不同剂量重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白治疗强直性脊柱炎疗效比较--《中华风湿病学杂志》2007年04期
不同剂量重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白治疗强直性脊柱炎疗效比较
【摘要】：目的观察短期不同剂量重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子(TNF)受体-抗体融合蛋白(rhTNFR-Fc)治疗我国强直性脊柱炎(AS)患者,并比较其不同的临床疗效。方法20例患者随机分成2组,分别给予25 mg,1次/3d和50mg,1次/7d,连续给药8次,在不同时间点评价ASAS20、ASAS50、BASDAI50等指标。结果两组在第1、4、8次给药及停药后20d ASAS20、ASAS50、BASDAI50差异无统计学意义(P0.05);在总剂量相同(200mg)但是不同用药间隔情况下,25mg组患者与50 mg组相比,达到ASAS20、ASAS50、BASDAI50改善的例数差异也无统计学意义。其他指标在不同时间点差异均无统计学意义。结论rhTNFR-Fc两种剂量不同时间间隔治疗我国AS患者时,见效时间、疗效维持时间上差异无统计学意义;同时,总剂量相同时,两种剂量不同时间间隔用药差异也无统计学意义,但50 mg,1次/7d给药更方便,可增加患者的依从性。
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：R593.23【正文快照】：
肿瘤坏死因子一(tumo:neerosis faeto、，TNF拟)在强直性脊柱炎(ankylosing Spondy一itis，As)及其相关的脊柱关节病的发病机制中发挥重要的作用。从2000年开始，国外尝试使用抗TNF一a生物制剂治疗包括AS在内的脊柱关节病，取得明显疗效，疾病活动性、患者的功能和生活质量明
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京公网安备75号家蚕表达重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白的研究--《浙江理工大学》2012年硕士论文
家蚕表达重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白的研究
【摘要】：类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一种常见的累及关节的自身免疫性疾病。研究表明，肿瘤坏死因子TNFα是RA病理机制中的关键因子，重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白(rhTNFR-Fc)是一种可溶性肿瘤坏死因子拮抗剂，可特异性地与体内的肿瘤坏死因子（TNFα）竞争性结合，从而抑制TNFα诱发的关节免疫反应，达到治疗类风湿性关节炎的目的。
家蚕杆状病毒表达系统作为一种新的真核表达系统，具有生产成本低、安全性高、高效、表达产物翻译后修饰水平高等优势，是外源蛋白表达研究的理想表达系统。本研究尝试利用家蚕杆状病毒表达系统来表达纯化重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白(rhTNFR-Fc)。
首先，我们利用Bac-to-Bac系统构建了重组转移载体pFast-BacⅠ-（rhTNFR-Fc），并转化大肠杆菌感受态DH10Bac筛选出重组Bacmid。用脂质体介导法将重组Bacmid转染家蚕BmN细胞，获得重组杆状病毒vBm-（rhTNFR-Fc）。然后将扩增的F4代重组病毒感染家蚕BmN细胞，接种家蚕五龄幼虫和蚕蛹，经鉴定目的蛋白在BmN细胞、蚕血淋巴和蚕蛹中均得到表达。我们从蚕血淋巴中纯化得到rhTNFR-Fc融合蛋白，利用糖苷酶PNGaseF对纯化后的蛋白进行酶切去糖基化分析，酶切后的rhTNFR-Fc蛋白比去糖基化前小2~3kDa，但比预期分子量还要大，说明rhTNFR-Fc蛋白在该表达系统中得到了N-糖基化修饰，并可能存在O-糖基化修饰。最后，我们采用夹心ELISA法检测融合蛋白rhTNFR-Fc的受体结合活性，并用MTT法检测该蛋白的中和活性，结果表明纯化后的目的蛋白具有很好的体外生物学活性，为接下来研究该蛋白对佐剂型大鼠关节炎模型的治疗效果奠定基础。
本研究证实利用家蚕杆状病毒表达系统可以高效表达并纯化出有生物活性的重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白(rhTNFR-Fc)，为该蛋白的高效表达提供了一种新途径，也为在家蚕杆状病毒表达系统中表达其它的Fc融合蛋白和抗体提供了参考。
【关键词】：
【学位授予单位】：浙江理工大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2012【分类号】：R593.22【目录】：
摘要5-6Abstract6-8缩略语8-9目录9-121 引言12-18 1.1 重组抗体药物研究进展12-13 1.2 肿瘤坏死因子受体- Fc 融合蛋白的研究13-15
1.2.1 类风湿性关节炎13
1.2.2 肿瘤坏死因子13-14
1.2.3 肿瘤坏死因子受体14-15
1.2.4 肿瘤坏死因子受体-Fc 融合蛋白的研究进展15 1.3 家蚕杆状病毒表达系统15-18
1.3.1 家蚕杆状病毒表达系统研究进展15-17
1.3.2 Bac- to- Bac 系统17-182 实验方案设计18-21 2.1 研究的目的和意义18 2.2 研究内容18-20 2.3 实验流程图20-213 rhTNFR-Fc 基因的生物信息学分析21-26 3.1 序列与工具21
3.1.1 序列21
3.1.2 生物信息学工具与软件21 3.2 生物信息学分析结果21-25
