适用于缺血性脑血管病中纤维蛋白原增高及血小板凝集率增高的患者。还可以治疗缺血性脑血管病;缺血性心血管病;血栓后遗症;外周血管闭塞症;糖尿病;肾病综合症。其中蚓激酶肠溶胶囊的主治功能就是治疗缺血性脑血管病中纤维蛋白原增高及血小板凝集率增高。《药理学》精品课程
第三十六章 作用于凝血系统的药物
Drugs Acting on the Blood Coagulation System
在生理情况下，机体内血液凝固、抗凝血物质的作用和纤维蛋白溶解过程，经常保持在动态平衡状态，从而保证循环重血液不断流动，实现血液的各项功能。一旦这种平衡遭破坏就会出现血栓性或出血性疾病。
第一节 抗凝血药
Anticoagulation
一、凝血酶间接抑制药
肝 素 heparin
肝素：硫酸化的糖胺聚糖的混合物，带大量的负电荷，呈强酸性。平均分子量为12kD
药用来源：猪肠粘膜或牛肺脏
（一）、药理作用
1. 增强抗凝血酶III(ATIII)与凝血酶的亲和力，产生抗凝作用
ATIII：主要灭活IIa和Xa，也灭活IXa, XIa, XIIa, 激肽释放酶和纤溶酶等
2. 高浓度增强肝素辅助因子II(HCII)的抗凝作用
HCII：灭活IIa，还可抑制V, VIII和蛋白C以及抑制血小板的聚集和释放
3. 促进血管内皮细胞释放组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)和内源性组织因子通路抑制物(TFPI)而产生抗血栓作用
t-PA：可激活纤溶系统
TFPI：目前发现唯一抑制VIIa/TF的生理物质
4. 降血脂作用
（二）、体内过程
1．给药途径：静脉给药
2．血浆蛋白结合率：80％
3．分布容积：0.05 C 0.07L/kg
4．代谢：肝脏，经肝素酶分解
5．t1/2：个体差异大，因剂量而异
6．排泄：肾
（三）、临床应用
1.血栓栓塞性疾病
2.弥散性血管内凝血
3.心血管手术、心导管检查、血液透析及体外循环等抗凝
（四）、不良反应
轻度：停药即可
重度：：静脉缓慢注射硫酸鱼精蛋白
2. 血小板减少症(5-6%；与免疫反应有关)
3. 其他（如骨质疏松和自发性骨折（孕妇）；皮疹和发热等）
（五）药物相互作用
不能与碱性药物合用
低 分 子 量 肝 素
Low molacular weight heparin, LMWH
分子量： & 7 kD
来源：普通肝素分离或降解后分离得到
特点（与普通肝素相比）：
1. 出血危险减少 对抗Xa/IIa活性比值增强
2. 不易引起血小板减少 对PF4的抑制作用减少伊 诺 肝 素 enoxaparin
（一）、药理作用
强大而持久的抗血栓作用
1．给药途径：皮下注射
2．达峰时间：3h
1. 深部静脉血栓
2. 血液透析时抗凝
出血；偶见血小板减少
二、凝血酶直接抑制药
基因重组水蛭素 rDNA-hirudin
是水蛭的有效成分水蛭素经由基因重组技术制成
（一）、药理作用
1.抗凝：抑制凝血酶的水解作用（纤维蛋白、血纤肽和纤维蛋白原的降解）
2.抗血栓：抑制V. VIII. XII和凝血酶诱导的血小板聚集
优点（与肝素比较）；
1. 抗凝作用不需ATIII存在
2. 仅抑制凝血酶抑制的血小板凝聚
3. 抗血栓作用强而持久 对与纤维蛋白结合的凝血酶亦有抑制
（二）、体内过程
1．给药途径：静脉注射
2．代谢：较少
3．t1/2：1h
4．排泄：肾(90-95%原型)
（三）、临床应用
1. 血管成形术后再狭窄，不稳定型心绞痛，急性心梗后的溶栓
2. 防治弥散性血管内凝血，血透中血栓形成
三、香豆素（维生素K拮抗药）
华 法 林 warfarin
（一）、药理作用
体内抗凝作用，无体外抗凝作用
机制：竞争性抑制维生素K依赖的凝血因子II, VII, IX, X活化过程中所需维生素K氧化还原酶
（二）、体内过程
1．给药途径：口服且吸收完全
2．血浆蛋白结合率：97％
3．达峰时间：0.5-4h
4．代谢：肝脏
5．t1/2：42-54h
