分离脾细胞请问解决办法(脾细胞,脾脏,培养皿,小鼠) - 免疫实验 - 生物秀
标题: 分离脾细胞请问解决办法(脾细胞,脾脏,培养皿,小鼠)
摘要: [分离脾细胞请问解决办法(脾细胞,脾脏,培养皿,小鼠)] 本人实验，从巨脾小鼠的脾脏中分离脾细胞，当时发现脾脏与周围组织有粘连，计数细胞10 8-9，结果第二天 肉眼看到 漂浮在培养皿的的一团块，其他地方无细胞？是否是 细胞团呢？？请教解决办法？离心后细胞几乎没有了。谢谢 关键词:[脾细胞 脾脏 培养皿 小鼠 漂浮]……
本人实验，从巨脾小鼠的脾脏中分离脾细胞，当时发现脾脏与周围组织有粘连，计数细胞10 8-9，结果第二天 肉眼看到 漂浮在培养皿的的一团块，其他地方无细胞？是否是 细胞团呢？？请教解决办法？离心后细胞几乎没有了。谢谢
回复当时发现脾脏与周围组织有粘连，计数细胞10 8-9，结果第二天 肉眼看到 漂浮在培养皿的的一团块，其回复不明白你的表述，在完全培养基里培养的？培养时细胞量就10的8次方？一天后不可能会没有的啊回复你不会是把整个脾脏都扔到培养液里培养了吧，那肯定不行。主要是将脾脏置于盛有培养液的培养皿中，液体不用多，用两个镊子，一个镊子固定脾脏，另一个镊子将脾脏中的脾细胞通一点点通过脾脏表面开的小开口赶出来，是一点一点的赶出来，让脾细胞尽量分散。你会看到最后培养液浑浊了，那就是脾细胞出来了，而且分散的不错，最后的脾脏你可以看到只剩下一层半透明的筋膜了。你试试吧回复将脾脏放在平皿中加入1640培养液，用两张长的盖玻片，一张固定住脾脏，另一张轻轻刮擦脾脏，使之匀浆于培养液中，然后70um滤网过滤, 再加入红细胞裂解液裂解红细胞，用培养液洗几遍就行了回复将脾脏取下后，要在100目的金属筛网上用玻璃棒研磨的，那样才能得到单细胞悬液。回复脾脏在加入RPMI-1640玻璃皿中用玻片毛面挤压轻摩，用30μm尼龙网过滤制备好的脾细胞悬液；离心（1200rpm/ 10min）收集细胞后，滴加氯化铵红细胞裂解液，作用5min后，加适量RPMI-1640终止裂解，离心去上清；用RPMI-1640洗涤两次（1000 10min），最后用PBS调整细胞浓度回复我用的200目的尼龙网，就是取脾后用200目尼龙网罩在小的培养皿上，下面放上1640就好了，小心研磨，然后250g离心就好了，不会没有的，
相关热词：
..........