3.2.1 rhTNFR-Fc 基因序列比对21-22
3.2.2 疏水性分析22-23
3.2.3 跨膜区分析23-24
3.2.4 信号肽分析24
3.2.5 二级结构预测24-25
3.2.6 高级结构预测25 3.3 讨论25-264 rhTNFR-Fc 基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达26-43 4.1 材料与试剂26-27
4.1.1 材料26
4.1.2 试剂26-27
4.1.3 主要溶剂的配制27 4.2 方法27-36
4.2.1 重组转移载体的构建27-30
4.2.2 重组 Bacmid-(rhTNFR-Fc)的构建30-32
4.2.3 家蚕细胞 BmN 的复苏、培养与冻存32-33
4.2.4 重组病毒 vBm-(rhTNFR-Fc)的构建33-34
4.2.5 rhTNF-Fc 蛋白在家蚕 BmN 细胞中的表达及鉴定34-35
4.2.6 rhTNFR-Fc 蛋白在家蚕蚕血淋巴中的表达及鉴定35-36
4.2.7 rhTNFR-Fc 蛋白在家蚕蚕蛹中的表达及鉴定36 4.3 结果36-42
4.3.1 PCR 扩增 rhTNFR-Fc 基因片段结果36
4.3.2 重组质粒 pFastBac Ⅰ-（rhTNFR-Fc）的鉴定结果36-37
4.3.3 重组 Bacmid-(rhTNFR-Fc)的 PCR 鉴定结果37-38
4.3.4 重组病毒 vBm-(rhTNFR-Fc)的鉴定结果38-39
4.3.5 家蚕 BmN 细胞中 rhTNFR-Fc 蛋白的 Western Blotting 鉴定结果39-40
4.3.6 家蚕 BmN 细胞中 rhTNFR-Fc 蛋白的免疫荧光鉴定结果40
4.3.7 家蚕蚕血淋巴中 rhTNFR-Fc 蛋白的 Western Blotting 鉴定结果40-41
4.3.8 家蚕蚕蛹中 rhTNFR-Fc 蛋白的 SDS-PAGE 和 Western Blotting 鉴定结果41-42 4.4 讨论42-435 融合蛋白 rhTNFR-Fc 的纯化43-56 5.1 材料与试剂43
5.1.1 材料43
5.1.2 试剂43
5.1.3 主要试剂的配制43 5.2 方法43-46
5.2.1 家蚕 BmN 细胞中 rhTNFR-Fc 融合蛋白的纯化43-44
5.2.2 家蚕五龄幼虫血淋巴中的 rhTNFR-Fc 融合蛋白的纯化44-45
5.2.3 纯化后 rhTNFR-Fc 融合蛋白的质谱分析45
5.2.4 纯化后 rhTNFR-Fc 融合蛋白的糖基化修饰初步分析45-46 5.3 结果46-54
5.3.1 家蚕 BmN 细胞中 rhTNFR-Fc 融合蛋白的纯化结果46-47
5.3.2 家蚕五龄幼虫血淋巴中 rhTNFR-Fc 融合蛋白的纯化结果47-50
5.3.3 纯化后 rhTNFR-Fc 融合蛋白的质谱鉴定结果50-52
5.3.4 纯化后 rhTNFR-Fc 融合蛋白的糖基化修饰分析结果52-54 5.4 讨论54-566 rhTNFR-Fc 融合蛋白的生物学活性测定56-63 6.1 材料与试剂56-57
6.1.1 材料56
6.1.2 试剂56
6.1.3 主要试剂配制56-57 6.2 方法57-60
6.2.1 夹心 ELISA 法检测 rhTNFR-Fc 融合蛋白的受体结合活性57-58
6.2.2 L929 细胞的培养58-59
6.2.3 MTT 法检测 rhTNFR-Fc 融合蛋白的中和活性59-60 6.3 结果60-62
6.3.1 融合蛋白 rhTNFR-Fc 的结合活性测定结果60-61
6.3.2 融合蛋白 rhTNFR-Fc 的中和活性测定结果61-62 6.4 讨论62-63结论63-64参考文献64-67致谢67
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重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体－抗体融合蛋白关节腔注射联合中药薰洗治疗膝骨关节炎的临床研究
目的：观察注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体－抗体融合蛋白（recombinant human tumor necrosis factor receptor －Fc fu-sion protein，rhTNFR：Fc）关节腔注射联合中药薰洗治疗膝骨关节炎的临床疗效。方法：将60例膝骨关节炎患者随机分为2组，每组30例。分别采用关节腔注射 rhTNFR：Fc 联合中药薰洗和关节腔注射玻璃酸钠联合中药薰洗治疗。比较治疗前后2组膝关节疼痛视觉模拟评分（visual analogue score，VAS）及西安大略和麦克马斯特大学（Western Ontario and McMaster Universities，WOMAC）骨关节炎评分，并于治疗结束后3个月比较2组患者的综合疗效。结果：治疗前2组患者的膝关节 VAS 评分及 WOMAC 评分比较，组间差异均无统计学意义[（7．15±1．09）分，（6．90±1．52）分，t ＝1．045，P ＝0．309；（54．75±3．23）分，（55．45±3．11）分，t ＝0．700，P ＝0．493]。治疗结束后3个月，2组患者的膝关节 VAS 评分[（3．05±0．76）分，（4．10±0．97）分]及 WOMAC 评分[（16．55±2．65）分，（27．20±3．17）分]均较治疗前下降（t ＝14．173，P ＝0．000；t ＝10．101，P ＝0．000；t ＝34．451，P ＝0．000；t ＝39．161，P ＝0．000）；rhTNFR：Fc 组的膝关节 VAS 评分及 WOMAC 评分下降幅度均大于玻璃酸钠组[（4．10±1．29）分，（2．80±1．31）分，t ＝3．771，P ＝0．001；（38．20±4．96）分，（28．25±3．23）分，t ＝8．132，P ＝0．000]。治疗结束后3个月，rhTNFR：Fc 组治愈10例、显效12例、有效7例、无效1例，玻璃酸钠组治愈6例、显效8例、有效13例、无效3例，rhTNFR：Fc 组疗效优于玻璃酸钠组（Z ＝1．987，P ＝0．047）。结论：采用关节腔注射 rhTNFR：Fc 联合中药薰洗治疗膝骨关节炎，可以有效缓解膝关节疼痛，促进膝关节运功功能恢复，疗效优于关节腔注射玻璃酸钠联合中药薰洗治疗，值得临床推广应用。