6．排泄：肾
（三）、临床应用
1. 心房颤动和心脏瓣膜病所致血栓；心脏瓣膜修复术
2. 防止髋关节手术静脉血栓
3. 预防复发性血栓栓塞
（四）、不良反应
出血 严重时应停药，并给予维生素K
（五）、药物相互作用
1. 体内维生素K含量降低，本药作用增强
2. 血小板抑制药可与本类药发生协同作用
3. 水合氯醛，羟基保泰松，甲磺丁脲，奎尼丁等使本类药作用增强（提高血浆浓度）
4. 水杨酸盐，丙咪嗪，甲硝唑，西米替丁等使本类药作用增强（抑制肝药酶）
5. 苯妥英钠使本类药作用减弱（诱导肝药酶）
第二节 抗血小板药 Antiplatelet Drugs
一、抑制血小板代谢酶的药物
（一）环氧化酶抑制药
阿 司 匹 林 aspirim
1．药理作用
抑制血小板功能（抑制参与血栓素A2(TXA2)的生成过程中环氧化酶）
2．临床应用
心肌梗死、脑梗死、深静脉血栓性形成和肺梗死等（溶栓疗法的辅助抗栓治疗）
（二）前列腺素类
依 前 列 醇 epoprostanol, PGI2
人工合成的前列腺素类，活性最强的血小板聚集抑制药
1．药理作用
(1). 强大的抗血小板聚集作用(抑制参与cAMP生成的环腺苷酸酶)
(2). 松弛平滑肌 扩张肾血管和支气管
2．体内过程
(1) 给药途径 静脉给药
(2) t1/2 3min
3．临床应用
(1). 体外循环，防止血小板减少、微血栓形成和出血倾向
(2). 肺动脉高压和呼吸困难综合征
4.不良反应
(1). 血压下降、心率加速、头痛、眩晕、潮红等
(2). 胃肠道反应
（三）磷酸二酯酶抑制药
双嘧达莫（潘生丁）
dipyridamole
1.药理作用
抑制血小板聚集(磷酸二酯酶抑制药；增强内源性PGI2活性；增强腺苷活性)
1. 增加血小板内cAMP浓度
2. 增加PGI2活性
3. 抑制腺苷再摄取
4. 轻度抑制血小板环氧化酶
2.体内过程
(1)给药途径：口服但吸收缓慢
(2)血浆蛋白结合率：91-99％
(3)生物利用度：27-59％
(4)达峰时间：1-3h
(5)代谢：肝脏
(6)t1/2 ：10-12h
(7)排泄：胆汁
3．临床应用
心肌梗死、脑梗死、深静脉血栓性形成和肺梗死等（溶栓疗法的辅助抗栓治疗），但不常用
4．不良反应
(1) 胃肠道反应
(2) 血压下降、头痛、眩晕、潮红、晕厥等
(3) 诱发心绞痛
二、特异性抑制ADP活化血小板的药物
噻 氯 匹 定 ticlopidine
（一）药理作用
抗血小板聚集作用
1. 抑制ADP诱导的血小板糖蛋白受体(GPIIb/IIIa)上纤维蛋白原结合位的暴露
2. 抑制ADP诱导的?颗粒分泌
3．拮抗ADP对血小板腺苷酸环化酶的抑制
（二）体内过程
1．给药途径：口服
2．t1/2：8-12h
3．排泄：肾
（三）临床应用
血栓栓塞性疾病及糖尿病性视网膜病
（四）不良反应
1. 中性粒细胞减少（2.4％）（用药3个月内定期检查血象）
2. 腹泻(20%)
2. 轻度出血、皮疹、肝毒性
三、血小板GPIIb/IIIa受体阻断药
阿 伯 西 马 abciximab
抗血小板聚集（血小板GPIIb/IIIa的人、鼠嵌合单克隆抗体）
机制：阻断纤维蛋白原与GPIIb/IIIa结合
精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸多肽（RGD)
抗血小板聚集
机制：抑制纤维蛋白原与GPIIb/IIIa结合
第三节 纤维蛋白溶解药 Fibrinolysin
一、纤溶酶原激活药
链 激 酶 streptokinase
天然的溶栓药，为一种非酶性单链蛋白，现用为基因工程技术制成重组链激酶
（一）药理作用
溶栓（间接激活纤溶酶）
（二）体内过程
1．给药途径：静脉给药
2．t1/2：23min
（三）临床应用
血栓栓塞性疾病 急性心肌梗死、静脉血栓形成、肺栓塞、动脉血栓栓塞、透析通道栓塞、人工瓣膜栓塞等
（四）不良反应
2. 过敏反应
尿 激 酶 Urokinase