生物秀是目前国内最具影响力的生物医药门户网站之一，致力于IT技术和BT的跨界融合以及生物医药领域前沿技术和成功商业模式的传播。为生物医药领域研究人员和企业提供最具价值的行业资讯、专业技术、学术交流平台、会议会展、电子商务和求职招聘等一站式服务。
官方微信号：shengwuxiu
电话：021-关注今日：10 | 主题：205326
微信扫一扫
扫一扫，下载丁香园 App
即送15丁当
【求助】小鼠脾脏能够分离多少个单个核细胞
页码直达：
这个帖子发布于5年零187天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我正在做过继转移细胞实验，需要过继2×10的7次方T淋巴细胞，然后我分离一只小鼠不够打一只，一般小鼠脾脏分离多少个单个核细胞，我是用尼龙毛分离的
不知道邀请谁？试试他们
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
一般，小鼠的脾脏能够分离5×10^7的细胞。尼龙毛法分离T细胞的方法已经淘汰 了。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
kern6549 尼龙毛法分离T细胞的方法已经淘汰 了。确实大家认可的方法是磁珠分离，但太昂贵，有什么经济、使用的方法可推荐吗？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
磁珠分离就是目前最经济的使用方法。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
磁珠分离，我们也用！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
接着讨论一下，与做B细胞与IgE方面的研究，改选择哪种磁珠好呢？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
关于丁香园关注今日：10 | 主题：205326
微信扫一扫
扫一扫，下载丁香园 App
即送15丁当
【求助】小鼠脾细胞分离后保持活力的问题
页码直达：
这个帖子发布于4年零249天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
在实验中需要分离脾细胞后进行MTT等检测，活力要求较高，查过不少文献，都说通过Hanks液灌注，研磨过筛后能得到活力高达90%（活细胞占总细胞90%）的脾细胞，但是我实际操作下来，总是达不到，50%左右。步骤如下：无菌取小鼠脾，将表面的脂肪和结缔组织尽量去尽，然后立即放入冰上预冷的Hanks液中。用注射器吸取预冷的Hanks液，对脾进行灌注冲洗，冲出大部分脾细胞，过300目筛，筛下是无菌培养皿，也是在冰上。然后用注射器的活塞橡胶头在筛子上轻轻研磨脾，研磨时，脾和部分筛在培养皿中的HANKS液面下(不是干磨，是湿的磨），直到脾发白，然后用预冷的Hanks液冲洗筛子，尤其是脾所在的位置，总共得到12ml细胞悬液，400G离心10分钟，弃上清，加4ml ACK红细胞裂解液，常温裂解5分钟，离心400G10分钟，弃上清，12ml预冷的Hanks液重悬，400G10分钟，弃上清，然后用1ml 10%完全培养基（内含HEPES和二巯基乙醇）重悬，取10ul，台盼蓝染色计数，活细胞比例最高才69%，低的才40%左右。请问各位指点迷津啊，有什么需要改进的.....谢谢还有，有用过自动的细胞计数仪的么，买了台BioRad的，怎么感觉重复性不强呢
不知道邀请谁？试试他们
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
zark_00 edited on
收起全部有料回复
分离原代细胞通用原则：操作速度快，减少机械磨损，提高缓冲液的营养水平。分脾细胞比较简单，不要做太多的细节性操作，需要培养的细胞不要用筛网研磨，直接取脾在培养皿里用注射器芯碾压几下（美国NIH标准操作），或者培养基灌流冲洗一下，然后过一下200目的筛网，再裂一下红细胞就行了。得率会少一点但少不了多少。得率和活率不可兼得，此消彼长。还有分活细胞最好用加过血清的的完全培养基。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
chansey1 edited on
