CK1δ/ε对SR motif激酶活性的进化--《南京大学》2013年博士论文
CK1δ/ε对SR motif激酶活性的进化
【摘要】：一般认为,同系蛋白间功能是保守的,蛋白功能分化一般发生在基因复制后,也就是在旁系蛋白间。尽管有研究关注于同系蛋白间的功能差异,对蛋白序列变异如何引起蛋白功能分化的认识还十分浅薄,并且这方面的实验研究也很少。
Casein激酶(CK1)家族是一类丝氨酸(S),苏氨酸(T)特异性的激酶,其成员间的功能被认为是十分保守的。CK18/ε(果蝇中的DBT)是CK1家族的一个分枝,在生物钟里起着重要作用。由于先前的研究提示DBT与哺乳类的CK1δ或ε在生物钟里的功能不一致,并且考虑到生物钟系统的高度保守性,我们以DBT和CK18/ε在生物钟功能的进化为具体研究对象,籍此以揭示CK1家族的进化。
我们检测了CK1δ/ε,DBT与他们的时钟底物hPER2,果蝇PER相互作用的功能变化。我们发现DBT并不能如同CK1δ及CK1ε有效地磷酸化hPER2的连续S/TXXS/T (Serine/threonin Rich, SR) motif.而CK1δ及CK1ε间的相似功能说明功能变异发生在基因分化前。
通过同系蛋白间蛋白序列片断的重组,我们发现一段包含有7个氨基酸变异的片段决定了DBT和CK1δ间的功能差异。并且之前的研究并没有发现这一片段对CK1蛋白功能的影响。DBT和CK1δ间的功能差异以及这7个氨基酸对CK16功能的重要性进一步被体外磷酸化实验所证明。这些结果说明微小的蛋白序列变化也会对蛋白功能产生重要影响。并且新蛋白功能可能是通过非重要功能区的变化产生的。对CK1δ/ε蛋白序列及功能影响片段的进化分析,我们发现这一段在脊椎类的CK1δ和CK1ε间高度同源,在某些脊索动物中,单一的CK1δ/ε同系物具有与CK1δ或CK1ε同源的序列,而在节肢动物,线虫动物或刺细胞动物里分化程度较高。说明该磷酸化功能的变化发生在基因分化之前。
我们还发现在CK1δ或CK1ε的底物中,磷酸化位点SR motif在脊椎类里高度保守,而在其它里却不存在或比较分化。并且对各物种蛋白组的分析发现,SRmotif在脊椎类里的保守性明显高于非脊椎类里,与CK1δ/ε蛋白功能的进化相一致,揭示了同系物功能变异伴随的生物体系统水平的变化。并且说明了激酶与底物间可能存在的共进化对生物整体分子网络的作用。
【关键词】：
【学位授予单位】：南京大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2013【分类号】：Q55【目录】：
Abstract7-9中文摘要9-11Abbreviations11-13Chapter 1 A Brief Review about CKl Family and Evolution of Gene Duplication13-54 Introduction13-14 1. CK1 evoltuion14-29
1.1 Gene family evolution and gene duplication16-25
1.1.1 Gene duplication16-21
1.1.2 Orthologue and paralogue21-25
1.2 Evolution of CK1 family25-29 2. Functions of CKl1family members29-35
2.1 Participation of CKlin multiple pathways29-33
2.1.1 Function of CK1 in cell growth and cell division29-30
2.1.2 Participation of CK1 in the Wnt and Hedgehog pathways30-32
2.1.3 Involvement of CK1 in neurodegeneration32-33
2.2 Phosphorylation targets of CKls33-35 3. CK1 and circadian clock35-44
3.1 Brief introduction of circadian clock36-39
3.2 Role of CK1 in circadian clock39-41
3.3 Circadian clock related diseases41-44 References44-54Chapter 2 Functional Variation between DBT and CK1δ/ε on SR Motif in Drosophila54-71 1. Material and methods54-61
1.1 Drosophila culture54
1.2 Fly locomotor activity analysis54-55
1.3 Transgenic fly generation55-59
1.3.1 Plasmid preparation for transgenic fly55-57
1.3.2 Transgenic fly injection57-58
1.3.3 Establishment of transgenic lines58-59
1.3.4 Establishment of hPER2 and CK1 double transgenic flies59
1.4 Protein detection59-61
1.4.1 Collection of fly heads59
1.4.2 Western blotting59-61
1.5 Sequence alignment61 2. Results61-69
2.1 Mutants on hPER2 SR motif do not show different circadian phenotypesin Drosophila61-64
2.2 CK1δ but not DBT is able to show different circadian function onhPER2~(S662) hPER2~(S662D) and hPER2~(S662G) flies64-66
2.3 Different modifications on hPER2 mutants by CK18 but not DBT66-67
2.4 Similar functional effect of DBT and CK1δ on drosophila PER67-68
2.5 Similar functional effect of CK1δ and CK1ε on hPER268-69 3. Discussion69-71Chapter 3 Identify the Sequence Responsible for DBT and CK1δ Functional Divergence on the SR Motif71-87 1. Material and methods71-73
1.1 Plasmid Construction71-72
1.2 Cell culture and transfection72
1.3 Western blotting72
1.4 In vitro kinase assay72-73 2. Results73-85
2.1 CK18-DBT(5) fragment is responsible for the kinase activity difference betweenDBT and CK1δ73-76
2.2 Verify the functions of CK1δ-D(5) and CK1δ-D(3) fragments in Drosophila76-79
2.3 In vitro kinase assay for the functions of DBT, CK1δ and CK1δ-D(5)fragment79-80
2.4 Structural basis for the functional variance between DBT and CK1δ80-82
2.5 CK1δ/ε-D(5)sequence conservation is in consistent with CK1δ/ε enzyme activityon SR motif82-85 3. Discussion85-87Chapter 4 Emergence of Conserved SR Motif in the Vertebrates87-94 1. Material and methods87 2. Results87-94
2.1 Conservation of SR motif in CKδ/ε substrates is correlated with the Kinase activityof CK1δ/ε87-90
2.2 Conservation of SR motif is correlated with the substrate interactionswith CK1δ/ε90
2.3 High conservation of putative SR motif in vertebrates90-94Discussion94-99References99-109致谢109-111Publications111-112附件112-113
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