由人尿或肾细胞培养液提取的天然溶栓药
（一）药理作用
溶栓（直接激活纤溶酶原）
（二）体内过程
1．给药途径 静脉给药
2．t1/2 16min
（三）临床应用
血栓栓塞性疾病
（四）不良反应
出血但较链激酶轻，无过敏反应
茴香酰化纤溶酶原－链激酶激活剂复合物Anisoylated plasminogen-streptokinase activator complex,
（一）药理作用
溶解血栓（激活血栓上纤维蛋白表面的纤溶酶原）
（二）体内过程
1．给药途径：一次静脉注射
2．t1/2：90-105min
（三）临床应用
血栓栓塞性疾病
（四）不良反应
过敏反应；出血性脑卒中
组织型纤溶酶原激活药
Tissure type plasminogen activator, t-PA
（一）药理作用
血栓溶解（选择性纤维蛋白溶栓药，裂解纤溶酶原精氨酸－缬氨酸处肽键）
（二）体内过程
1．给药途径：静脉给药
2．t1/2：5-10min
（三）临床应用
血栓栓塞性疾病（越早治疗效果越好）
（四）不良反应
出血；过敏反应；低血压
第 三 代 溶 栓 药
利用基因重组技术，改良天然溶栓药，使之溶栓选择性提高，半衰期延长，减少用药剂量和不良反应
二、去纤维蛋白药
安 克 洛 酶 ancrod
马来西亚蛇毒中提取的蛋白水解酶
（一）药理作用
血栓溶解（酶解血浆中纤维蛋白原；促进血管内皮释放组织型纤溶酶原激活物）
（二）临床应用
防治血栓栓塞性疾病
（三）不良反应
出血但较少；有弱抗原性；孕妇禁用
第四节 促凝血药 Coagulant
一、促进凝血因子活性的凝血药
维生素K vitamin K
（一）药理作用
活化凝血因子II, VII, IX, X前体的羧化酶的辅酶
（二）临床应用
用于维生素K缺乏引起的出血
1.低凝血酶原血症(吸收和利用障碍)。如阻塞性黄疸、胆瘘、慢性腹泻、胃肠广泛手术后患者
2. 长期口服广谱抗生素、新生儿出血
3. 口服过量香豆素类和水杨酸类等所致出血
（三）不良反应
1. 局部潮红，出汗，胸闷，支气管痉挛，血压剧降等（静注过快）
2. 溶血和高铁血红蛋白症
二、抗纤维蛋白溶解药
氨 甲 环 酸 tranexamic acid
（一）药理作用
凝血（竞争性阻断纤溶酶原与纤维蛋白结合（结构类似赖氨酸））
（二）体内过程
1．给药途径：口服但吸收缓慢而不完全
2．生物利用度：30-50％
3．达峰时间：2-5h
4．代谢：肝脏
5．t1/2：1-3h
6．排泄：肾
（二）临床应用
1. 纤溶系统亢进引起的出血，如前列腺、尿道、肺、肝、胰、脑、子宫、肾上腺、甲状腺等富含纤溶酶原激活物脏器外伤或手术后出血
2. 一般慢性渗血
（三）不良反应
1. 胃肠道反应
2. 血栓或心肌梗死，偶见颅内血栓
3. 视力模糊、头晕、头痛及嗜睡；低血压
氨 甲 苯 酸
Aminomethylbenzoic acid
* 抗纤溶，但抗纤溶活性低于氨甲环酸
* 临床应用同氨甲环酸
* 不良反应较轻
三、凝血因子制剂
凝血酶原复合物
prothrombin complex concentrate
(一)药理作用
促进凝血 含凝血因子II, VII, IX, X及少量其他血浆蛋白
（二）临床应用
乙型血友病；肝脏疾病；出血（香豆素类过量及维生素K依赖凝血因子缺乏）
（三）不良反应
发热、畏寒等过敏反应，有传播乙肝和其他血源性疾病可能
【思考题】
1． 肝素的抗凝作用机制和临床适应证
2． 抗血小板药和纤维蛋白溶解药治疗血栓栓赛性疾病的机制
【参考文献】
1． 药理学 第五版 金有豫 主编，人民卫生出版社，2001，北京
2． 药理学 第一版 向继洲 主编，科学出版社，2002，北京
3． Lippincott’s Ilustrated Reviews: Pharmacology 2nd edition Mary J
Mycek 主编中国协和医科大学出版社，2002，北京
中南在学药理学 张世勤→ 纤维蛋白原底和凝血酶高是因为什么