hanks换成1640.。。。洗涤细胞也好，重悬也好，全程1640。。。钢筛100的就行，用5ml玻璃注射器活塞研磨，记得看看钢筛底部，要是有细胞块结，也顺带研磨开边研磨边用1640冲洗收集研磨液离心之后重悬5ml1640里面，然后缓慢倾斜加入淋巴细胞分离液上，一定要保持分界面清晰2000rpm×20min，水平离心机吸取白膜层，用1640洗涤一次，用溶红吹打沉淀，静置5min，离心，再用1640洗涤两次10%胎牛1640培养基，每毫升100双抗，溶解沉淀调整浓度用ChemoMetec Nucleocassette分别计数活细胞跟死细胞我分出来的淋巴细胞活性基本上都是90%以上的。。。。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
过年人不多，自己顶下
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
步骤基本相同，但是我们红细胞裂解时间2min
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
都什么年代了，现在大家都是用两个组化用的载波片粗面直接研磨（注意力量），2分钟不到就得到单细胞悬液了。不要用含hank's了，用点完全培养基，或5% FBS hank's，浪费点也没关系。裂红后60um一次过滤 ，
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
alishang 都什么年代了，现在大家都是用两个组化用的载波片粗面直接研磨（注意力量），2分钟不到就得到单细胞悬液了。不要用含hank's了，用点完全培养基，或5% FBS hank's，浪费点也没关系。裂红后60um一次过滤 ，晕，用玻片磨我真不知道。请问是把脾放在一个载玻片粗面上，再将另一块玻片粗面向下覆盖脾，然后再磨？您的意思是说单独的HANKS，可能对活力有影响？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
zark_00 晕，用玻片磨我真不知道。请问是把脾放在一个载玻片粗面上，再将另一块玻片粗面向下覆盖脾，然后再磨？您的意思是说单独的HANKS，可能对活力有影响？正解！我们在HANKS里加血清的。至于HANKS是否对活力有影响，没研究过，看你操作快慢。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
我们是直接将脾脏放在200目（70微米孔径）尼龙膜中间，或者BD的75微米的滤器中，用注射器芯去研磨，只研磨几下就好了，没必要反复的研磨，液体加的是培养基，加2%胎牛血清。全程操作都尽量在冰上。然后收集细胞，红细胞裂解液裂解。sigma红裂液上说是每个脾脏加1毫升，放置1分钟，不过好像不容易裂掉，可以多加点红裂液，时间2-5分钟。培养基重悬，离心收集细胞。收集过程中可能会看到有团块或者絮状物，可以过滤掉，那基本是死细胞所释放出来的DNA造成细胞粘在一起，如不过滤掉会粘附更多细胞。版主说的很对，操作快点会死的较少。此外吹悬细胞轻柔一些。离心力可以300g。各个试剂的pH值调准。我不是很明白为什么Hanks液灌注会导致细胞活力高，我只了解酶液灌注消化法是为了获得更多的细胞，例如肝脏和肺脏等。我个人认为，灌注只会得到更多的死细胞，因为你灌注时较难掌握灌注的速度，速度过大，造成压力过大，细胞反而会死，灌注也耽误时间。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
我们用10%的胎牛血清培养基做的，玻璃棒研磨，裂红5-10分钟，效果都不错。我觉得一定要用含血清的培养基。如果细胞珍贵，血清浓度可以适当增大
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
alishang 正解！我们在HANKS里加血清的。至于HANKS是否对活力有影响，没研究过，看你操作快慢。我们做的时候，从灌注到研磨完毕离心之前，用了15分钟，是不是时间长了
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
liangyuejin 我们是直接将脾脏放在200目（70微米孔径）尼龙膜中间，或者BD的75微米的滤器中，用注射器芯去研磨，只研磨几下就好了，没必要反复的研磨，液体加的是培养基，加2%胎牛血清。全程操作都尽量在冰上。然后收集细胞，红细胞裂解液裂解。sigma红裂液上说是每个脾脏加1毫升，放置1分钟，不过好像不容易裂掉，可以多加点红裂液，时间2-5分钟。培养基重悬，离心收集细胞。收集过程中可能会看到有团块或者絮状物，可以过滤掉，那基本是死细胞所释放出来的DNA造成细胞粘在一起，如不过滤掉会粘附更多细胞。版主说的很对，操作快点会死的较少。此外吹悬细胞轻柔一些。离心力可以300g。各个试剂的pH值调准。我不是很明白为什么Hanks液灌注会导致细胞活力高，我只了解酶液灌注消化法是为了获得更多的细胞，例如肝脏和肺脏等。我个人认为，灌注只会得到更多的死细胞，因为你灌注时较难掌握灌注的速度，速度过大，造成压力过大，细胞反而会死，灌注也耽误时间。谢谢您的回复，我们这几天就再按您的方法试试。请问按您的方法，研磨的标准是什么，是直到脾发白，还是.....还有，裂解时间2-5分钟，时间够么，我们试过BD的裂解液，还有按配方配的ACK裂解液，10分钟也试过，5分钟也试过，就是细胞活力上不去，达不到90%