Abstract：
Objective:To observe the clinical curative effects of intra-articular injection of TypeⅡrecombinant human tumor necrosis factor receptor -Fc fusion protein(rhTNFR:Fc)combined with Chinese herbal steaming and washing therapy for treatment of knee osteoar-thritis(KOA).Methods:Sixty patients with KOA were randomly divided into 2 groups,30 cases in each group.The patients were treated with combination therapy of intra-articular injection of rhTNFR:Fc with Chinese herbal steaming and washing(rhTNFR:Fc group)and com-bination therapy of intra-articular injection of sodium hyaluronate(SH)with Chinese herbal steaming and washing(SH group)respectively. The knee visual analogue score(VAS)and Western Ontario and McMaster Universities(WOMAC)osteoarthritis score were compared be-tween the 2 groups before and after the treatment,and the total clinical curative effects were also compared between the 2 groups at 3 months after the end of the treatment.Results:There was no statistical difference in the knee VAS scores and WOMAC scores between the 2 groups before the treatment(7.15 +/-1.09 vs 6.90 +/-1.52 points,t =1.045,P =0.309;54.75 +/-3.23 vs 55.45 +/-3.11 points,t =0.700, P =0.493).The knee VAS scores(3.05 +/-0.76,4.10 +/-0.97 points)and WOMAC scores(16.55 +/-2.65,27.20 +/-3.17 points)of all patients decreased at 3 months after the end of the treatment(t =14.173,P =0.000;t =10.101,P =0.000;t =34.451,P =0.000;t =39.161,P =0.000).The decreased degree of knee VAS scores and WOMAC scores of rhTNFR:Fc group were greater than those of SH group(4.10 +/-1.29 vs 2.80 +/-1.31 points,t =3.771,P =0.001;38.20 +/-4.96 vs 28.25 +/-3.23 points,t =8.132,P =0.000). At 3 months after the end of the treatment,10 patients were cured,12 got a good result,7 fair and 1 poor in the rhTNFR:Fwhile 6 patients were cured,8 got a good result,13 fair and 3 poor in the SH group.The rhTNFR:Fc group surpassed the SH group in the curativeeffect(Z =-1.987,P =0.047).Conclusion:The therapy of intra-articular injection of rhTNFR:Fc combined with Chinese herbal steaming and washing can effectively relieve the knee pain and promote the knee function recovery in the treatment of KOA,and its curative effect is better than that of intra-articular injection of SH combined with Chinese herbal steaming and washing,so it is worthy of popularizing in clinic.