纤维蛋白原底和凝血酶高是因为什么
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擅长: 各类型颅脑损伤，颅内肿瘤，脑血管病神经系统变性疾病
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&&&&&&病情分析：&&&&&&纤维蛋白原低和凝血酶高，说明凝血机制障碍，血浆纤维蛋白原降低见于：（1）消耗过多,导致血浆含量减少,如DIC等.（2）纤溶系统活性增强,Fg被分解,如原发性纤溶亢进症等.3）合成减少,如重症肝炎,肝硬化等。&&&&&&指导意见：&&&&&&建议多吃含粗纤维和肌纤维少的食物，如大米、面食、蔬菜、肉类、蛋类、鱼，但忌油煎，最好切成碎末，长期软食者应注意补充维生素C。补充些蔬菜水果，多喝水。
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专利名称一种蛇毒凝血酶及其生产方法与应用的制作方法
技术领域本发明涉及一种凝血酶及其生产方法与应用，特别是涉及一种蛇毒凝血酶及其生产方法与应用。
背景技术 凝血酶以纤维蛋白I为作用底物，迅速转入血管受伤部成为纤维蛋白凝块，阻止血液自受伤部位流出。凝血过程大致分为三个阶段，即凝血因子X的激活；凝血酶原的激活；纤维蛋白原变成纤维蛋白。能使纤维蛋白原变成纤维蛋白的作用称为类凝血酶样作用；能通过激活凝血因子X及凝血酶原而发挥作用的，称为类凝血激酶样作用。蛇毒中含有丰富的蛋白酶，其中一类丝氨酸蛋白酶与蛇伤造成的血液凝固失调等毒理作用密切相关，属于凝血酶类。很多凝血酶样酶(促纤维蛋白原凝固酶)已经从各种蛇毒中提纯，并已先后用于制备临床用药。
1767年，Fontana首次叙述了蛇毒的凝血作用，此后二百多年来，有关蛇毒应用于血液系统的研究不断取得成绩。
1967年从马来亚红口蝮(Agkistrodon rhodostoma)蛇毒中分离的凝血酶样酶(促纤维蛋白原凝固酶)具有脱纤维蛋白的作用，可用于临床，已命名为Ancrod或Arvin，是一种单链的糖肽，含碳水化合物25-36％，由17个氨基酸组成，等电点6.5，分子量35400D±1400D(Ewart，M.R.，Biochem J.，603；Collins，J.P.etal.Eur.JBiochem，26，510)。人体静脉或皮下注射Ancrod，血浆纤维蛋白原水平会依据剂量而减少，因此这种酶制剂Ancrod可用于防治血管栓塞性疾病，又由于它的作用靶位是纤维蛋白原的Aa链，还可用于研究纤维蛋白原到纤维蛋白的转换。
Ouyang(Ouyang，C.，(1957)J.Formosan Med.Assoc，56，435)将从尖吻蝮(Akistrodon acutus)蛇毒中分离的凝血酶样酶称为Acutin，分子量24000，等电点酸性，它作用于纤维蛋白原的a链，分解出纤维蛋白肽A。它还进一步降解已形成的纤维蛋白的a链。Acutin引起纤维蛋白原凝结，形成对血浆溶解高度敏感的结块。Komori等(1988)从尖吻蝮蛇毒中分离出4种具有不同化学和免疫学特性的凝血酶样酶，都能从血纤维蛋白原中分解出纤维蛋白肽A，但其中仅有一种酶像凝血酶一样，能激活凝血因子XII。
昆明动物研究所将从尖吻蝮蛇蛇毒分离出的Acutin称为“去纤酶”应用于临床治疗脑血栓、心脏血栓、眼底静脉血栓及脉管炎，疗效显著。
蝮蛇(Agkistrodon halys pallas)蛇毒中所含的凝血酶样酶，像铜头蝮的A.contortrix毒一样，能选择性地从纤维蛋白原分解出纤维蛋白肽B，是一种单链的糖蛋白，分子量43000D(Ouyang，C.，etal.，(1983)Toxicon，21，797)。该酶的酶活能可被DFP(二异丙基磷酰氟)和PMSF(苯甲基磺酰氟)所抑制，具精氨酸酯酶特性，它分解苯甲酰精氨酸乙酯比胰蛋白酶快2.5倍，分解TAME(对甲苯磺酰精氨酸甲酯)则比胰蛋白酶慢50倍。蝮蛇蛇毒中分离的酶凝结纤维蛋白原很慢，释放血纤肽的动力学分析表明血纤肽Bβ链分裂出来较快，而释放导致凝块形成的血纤肽则较慢，它不像铜头蝮那样由温度取决酶活力大小。我国用于提取抗凝酶的毒蛇已有尖吻蝮、蝮蛇(蛇岛、浙江)。
