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10、 16-06-01吸水链霉菌5008产井冈霉素与黑色素的相关性研究--《浙江大学》2015年硕士论文
吸水链霉菌5008产井冈霉素与黑色素的相关性研究
【摘要】：井冈霉素(Validamycin A, Val-A)是一种安全高效的抗真菌抗生素。吸水链霉菌5008是常用于工业化发酵生产井冈霉素的放线菌株,使用至今已有40余年。在吸水链霉菌5008发酵过程中,我们发现培养基中同时有一种黑色素产生,且随着发酵时间的延长色素量逐渐增加,是井冈霉素发酵过程中的一种重要副产物。本研究针对该色素与井冈霉素的产生有何相关性进行研究,从井冈霉素产量与色素液吸光值的关系入手,利用qRT-PCR技术,推测两者在代谢通路上的相关性,并将发酵液中的黑色素进行提取,在对色素理化性质及稳定性等研究的基础上,建立了一种Val-A快速检测方法,同时利用FT-IR红外光谱分析等方法对色素物质结构进行初步推测。在提取发酵液中的井冈霉素时,将发酵液中的色素分离出来,可达到对发酵产品更充分的利用,同时也为该色素的开发利用提供理论依据。
主要研究结果如下：
1.井冈霉素与黑色素产量的关系
Val-A的合成与色素的分泌在改变不同发酵条件情况下,如改变培养基、改变发酵温度、添加外源刺激物等,所呈现出的对环境改变的反应趋势是一致的,当处于优势环境中时,两者的合成量共同增加,当处于劣势环境中时,两者的合成量则共同减少。这表明,Val-A的合成与色素的分泌是具有一个稳定的相关性的。
2.井冈霉素与黑色素相关基因表达情况
针对井冈霉素合成结构基因(valABC, valKLMN, valG)、色素编码基因(SHJG4405)及两个相关的全局调控基因(ugp, afsR)在不同发酵条件下的表达情况进行了研究。当发酵处于劣势环境中,如低产培养基、低温培养等条件,井冈霉素合成结构基因、色素编码基因和两个全局调控基因的表达水平在不同的生长时期均有显著性下降,同样的,在优势环境中,如添加外源刺激物或改变初始pH值条件下,这些基因都会在不同生长时期有不同水平的显著性上调,整体上表现出一种与产量相关的协同性。
3.色素理化性质及其稳定性研究
本研究从吸水链霉菌5008发酵中将黑色素提取出来,采用光谱法研究了光、温度、pH、还原剂、氧化剂、金属离子和食品添加剂对该色素稳定性的影响。结果表明：该色素具有较好的光、热稳定性和抗紫外辐射能力,具有一定的抗氧化性和抗还原性；pH值对该色素影响较明显,强酸性条件下色素会产生沉淀并变色,中、碱性条件下较稳定；Ca2+、Mn2+、Fe3+对色素的影响较大,A13+能够对色素起到保色作用,而Mg2+、K+、Na+对色素影响较小；常见食品添加剂蔗糖和葡萄糖能增加色素稳定性,碳酸氢钠、苯甲酸钠对色素稳定性影响较小
4.色素物质结构分析
通过与其他天然黑色素红外光谱图进行比较得知,该色素具有黑色素的共性,即基本结构单元是吲哚环,但由于不同来源黑色素某些基团有所差异,结构上存在不同,吸收峰不完全一致。初步判断该色素属于真黑素和棕黑素的混合型黑色素。
5.快速检测方法
我们将井冈霉素产量与色素吸光值进行关联,确定了两者之间的拟合关系为y=19.41Ox4-51.750x3+39.262x2+8.604x-0.643,其中x为发酵液的OD450,y为Val-A的浓度,该拟合公式的Adj R-square达到了0.9928,表现出相当高的准确度,在未来工业发展中具有广阔的应用前景。
6.一种提高井冈霉素产量的方法
本实验利用微生物的群体感应现象,提前向发酵液中添加含群体感应信号分子的发酵上清液,利用群体感应信号分子对其进行刺激,激活群体感应通路的响应,促进相关基因的表达,使得某些次级代谢物的分泌提前进行,提高了次级代谢物井冈霉素的产量。本实验确定了发酵上清液的最适添加时间为发酵开始12h,最适添加浓度为0.5%,96h发酵培养后,井冈霉素的绝对积累量从12.47g/L提高到了16.39g/L,在不加大能耗的前提下,该方法能获得较高的井冈霉素产量,降低了生产成本。且使发酵96h就达到最高产量,发酵提前24h结束,缩短了发酵周期,取得了更大的生产效率。