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
simonforever 我们用10%的胎牛血清培养基做的，玻璃棒研磨，裂红5-10分钟，效果都不错。我觉得一定要用含血清的培养基。如果细胞珍贵，血清浓度可以适当增大谢谢您的回复，我们这次也决定全程用10%FBS 1% 青/链/谷氨酰胺 1640 完全培养基来试试
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
有帖子提到用淋巴细胞分离液分离，不知道到时候分离出来的细胞里，NK细胞有多少，后面要做NK细胞活性和增殖。计划用EZ-Step 的小鼠淋巴细胞分离液。请问各位，用淋巴细胞分离液离心分离，行么
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
zark_00 谢谢您的回复，我们这几天就再按您的方法试试。请问按您的方法，研磨的标准是什么，是直到脾发白，还是.....还有，裂解时间2-5分钟，时间够么，我们试过BD的裂解液，还有按配方配的ACK裂解液，10分钟也试过，5分钟也试过，就是细胞活力上不去，达不到90%我是用注射器芯垂直的压5下左右吧，基本把脾脏都压碎就行了。因为我需要的细胞不多，所以可能研磨的不充分。活力我没有检测过。不过就显微镜下计数看，基本是活细胞。具体能不能达到90%，我还真没有流式测过
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
zark_00 有帖子提到用淋巴细胞分离液分离，不知道到时候分离出来的细胞里，NK细胞有多少，后面要做NK细胞活性和增殖。计划用EZ-Step 的小鼠淋巴细胞分离液。请问各位，用淋巴细胞分离液离心分离，行么脾脏里的NK好像比较少啊。淋巴细胞分离液是可以去掉一些杂质和死细胞的。注意铺梯度时先用少许胎牛血清润湿管壁，然后铺液体较容易得到清晰界面。离心条件注意有的是室温，温度如果不对会失败的。离心机关加速和刹车。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
liangyuejin 我是用注射器芯垂直的压5下左右吧，基本把脾脏都压碎就行了。因为我需要的细胞不多，所以可能研磨的不充分。活力我没有检测过。不过就显微镜下计数看，基本是活细胞。具体能不能达到90%，我还真没有流式测过我们要的脾细胞较多，2*E7/ml左右，所以必须把脾磨得发白才行。细胞活力我们用台盼蓝染后用BIORAD的自动计数仪看，没用流式，没有买PI的计划，所以。。。。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
400g有点大，我用200g
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
多半是细胞裂解液的问题，裂解时间太长，以前用的就2min左右，还有离心时间太长，5min足够了吧。裂解完5min后有用大量buffer稀释吗？用什么方法倒是无所谓，玻片磨和灌注应该不会有这么大的差别。淋巴细胞分离液分离NK细胞，向前面说的可能很少啊，有钱的话，可以用磁珠试剂盒，好用的。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
今天用EZ-step 小鼠淋巴细胞分离液（脾专用）试了下， 还是不成。步骤如下，完全按说明书来无菌取脾，立即放在预冷的10%FBS 1640培养基中，5分钟内开始研磨。在培养皿中加5ml 淋巴细胞分离液（已恢复到室温），将脾置于300目不锈钢筛上，用5ml注射器活塞头研磨，研磨时脾一直在分离液面下，轻轻研磨，大概4分钟后，脾发白研磨完毕。取培养皿中细胞悬液5ml到15ml离心管中，再在上层+500ul培养基，800g常温离心30分钟，这时，培养基和分离液交界处未出现明显的细胞群形成的环状，有大小不一的白色团块在该界面（应该是死细胞），取该界面的悬液包括白色团块，到10ml培养基中重悬，250g离心10分钟，弃上清+1ml培养基重悬，取10ul用台盼兰1:1稀释，然后用BIOrad的自动细胞计数仪计数，活细胞率才33%....真的无语了。请问有没有用淋巴细胞分离液做过的战友，该怎么改进呢....