从南美洲铜头蝮(Agkistrodon contortrix)蛇毒中分离的酶称为“Venzyme”，能从血纤维蛋白原中迅速地分解出血纤肽B，而较慢地释放血纤肽A。Venzyme分子量为64000D，不稳定，在pH 3时空气中暴露2小时，酶活力丧失；pH 10下放置2小时，活性损失60％，pH7时60℃加热30分钟，活力丧失95％(Shimizu，A.，et.al.，(1987)Toxicon，21，679)。由于Venzyme作用于纤维蛋白原的Bβ链，这种独特性可用于研究那些作用于Aa-链的凝血酶(如红口蝮、矛头蝮和响尾蛇的“Anrod”、“batroxobin”、“Crotalase”)形成和凝血酶交叉组合的理化特性。
从蝮蛇日本亚种(Agkistrodon haly brevicaudus)蛇毒中分离的凝血酶(纤凝精氨酸蛋白酶)是分子量为39000D的糖肽，由323个氨基酸残基构成，分子中谷氨酸和天冬氨酸含量较高。
从东部菱斑响尾蛇(Crotalus adamanteus)蛇毒中分离的凝血酶样酶称为响尾蛇酶Crotalase，分子量为32700D，碳水化合物含岩藻糖、甘露糖、半乳糖和葡萄胺，占响尾蛇酶Crotalase干重的5.4％。Crotalase在中性或微碱的磷酸缓冲液中较为稳定，但如在pH5以下的酸性条件，酯酶活性能很快失活(Markland，F.S.，etal.，(1971)J.Biol.Chem.，246，6460)。Crotalase仅从纤维蛋白原分子中分解出血纤肽A，如延长培养将导致纤维蛋白链的降解。Crotalase也用于脱纤维蛋白原疗法。
世界卫生组织将从矛头蝮(Bother atrox)蛇毒中分离纯化的凝血酶样酶命名为“Batroxobin”，它有很多重要的用途，如用于止血称作“Retilase”(蛇酶)或用于脱纤维蛋白原疗法称作Defibrase”(脱纤酶)，用做诊断的工具称作“Reptilase-Reagent”(蛇酶试剂)。自矛头蝮(B.atrox)蛇毒中分离的“Batroxobin”，分子量为43000D；自Bother.moojeni蛇毒中分离的“Batroxobin”，分子量为36000D，由6条二硫链相接，含碳水化合物27％；由己糖、葡糖胺、唾液酸构成的“Batroxobin”是单链的糖肽，等电点6-7。在20℃、pH2.5-9的范围内，在水溶液中仍能保持稳定几小时；在甘油溶液中100℃加热1小时，活性仍无明显损失，表明能从矛头蝮B.atrox或B.moojeni蛇毒中大批量生产Batroxobin(Hofmann，H.，etal.，(1987)Biochemistry，26，780)。止血药Batroxobin是一种局部止血剂，用于流血部位的纤凝作用不为血浆凝血酶抑制剂或任何抗凝介质所抑制。
从B.atrox或是B.moojeni中来的Batroxobin(矛头蝮纤凝酶)像凝血酶样酶ancrid一样，分解纤维蛋白原Aa链上16精氨酸-17甘氨酸酯链，引起血纤肽A释放形成纤维蛋白单体。
国外学者研究表明，Reptilase由两种有效成分组成，具有类凝血酶和类凝血激酶样作用。在正常血管内，Reptilase只发挥类凝血酶样作用，不发挥类凝血激酶样作用，而在血管破损时，Reptilase同时发挥类凝血酶样作用和类凝血激酶样作用。蛇酶Retilase(Pentaphar公司的注册商标CH4002巴塞尔)为含凝血酶homecoagulaes的止血药，血液凝固系统来自B.atrox的毒液。Batroxobin又叫蛇酶，作为引起纤维蛋白I单体形成的媒介，小剂量注射在较长时间可使血液更易凝结。