【关键词】：
【学位授予单位】：浙江大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2015【分类号】：TQ927【目录】：
致谢6-7摘要7-9Abstract9-12目录12-15第一章 引言15-31 1.1 井冈霉素研究背景15-18
1.1.1 井冈霉素概述15
1.1.2 井冈霉素研究历史和现状15-16
1.1.3 井冈霉素合成代谢机制的研究16-18 1.2 天然色素研究概况18-20
1.2.1 天然色素的优点18-19
1.2.2 天然色素的资源19
1.2.3 天然色素的应用19-20
1.2.5 天然色素的发展趋势20 1.3 微生物产色素研究概述20-23
1.3.1 微生物色素的研究现状21
1.3.2 影响微生物色素生物合成的因素21-23 1.4 黑色素研究进展23-29
1.4.1 黑色素概况23
1.4.2 黑色素分类23-24
1.4.3 黑色素理化性质24-26
1.4.4 天然黑色素的分离纯化26-27
1.4.5 黑色素的结构研究27-29 1.5 研究内容、目的及意义29-31
1.5.1 研究内容29-30
1.5.2 研究目的及意义30-31第二章 不同发酵条件下Val-A产量与色素合成关系研究31-44 2.1 材料与仪器31-32
2.1.1 菌种31
2.1.2 主要试剂31-32
2.1.3 主要仪器32 2.2 实验方法32-35
2.2.1 培养基与溶液配制32-33
2.2.2 菌体培养与发酵33-34
2.2.3 井冈霉素产量检测34-35
2.2.4 发酵液中色素吸光值的测定35
2.2.5 数据处理及拟合公式与拟合曲线的确定35 2.3 实验结果与讨论35-41
2.3.1 玉米粉培养基中井冈霉素产量与色素吸光值的关系35-36
2.3.2 大米粉培养基中井冈霉素产量与色素吸光值的关系36-37
2.3.3 淀粉培养基中井冈霉素产量与色素吸光值的关系37
2.3.4 33 ℃条件下井冈霉素产量与色素吸光值的关系37-38
2.3.5 添加乙醇条件下井冈霉素产量与色素吸光值的关系38-39
2.3.6 添加γ-丁内酯条件下井冈霉素产量与色素吸光值的关系39-40
2.3.7 初始pH 5.0条件下井冈霉素产量与色素吸光值的关系40
2.3.8 初始pH 8.0条件下井冈霉素产量与色素吸光值的关系40-41 2.4 Val-A浓度与色素OD值关系的拟合公式确定41-43 本章总结43-44第三章 不同发酵条件下色素与Val-A相关基因的表达情况44-58 3.1 材料与仪器44-46
3.1.1 菌种44
3.1.2 主要试剂44
3.1.3 溶液配制44-45
3.1.4 主要仪器45-46 3.2 实验方法46-49
3.2.1 引物设计46
3.2.2 RNA提取46-47
3.2.3 cDNA合成47
3.2.4 PCR反应47-48
3.2.5 qRT-PCR反应48
3.2.6 数据处理与分析48-49 3.3 实验结果与讨论49-56
3.3.1 引物特异性49-51
3.3.2 不同发酵条件下井冈霉素合成基因的表达水平51-53
3.3.3 不同发酵条件下色素相关基因的表达水平53-54
3.3.4 不同发酵条件下次级代谢调控基因的表达水平54-56 本章总结56-58第四章 黑色素理化性质研究及结构初探58-71 4.1 材料与仪器58-59
4.1.1 菌种58
4.1.2 主要试剂58-59
4.1.3 主要仪器59 4.2 实验方法59-62