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
分离原代细胞通用原则：操作速度快，减少机械磨损，提高缓冲液的营养水平。分脾细胞比较简单，不要做太多的细节性操作，需要培养的细胞不要用筛网研磨，直接取脾在培养皿里用注射器芯碾压几下（美国NIH标准操作），或者培养基灌流冲洗一下，然后过一下200目的筛网，再裂一下红细胞就行了。得率会少一点但少不了多少。得率和活率不可兼得，此消彼长。还有分活细胞最好用加过血清的的完全培养基。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
chansey1 edited on
chansey1 分离原代细胞通用原则：操作速度快，减少机械磨损，提高缓冲液的营养水平。分脾细胞比较简单，不要做太多的细节性操作，需要培养的细胞不要用筛网研磨，直接取脾在培养皿里用注射器芯碾压几下（美国NIH标准操作），或者培养基灌流冲洗一下，然后过一下200目的筛网，再裂一下红细胞就行了。得率会少一点但少不了多少。得率和活率不可兼得，此消彼长。还有分活细胞最好用加过血清的的完全培养基。谢谢您的回复。我们因为后续操作需要用2*eE7/ml的细胞悬液在，所以每个脾都只能尽量磨....
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
需要量大的话就多用几只老鼠好了，不然没什么活力的细胞拿来作后续试验的结果也不稳定，数据会不可靠
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
细胞自动计数器使用后的重大发现！！近段时间在做小鼠脾细胞分离试验，脾细胞要做后续培养等，因此对细胞活力要求较高。因为一次要处死10多只小鼠，为了方便细胞计数，我们也购进了一台Biorad的细胞自动计数器，它可以显示细胞总数、活细胞数及细胞活率，但使用过程颇多曲折。起初，我们按照常规技术分离脾细胞（这个技术我们以前做了n年很成熟，这里细节不再累述），台盼蓝1:1混合细胞冲样上机计数（台盼蓝是随机器配送biorad原装的）。结果，细胞总数和以前试验差异不大，通常一只脾分到5*10^7至2*10^8之间，但细胞活率高的只有30%多，低的甚至只有个位数！起初我们以为这次可能是某个试剂出了问题，经过几次排查，所有试剂都做了排除，最后注意力转向这个为了提高实验效率而购买的Biorad自动细胞计数器上！昨天居然发现了一些不为人知的秘密.......我们做了一系列人工计数和机器计数对比实验，结果发现，当机器显示“总细胞浓度5.2*10^6/ml，活细胞浓度5.3*10^5/ml，细胞活率10%”时，同一份样本显微镜人工计数的活细胞浓度却为4.9*10^6/ml，也就是说细胞活率可以达到94%！我们一共做了8组样本，机器显示细胞活率为5%~28%，人工计数结果细胞活率达到87%~98%。结论是：台盼蓝染色后机器判断活细胞数严重不准！更奇怪的是，我们把未冲细胞的几块空计数板上机计数，有时居然能读到“细胞总数4~8*10^4/ml”！因此，使用细胞自动计数器的童鞋们注意了：别太相信这个机子，记个细胞总数问题不大，但靠它判断活细胞肯定上当了！！！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
huangyin0405 细胞自动计数器使用后的重大发现！！近段时间在做小鼠脾细胞分离试验，脾细胞要做后续培养等，因此对细胞活力要求较高。因为一次要处死10多只小鼠，为了方便细胞计数，我们也购进了一台Biorad的细胞自动计数器，它可以显示细胞总数、活细胞数及细胞活率，但使用过程颇多曲折。起初，我们按照常规技术分离脾细胞（这个技术我们以前做了n年很成熟，这里细节不再累述），台盼蓝1:1混合细胞冲样上机计数（台盼蓝是随机器配送biorad原装的）。结果，细胞总数和以前试验差异不大，通常一只脾分到5*10^7至2*10^8之间，但细胞活率高的只有30%多，低的甚至只有个位数！