目前较知名的同类品种为立止血(Reptilase、Hemocoagulase)，它是由瑞士素高大药厂制造的一种用于治疗和预防有出血症状疾病的酶性止血剂，是从巴西洞蝮蛇的毒液中提纯制得的无菌冻干制剂。中国每年进口数百万支“立止血”，价格达3-4亿人民币以上。
白眉蝮蛇[Agkistrodon halys(pallas)]产于中国的长白山，资源丰富，开发价值很高。
本发明的目的是提供一种具有显著止血效果的蛇毒凝血酶及其生产方法。
一种蛇毒凝血酶，自白眉蝮蛇蛇毒中提取；该凝血酶的SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳呈三条带，三条带的分子量分别为54000D，34000D及15000D。
所述凝血酶具有类凝血酶样活性及类凝血激酶样活性。它的SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳的三条带，按照分子量从大到小各带所占比例分别为7-12％，76-86％及7-12％(重量)。该凝血酶对于牛纤维蛋白原的初凝时间为60-120秒；所述凝血酶对于标准人血浆的初凝时间为40-80秒。
一种生产蛇毒凝血酶的方法，包括如下步骤(1)取白眉蝮蛇蛇毒，用缓冲液溶解，离心沉淀，酚饱和溶液洗脱，得到蛇毒凝血酶I级酶制品；(2)将所得的蛇毒凝血酶I级酶制品用缓冲液溶解，再经离子交换柱层析，用缓冲液洗脱，得精制蛇毒酶液。
所述用酚饱和溶液洗脱进行2次为益；所述溶解I级酶制品所用的溶剂是0.05mol/L Tris-HCl缓冲液；I级酶制品所用的离子交换剂为DEAE-Sephadex A-50；离子交换柱层析后用Tris-HCl缓冲液NaCl直线梯度洗脱。
为了得到更加纯化的蛇毒凝血酶，可以对上述获得的精制蛇毒酶液再进行如下加工将所述精制蛇毒酶液冻干，得到精制蛇毒酶液的冻干品；将精制蛇毒酶液的冻干品经脱盐得到蛇毒凝血酶II级酶制品溶液。
精制蛇毒酶液冻干品脱盐所用层析柱为G-75柱；所述全部提取过程在10±2℃的GMP环境中进行。
本发明的第二个目的是提供一种有效的凝血药物及其生产方法。
一种凝血药，它的活性成分是蛇毒凝血酶，该凝血酶自白眉蝮蛇蛇毒中提取；它的SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳呈三条带，三条带的分子量分别为54000D，34000D及15000D。
一种生产凝血药的方法，是将白眉蛇毒凝血酶II级酶制品溶液及其佐剂进行过滤、分装、冷冻、干燥灌封得到的；所述佐剂为甘露醇、水解明胶及注射用水，各种成分的重量(体积)份数比为25％甘露醇125(体积)水解明胶0.5(重量)注射用水350(体积)凝血酶II级酶制品溶液25(体积)。
实验结果表明，本发明的凝血药在0.7U/mg体重的剂量下即有显著的止血作用。研究表明，白眉蛇毒凝血酶能明显缩短家兔出血时间及凝血时间，呈正量效关系，且作用强于立止血。
本发明的凝血酶从中国特产的长白山白眉蝮蛇蛇毒中分离纯化，原料资源丰富，可以为大规模工业化生产提供可靠的保障，实现凝血药物的国产化。
本发明的凝血药物毒性极弱，经毒理试验给小白鼠注射本发明凝血酶的剂量为250Ku/Kg.B.W，相当于临床成人用量的2500倍，表明该药的LD50大于250Ku/Kg.B.W，临床使用安全，具有广泛的应用前景。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
具体实施例方式
实施例1、本发明白眉蛇毒凝血酶及凝血酶药物制剂的生产取白眉蛇毒晶体20g溶于1000ml 0.9％NaCl注射液中，3000转/分离心10分钟，弃去沉淀。调整上清液pH至6.5，然后用0.9％NaCl注射液定容至1000ml。向此溶液中加入饱和硫酸铵溶液670毫升，混合物在室温条件下放置1小时，然后3000转/分离心10分钟，弃沉淀。向上清中加入饱和硫酸铵溶液552毫升，室温放置1小时，混合物3000转/分离心10分钟，弃上清沉淀溶解在1000ml蒸馏水中，调节pH至5.0。向此溶液中加入90％苯酚7.7毫升，混合物在室温条件下放置15小时，3000转/分离心10分钟，弃上清，留沉淀。沉淀用酚饱和溶液洗两次，3000转/分离心10分钟，弃上清，留沉淀，得到蛇毒凝血酶I级酶制品。