4.2.1 培养基与溶液配制59
4.2.2 色素提取59-60
4.2.3 色素吸收光谱分析60
4.2.4 色素溶解性研究60
4.2.5 色素稳定性的研究60-62
4.2.6 色素红外光谱分析62 4.3 实验结果与讨论62-69
4.3.1 吸水链霉菌5008黑色素的吸收光谱62-63
4.3.2 吸水链霉菌5008黑色素的溶解性63
4.3.3 吸水链霉菌5008黑色素的稳定性研究63-68
4.3.4 红外光谱分析68-69 本章总结69-71第五章 一种提高井冈霉素产量的方法探究71-79 5.1 材料与仪器72-73
5.1.1 菌种72
5.1.2 主要试剂72
5.1.3 主要仪器72-73 5.2 实验方法73-76
5.2.1 培养基与溶液配制73
5.2.2 菌体培养与发酵73-74
5.2.3 井冈霉素产量检测74
5.2.4 吸水链霉菌5008生物量测定74-75
5.2.5 发酵培养基残糖测定75-76 5.3 实验结果与讨论76-78
5.3.1 发酵上清液添加时间的确定76-77
5.3.2 发酵上清液添加量的确定77-78 本章总结78-79第六章 结论与展望79-83 6.1 研究结论79-80 6.2 主要创新点80-81 6.3 足与展望81-83参考文献83-92作者简介92
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京公网安备75号阿奇霉素付作用_百度知道蜂蜜被检出四环霉素超标 滥用抗生素的危害
本文导读：蜂蜜是女性抗衰老的必备食物，深受广大女性喜爱。但是最近爆出50岚蜂蜜的四环霉素严重超标，其产品全部下架。抗生素超标对我们的危害极大，那么滥用抗生素会带来什么危害呢？
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　　蜂蜜被检测出四环霉素超标，这是怎么回事呢？为什么蜂蜜会有抗生素呢？抗生素的滥用不但造成了浪费，而且还不利身体。一起去了解一下吧。
　　据报道，台南市政府卫生局24日接获五十岚公司通报，饮品中所使用的蜂蜜验出动物用药四环霉素超标，下架所属产品，并抽验其它批次产品。
　　24日接获50岚公司自主通报，在7月13日向云林县山水蜂蜜股份有限公司进货的&蜜蜂工坊花漾蜂蜜&荔枝蜜&，客制化商品2290罐，自行送验SGS公司后，检出四环霉素达987ppb。
　　四环霉素是很传统且较便宜的抗生素，但依规定不能使用在蜜蜂身上。卫生局指出，这批蜂蜜的有效日期为日，50岚公司通报已在24日将还在所有门市中的1180罐全部下架。
　　台南市卫生局已通报云林县卫生局，移请针对不符规定的蜂蜜产品来源进行调查，并抽验其他批次蜂蜜产品。
　　知识链接：滥用抗生素的危害
　　（1）反应（变态反应）。青霉素类、磺胺类、四环素类和某些氨基糖苷类药物能使部分人群发生过敏反应
，其中，以青霉素及其代谢产物引起的过敏反应最为常见，也最为严重。轻者引起瘙痒、皮炎和，重者引起急性血管性水肿、休克甚至。
　　（2）慢性毒性作用。
如磺胺类药物能破坏人的造血系统；氯霉素可导致严重的再生障碍性，婴幼儿和的代谢和排泄机能尚不完善或已退化，对氯霉素最敏感，可能出现致命的
&灰婴综合症&。
　　（3）细菌产生耐药性。一旦致病性强的细菌具有耐药性，且造成对人的感染，病人将不易得到甚至出现无药可医的严重后果。近几年&超级细菌&的发现已经屡见不鲜。
　　（4）破坏人体内微生物生态平衡。
长期食用含有抗生素残留的动物食品，会导致人体内微生物菌群的正常平衡被打破，体内有益微生物所具有的功能消失，而有害的微生物或其他病原体就容易侵入体内，造成疾病感染。最常见的是在肠胃中的有益微生物受到抑制，发生消化功能障碍。（责任编辑：陈加勇）
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