起初我们以为这次可能是某个试剂出了问题，经过几次排查，所有试剂都做了排除，最后注意力转向这个为了提高实验效率而购买的Biorad自动细胞计数器上！昨天居然发现了一些不为人知的秘密.......我们做了一系列人工计数和机器计数对比实验，结果发现，当机器显示“总细胞浓度5.2*10^6/ml，活细胞浓度5.3*10^5/ml，细胞活率10%”时，同一份样本显微镜人工计数的活细胞浓度却为4.9*10^6/ml，也就是说细胞活率可以达到94%！我们一共做了8组样本，机器显示细胞活率为5%~28%，人工计数结果细胞活率达到87%~98%。结论是：台盼蓝染色后机器判断活细胞数严重不准！更奇怪的是，我们把未冲细胞的几块空计数板上机计数，有时居然能读到“细胞总数4~8*10^4/ml”！因此，使用细胞自动计数器的童鞋们注意了：别太相信这个机子，记个细胞总数问题不大，但靠它判断活细胞肯定上当了！！！谢谢你。同感，我们现在也是读出总数后，按95%活力直接计算，机器出的活力只做参考。因为我们的样本量比较大，所以无法每个样都镜检计数做对比。还有，请问这位战友，你们用倒置镜台盼蓝活细胞计数的时候，调焦距的标准是什么。比如，在细胞清晰的情况下，略调一点焦距，细胞中心都是亮斑，活，但马上再反向略调焦距，细胞中心都是黑的，但视野是清楚的细胞也是。在这种情况下，该按照怎样的标准调焦距呢，按我说的那种情况，我觉得人为因素有点大
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
huangyin0405 细胞自动计数器使用后的重大发现！！近段时间在做小鼠脾细胞分离试验，脾细胞要做后续培养等，因此对细胞活力要求较高。因为一次要处死10多只小鼠，为了方便细胞计数，我们也购进了一台Biorad的细胞自动计数器，它可以显示细胞总数、活细胞数及细胞活率，但使用过程颇多曲折。起初，我们按照常规技术分离脾细胞（这个技术我们以前做了n年很成熟，这里细节不再累述），台盼蓝1:1混合细胞冲样上机计数（台盼蓝是随机器配送biorad原装的）。结果，细胞总数和以前试验差异不大，通常一只脾分到5*10^7至2*10^8之间，但细胞活率高的只有30%多，低的甚至只有个位数！起初我们以为这次可能是某个试剂出了问题，经过几次排查，所有试剂都做了排除，最后注意力转向这个为了提高实验效率而购买的Biorad自动细胞计数器上！昨天居然发现了一些不为人知的秘密.......我们做了一系列人工计数和机器计数对比实验，结果发现，当机器显示“总细胞浓度5.2*10^6/ml，活细胞浓度5.3*10^5/ml，细胞活率10%”时，同一份样本显微镜人工计数的活细胞浓度却为4.9*10^6/ml，也就是说细胞活率可以达到94%！我们一共做了8组样本，机器显示细胞活率为5%~28%，人工计数结果细胞活率达到87%~98%。结论是：台盼蓝染色后机器判断活细胞数严重不准！更奇怪的是，我们把未冲细胞的几块空计数板上机计数，有时居然能读到“细胞总数4~8*10^4/ml”！因此，使用细胞自动计数器的童鞋们注意了：别太相信这个机子，记个细胞总数问题不大，但靠它判断活细胞肯定上当了！！！这个现象我们也发现了，主要是因为脾脏细胞中的T细胞个头较小比较容易被判定为死细胞。你可以改一改程序里的判定标准就可以了。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
ustcwcg 这个现象我们也发现了，主要是因为脾脏细胞中的T细胞个头较小比较容易被判定为死细胞。你可以改一改程序里的判定标准就可以了。我们买的BIORAD的细胞自动计数仪，好像自己不能设定判定标准吧，TC-10，型号。你说的是不是更高些的型号。还有，我们同时用它来计数细胞株传代培养，活力就很高,YAC-1。所以可能是跟细胞大小有关系，还有就是原代比细胞株传代要杂的原因。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