沉淀移入含乙酸的95％乙醇中，然后在玻璃负压过滤器中过滤，过滤物用0.05mol/LTris-HCl缓冲液溶解，上DEAE-Sephadex A-50的层析柱，用0.05mol/L Tris-HCl缓冲液NaCl洗脱，流速为0.8-1.0ml/min，然后，用含有NaCl的0.05mol/L Tris-HCl进行直线梯度洗脱，得到精制蛇毒酶液180毫升。
用标准人血浆进行检测，收集能使标准人血浆凝固的部分，比活性100Ku/mg，将收集的精制酶液用冻干机冻干，得冻干粉58mg，取冻干品用水溶解，上G-75柱用0.05mol/L Tris-HCl缓冲液洗脱，得到蛇毒凝血酶II级酶制品溶液250毫升。
上述全部提取过程均在10±2℃的GMP环境中进行。
用标准人血浆进行检测，收集能使标准人血浆凝固的部分，比活性150Ku/mg，经SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳测定呈三条带，分子量分别为5，及15000，各带所占比例分别为7-12％，76-86％及7-12％(重量)。得到的凝血酶对于牛纤维蛋白原的初凝时间为60秒；所述凝血酶对于标准人血浆的初凝时间为40秒。
经配方[甘露醇125ml(25％)、水解明胶0.5g、注射用水350ml、凝血酶25ml]超滤、分装、冻干、灌封得注射用白眉蛇毒凝血酶成品1000支，1Ku/支。
实施例2、本发明白眉蛇毒凝血酶类凝血酶样活性测定本发明白眉蛇毒凝血酶具有类凝血酶样作用及类凝血激酶样作用，通过加入EDTA抑制其类凝血激酶样作用，来观察白眉蛇毒凝血酶对人纤维蛋白原的类凝血酶样作用。
向试管中加入本发明的白眉蛇毒凝血酶样品1ml(每支样品用1ml 5×10-3mol/LEDTA溶解)，分成4组，I、II、III分别为白眉蛇毒凝血酶高、中、低剂量组，剂量分别为2Ku/ml、1Ku/ml、0.5Ku/ml，IV组为空白组(加生理盐水1ml)，各管作用5小时后37℃水浴5分钟，然后向各管加入0.1％人纤维蛋白原1ml，观察并记录人纤维蛋白原凝固时间。结果如表1所示，表1、人纤维蛋白原凝固时间测定结果分组管数(支)样品剂量(Ku/ml)人纤维蛋白原凝固时间
(s)I152 50±6II
140±16IV151ml生理盐水
-aP＜0.01(同I组比较) bP＜0.01(同III组比较)从表1可以看出，在EDTA存在的情况下，本发明的白眉蛇毒凝血酶能使人纤维蛋白原凝固，表现为类凝血酶样作用，同时，白眉蛇毒凝血酶使人纤维蛋白原凝固，呈正量效关系。
实施例3、本发明白眉蛇毒凝血酶的类凝血激酶样活性测定本发明白眉蛇毒凝血酶具有类凝血酶样作用及类凝血激酶样作用，通过加入DFP(二异丙基氟磷酸)抑制其类凝血酶样作用，来观察白眉蛇毒凝血酶的类凝血激酶样作用。
向试管中加入本发明的白眉蛇毒凝血酶样品1ml(每支样品用2×10-3mol/L DFP溶液溶解)，分成4组，I、II、III组分别为白眉蛇毒凝血酶高、中、低剂量组，剂量分别为2Ku/ml、1Ku/ml、0.5Ku/ml，IV组为空白对照组(加生理盐水)，各管作用5小时后37℃水浴5分钟，然后向各管加入缺凝血因子X的标准血浆(6)1ml或标准人血浆(7)1ml，观察并记录血浆凝固时间。结果如表2、表3所示表2、加入缺X因子血浆后的凝固情况分组试管数(支)
样品剂量(Ku/ml)加入缺X因子血浆后凝固情况I
102-II 101-III100.5
-IV 101ml生理盐水
-表3、加入标准人血浆后的凝固情况及凝固时间结果分组试管数(支)
样品剂量(Ku/ml)
加入标准人血浆后凝固时间(s)I
150±16II 101
260±30a.b.c.