WANG Danhui
LIU Lijuan
TIAN Xueqiu
LIANG Yinan
WEI Fengjuan
作者单位：
吉林省中医药科学院,吉林 长春,130021
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万方数据电子出版社重组人肿瘤坏死因子α衍生物的制备及聚乙二醇修饰--《中国协和医科大学》2008年硕士论文
重组人肿瘤坏死因子α衍生物的制备及聚乙二醇修饰
【摘要】：
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种抗肿瘤细胞因子,对各种肿瘤细胞有直接细胞毒作用,可激活机体的抗肿瘤免疫反应,引起肿瘤的缺血性坏死,其作为一种潜在的抗肿瘤药物的开发前景引起国内外的广泛重视。目前,其在国内外临床上有广泛的应用,常用于肝癌、宫颈癌的治疗,虽然其抗肿瘤的功能得到了充分的肯定,但是在使用过程中仍具有毒副作用、稳定性差、半衰期短等缺点。
蛋白质PEG修饰技术在过去的近15年中得到了快速发展,已有多篇文献报道,蛋白质药物经PEG修饰后降低了免疫原性、提高了稳定性、延长了半衰期,并用于临床治疗各种疾病。本文拟通过对肿瘤坏死因子-α衍生物的聚乙二醇修饰,获得低毒性、低免疫原性、高稳定性的肿瘤坏死因子-α。
对天然TNF-α结构与功能关系的研究表明,适当改变其结构,可提高其杀伤肿瘤细胞的活性,降低其对组织器官的毒副作用。本研究应用搭桥PER技术,将肿瘤坏死因子-α基因的前4位氨基酸的编码序列删除,对hTNF-α的第8/9/10/29/31/157位氨基酸的密码子进行定点突变,将突变后的cDNA插入到pBV220载体中构建重组质粒pBV220-tnf-αD4。将重组质粒转化大肠杆菌DH5α,筛选获得了高效表达TNF-αD4突变体的工程菌,表达的重组蛋白约占菌体蛋白总量的45%左右,经硫酸铵沉淀和阳离子交换层析纯化得到纯度达90%以上的重组目蛋白,比活性达到8×10~7。
在TNF-α的PEG修饰试验中,应用了三种不同分子量的单甲氧基聚乙二醇丁醛(mPEG-丁醛分子量分别为5k、10k、20k)对TNF-α衍生物TNF-αD4进行修饰。通过试验确定了最佳修饰条件,即反应pH6.0,TNF-αD4与mPEG-丁醛(5k)质量比1:2;TNF-αD4与mPEG-丁醛(10k)质量比1:4;TNF-αD4与mPEG-丁醛(20k)质量比1:8,反应时间16h为最佳反应条件。修饰产物经阳离子交换层析纯化得到了较纯的mPEG-TNF-αD4,纯度达85%以上。随后,对TNF-αD4聚乙二醇单一修饰产物的部分性质进行了研究,结果表明TNF-αD4及对其的聚乙二醇修饰达到了预期研究目标。mPEG-TNF-αD4(5k)的比活性达到8.6×10~7、mPEG-TNF-αD4(10k)比活性达到3.8×10~7、mPEG-TNF-αD4(20k)比活性达到7.5×10~6。与TNF-αD4相比,mPEG-TNF-αD4(5k)、mPEG-TNF-αD4(10k)、mPEG-TNF-αD4(20k)的免疫原性降低。此项工作通过应用PEG修饰肿瘤坏死因子-α衍生物,为降低其毒性,增加其活性进行了有益的尝试,为其进一步研究与开发奠定了基础。
【关键词】：
【学位授予单位】：中国协和医科大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2008【分类号】：R94【目录】：
ABSTRACT6-8
一、实验材料及方法12-27
(一)、实验材料12-14
(二)、实验方法14-27
二、结果与分析27-37
(一)、tnf-α基因的扩增及表达载体的构建27-28
(二)、TNF-α D4的诱导表达28-29
(三)、蛋白的大量表达及纯化29-32
(四)、TNF-α D4的PEG修饰与纯化32-35
(五)、体外生物活性检测35
(六)、体内系统毒性检测35-36
(七)、免疫原性检测36-37
三、讨论37-45
(一)、肿瘤坏死因子-α衍生物TNF-α D4的制备37-40
(二)、目的蛋白修饰产物的制备及纯化40-42
(三)、修饰产物体外活性和免疫原性42-45
四、小结45-46
参考文献46-50
论文综述50-63
作者简历71
发表的文章71-72
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