来源:蜘蛛抓取(WebSpider)
时间:2016-06-16 09:22
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western定量
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【求助】western 内参总是跑不齐是什么原因
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做western还是新手,我是成纤维细胞提的总蛋白,现在β-actin总是跑不齐,bca定量之后跑actin差距很大。跑完一次之后再根据条带亮度调整上样量之后再跑还是结果不均一 ,调整几次蛋白都要用完了。 试了一下用同一管样,每空上样量一样加样,跑出来actin还是不均一。 求教到底可能是哪有问题?希望各位不吝赐教
不知道邀请谁?试试他们
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上样前样品要充分复温 并用vortex充分混匀 如果样品中的SDS不充分溶解 并且没有充分混匀那你做一次一个结果 且结果不可重复 还有一点 你上同一个样品 做出的内参都不一致说明你的实验操作方面还是有很多地方值得改进,提醒你一点 actin表达丰度比较高 出的条带比较强,抗体浓度可降低一点做,抗体孵育时间亦可减半,如果抗体浓度过高,你曝光0.5~1s就出很强的条带 这样的结果是很不稳定的,因为过多的HRP会把ECL底物很快消耗掉导致光的淬灭,所以降低抗体浓度和孵育时间是极为重要的 一般做到曝光5s出淡淡的条带,曝光15s左右出的条带亮度正正好,且重复曝光条带稳定无明显消退,这样的结果才稳定可靠,都说内参好做,我觉得不然,细细用心,慢慢在实验中体会。
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ksharp98 上样前样品要充分复温 并用vortex充分混匀 如果样品中的SDS不充分溶解 并且没有充分混匀那你做一次一个结果 且结果不可重复 还有一点 你上同一个样品 做出的内参都不一致说明你的实验操作方面还是有很多地方值得改进,提醒你一点 actin表达丰度比较高 出的条带比较强,抗体浓度可降低一点做,抗体孵育时间亦可减半,如果抗体浓度过高,你曝光0.5~1s就出很强的条带 这样的结果是很不稳定的,因为过多的HRP会把ECL底物很快消耗掉导致光的淬灭,所以降低抗体浓度和孵育时间是极为重要的 一般做到曝光5s出淡淡的条带,曝光15s左右出的条带亮度正正好,且重复曝光条带稳定无明显消退,这样的结果才稳定可靠,都说内参好做,我觉得不然,细细用心,慢慢在实验中体会。 谢谢老师
样品中SDS不充分溶解是什么意思?
配好的loading buffer是没有沉淀的啊?actin我买的cst的
但是特别不好用
杂带特别多以及曝光曝的也不是很好
一般要几分钟才能出
是不是要换支抗体?孵育的时候垂直摇床会不会有影响呢?western新手
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需要排除的东西比较多,没在你身边看你做实验,不好说。
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十月飞雪123
样品中SDS不充分溶解是什么意思?
配好的loading buffer是没有沉淀的啊?actin我买的cst的
但是特别不好用
杂带特别多以及曝光曝的也不是很好
一般要几分钟才能出
是不是要换支抗体?孵育的时候垂直摇床会不会有影响呢?western新手
谢谢因为你样品是从-80度拿出来的
里面的SDS会结晶,所以一定要复温 然后vortex使SDS充分溶解再上样
如果你抗体不好的话推荐你一个单抗 sigma的actin质量很好
货号AF1978
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你是压片还是仪器显影的,建议压片,会比较均匀
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