III100.5370±41IV 101ml生理盐水-aP＜0.01(同I组比较)bP＜0.01(同III组比)从表中的结果可以看出，在DFP存在的条件下，白眉蛇毒凝血酶不能使缺X因子的标准血浆凝固，但能使标准人血浆凝固，表现为类凝血激酶样作用，呈正量效关系，证明白眉蛇毒凝血酶的类凝血激酶样作用是通过激活X因子而发挥作用的。
实施例4、本发明白眉蛇毒凝血酶对家兔全血的促凝作用与立止血比较蛇毒血凝酶具有类凝血酶样作用及类凝血激酶样作用。家兔给药后，通过观察出血时间及凝血时间，来观察白眉蛇毒凝血酶的促凝作用。
实验动物日本大耳白家兔，体重2-3公斤，雌雄各半。
取家兔50只，分成5组，每组10只，I、II、III组分别为白眉蛇毒凝血酶高、中、低剂量组，剂量分别为4Ku/Kg.BW、2Ku/Kg.BW、1Ku/Kg.BW，IV组为空白对照组，注射2ml/Kg.BW生理盐水，V组为立止血组，剂量为2Ku/Kg.BW。各组静脉注射15分钟后，测定家兔出血时间和凝血时间(出血时间测定采用DuKe氏法--实用医学检验学P116；凝血时间测定采用玻片法--实用医学检验学P129)。结果如表4所示表4
家兔出血时间及凝血时间测定结果分组
例数(只)给药剂量(Ku/Kg.BW)出血时间(s)凝血时间(s)I104 23±4d 75±8dII
102 38±5abc
100±11abcIII
101 51±5d 125±12dIV
180±20V102 42±4
108±10aP＜0.01(同I组比较)bP＜0.01(同III组比较)cP＜0.01(同IV组比较)从表4的数据可以看出，实验组家兔出血时间及凝血时间明显短于对照组，并呈明显剂量依赖关系。表明，本发明的白眉蛇毒凝血酶能明显缩短家兔出血时间及凝血时间，且作用强于立止血。
1.一种蛇毒凝血酶，自白眉蝮蛇蛇毒中提取；该凝血酶的SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳呈三条带，三条带的分子量分别为54000D，34000D及15000D。
2.根据权利要求1所述的凝血酶，其特征在于所述凝血酶具有类凝血酶样活性及类凝血激酶样活性。
3.根据权利要求1或2所述的凝血酶，其特征在于所述凝血酶的SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳的三条带，按照分子量从大到小各带所占比例分别为7-12％，76-86％及7-12％(重量)。
4.根据权利要求1的凝血酶，其特征在于所述凝血酶对于牛纤维蛋白原的初凝时间为60-120秒；所述凝血酶对于标准人血浆的初凝时间为40-80秒。
5.一种生产蛇毒凝血酶的方法，包括如下步骤(1)取白眉蝮蛇蛇毒，用缓冲液溶解，离心沉淀，酚饱和溶液洗脱，得到蛇毒凝血酶I级酶制品；(2)将所得的蛇毒凝血酶I级酶制品用缓冲液溶解，再经离子交换柱层析，用缓冲液洗脱，得精制蛇毒酶液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述用酚饱和溶液洗脱进行2次；所述溶解I级酶制品所用的溶剂是0.05mol/L Tris-HCl缓冲液；I级酶制品所用的离子交换剂为DEAE-Sephadex A-50；离子交换柱层析后用Tris-HCl缓冲液NaCl直线梯度洗脱。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于将所述精制蛇毒酶液冻干，得到精制蛇毒酶液的冻干品；将精制蛇毒酶液的冻干品经脱盐得到蛇毒凝血酶II级酶制品溶液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于精制蛇毒酶液冻干品脱盐所用层析柱为G-75柱；所述全部提取过程在10±2℃的GMP环境中进行。
9.一种凝血药，它的活性成分是蛇毒凝血酶，该凝血酶自白眉蝮蛇蛇毒中提取；它的SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳呈三条带，三条带的分子量分别为54000D，34000D及15000D。
10.一种生产凝血药的方法，是将白眉蛇毒凝血酶II级酶制品溶液及其佐剂进行过滤、分装、冷冻、干燥灌封得到的；所述佐剂为甘露醇、水解明胶及注射用水，各种成分的重量(体积)份数比为25％甘露醇125(体积)水解明胶0.5(重量)注射用水350(体积)凝血酶II级酶制品溶液25(体积)。
本发明公开了一种蛇毒凝血酶及其生产方法与应用。本发明所提供的蛇毒凝血酶，自白眉蝮蛇蛇毒中提取；该凝血酶的SDS－聚丙稀酰胺凝胶电泳呈三条带，三条带的分子量分别为54000D，34000D及15000D。本发明生产蛇毒凝血酶的方法，包括如下步骤(1)取白眉蝮蛇蛇毒，用缓冲液溶解，离心沉淀，酚饱和溶液洗脱，得到蛇毒凝血酶I级酶制品；(2)将所得的蛇毒凝血酶I级酶制品用缓冲液溶解，再经离子交换柱层析，用缓冲液洗脱，得精制蛇毒酶液。本发明的凝血药物毒性极弱，临床使用安全，具有广泛的应用前景。
文档编号C12N9/74GK131420
公开日日 申请日期日 优先权日日
发明者于洪儒 申请人:锦州泰康生物工程有限责任公司