zark_00 谢谢你。同感，我们现在也是读出总数后，按95%活力直接计算，机器出的活力只做参考。因为我们的样本量比较大，所以无法每个样都镜检计数做对比。还有，请问这位战友，你们用倒置镜台盼蓝活细胞计数的时候，调焦距的标准是什么。比如，在细胞清晰的情况下，略调一点焦距，细胞中心都是亮斑，活，但马上再反向略调焦距，细胞中心都是黑的，但视野是清楚的细胞也是。在这种情况下，该按照怎样的标准调焦距呢，按我说的那种情况，我觉得人为因素有点大我们的经验是，把光线略调暗点，光阑（光栅）关掉部分，细胞的立体感就很强（就跟观察寄生虫虫卵一样），这时活细胞就透亮透亮滴，很好观察.....我们也是Tc10，不能调观察指标的
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
楼主，给个建议，我们一般采用灭菌后的纱布将小鼠脾脏包裹后，置于含4ml培养基的无菌皿中，用2把小镊子进行揉搓研磨，很快就成单个细胞悬液，收集悬液，离心后，弃去上清，裂红，用培养基再洗一次，离心后重悬即可，用于细胞染色和elispot
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
hanks换成1640.。。。洗涤细胞也好，重悬也好，全程1640。。。钢筛100的就行，用5ml玻璃注射器活塞研磨，记得看看钢筛底部，要是有细胞块结，也顺带研磨开边研磨边用1640冲洗收集研磨液离心之后重悬5ml1640里面，然后缓慢倾斜加入淋巴细胞分离液上，一定要保持分界面清晰2000rpm×20min，水平离心机吸取白膜层，用1640洗涤一次，用溶红吹打沉淀，静置5min，离心，再用1640洗涤两次10%胎牛1640培养基，每毫升100双抗，溶解沉淀调整浓度用ChemoMetec Nucleocassette分别计数活细胞跟死细胞我分出来的淋巴细胞活性基本上都是90%以上的。。。。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
chansey1 分离原代细胞通用原则：操作速度快，减少机械磨损，提高缓冲液的营养水平。分脾细胞比较简单，不要做太多的细节性操作，需要培养的细胞不要用筛网研磨，直接取脾在培养皿里用注射器芯碾压几下（美国NIH标准操作），或者培养基灌流冲洗一下，然后过一下200目的筛网，再裂一下红细胞就行了。得率会少一点但少不了多少。得率和活率不可兼得，此消彼长。还有分活细胞最好用加过血清的的完全培养基。但是当我在培养皿里用注射器研磨的时候，脾脏会跑动，基本按压不到！请问您是怎么操作解决这个问题的？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
中药科学 但是当我在培养皿里用注射器研磨的时候，脾脏会跑动，基本按压不到！请问您是怎么操作解决这个问题的？熟能生巧，稳准狠，实在不行的话，可以用剪刀把脾脏一分为二，稍微容易一点
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
中药科学 但是当我在培养皿里用注射器研磨的时候，脾脏会跑动，基本按压不到！请问您是怎么操作解决这个问题的？按压时不要加太多液体,一滴PBS即可,用注射器芯的座头垂直按压几次,大部分细胞就会跑出来,然后再加一点PBS磨几下就行了,磨得时候脾脏已经不会滑动了
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
chansey1 按压时不要加太多液体,一滴PBS即可,用注射器芯的座头垂直按压几次,大部分细胞就会跑出来,然后再加一点PBS磨几下就行了,磨得时候脾脏已经不会滑动了好的，谢谢，我下次试试！你现在在做这方面吗？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
为什么细胞活性要达到95％？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
楼上各位老师好：能问下各种方法处理下来的细胞能传几代，应该是有很多种细胞吧?如何筛选哪？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
关于丁香园