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流式细胞术检测HLA-B27诊断强直性脊柱炎临界值设置的探讨分析
作者：王丽，刘红，夏蔚珉&&&&作者单位：255036 山东淄博,淄博市中心医院检验科
应用流式细胞术检测外周血白细胞HLA-B27，并结合临床诊断，寻求诊断强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)的最适合临界值。方法
应用美国Beeton Dickinson公司流式细胞仪检测95例AS患者、226例非AS(包括腰腿背痛患者87例，其他SPA患者62例，类风湿性关节炎43例，风湿性关节炎34例)患者及50例健康体检者的外周血HIA-B27表达强度。结果
以美国BD公司试剂设定的界值≥荧光强度147道数为准，仅58例AS患者(61.05％)HLA-B27阳性，其中有17例检测值在140～146道数之间；非AS组中，HLA-B27阳性11例(4．87％)；健康对照组HLA-B27阳性3例(6．00％)。结论
以进口试剂盒设置的临界值为准,AS组阳性率过低，与临床不符，影响一部分AS患者的早期诊断。如降低其临界值，提高流式细胞术检测HLA-B27抗原的阳性率，更符合临床诊断,有利于AS患者的诊断和治疗。
【关键词】& HLA-B27；流式细胞术；强直性脊柱炎；临界值
The settting of flow cytometer assay critical value for HLA-B27 in patients with ankylosing spondylitis
　　WANG Li, LIU Hong, XIA Wei-min.
　　The Department of Laboratory, ZiBo Central Hospital, Zibo 255036，China
　　【Abstract】Objective& The flow cytometer assay was used to investigate the express levels of HIA-B27 in patients with ankylosing spondylitis (AS) and according to the clinical diagnosis to discuss the clinical signification of the setting of clinical value to the diagnosis of AS. Methods& Flow cytometer from American BD company was used to test the express levels of HLA-B27 from 95 patients with AS, 226 non-AS patients, and 50 healthy control. Results& According to the critical value of BD (&147)，there were only 58 positive cases (61.05％) in AS group and there were 17 AS patients whose HLA-B27 levels were between 140 and 146, there were 11 positive case (4.87%) in non-AS group, and there were 3 positive cases (6.00％) in healthy group. Conclusion& The positive rate in AS group is too low, which didn't correspond with the clinical diagnosis. The critical value of importing reagent box is so high that a large amount of padents were let off. If we lower the critical value, the positive rate of HLA-B27 with flow cytometer could be raised and flow cytometer can be more useful to the clinical diagnosis and differential diagnosis.
　　【Key words】HIA-B27;
an critical value
&&& 强直性脊柱炎(ankylosingspondyli,AS)是以中轴关节慢性炎症为主的全身性自身免疫性疾病，主要累及骶髂关节、髋关节、椎间关节、肋间关节，而以骶髂关节病变最多见，常可致畸。AS诊断主要建立在影像学检查的基础上，缺乏实验室特异性诊断指标，给早期诊断带来困难。HLA-B27是人类白细胞抗原B位点上的一个重要等位基因。早在20多年前，人们就已发现HLA-B27抗原的表达与强直性脊柱炎密切相关［1，2］。AS患者HLA-B27的阳性率达90%以上，而正常人群HLA-B27的阳性率仅为3%～12%。因此HLA-B27的检测已成为临床诊断和鉴别诊断AS的重要辅助手段。近年来，流式细胞仪以其强大精确的细胞分析能力，被认为是当前分析HLA-B27最好的方法之一［3］，在临床上的应用日益广泛。由于不同种族人群中HLA-B27的阳性率不同，进口试剂盒使用的判断阴阳性的临界值可能并不适用于亚洲人。因此有必要调查分析适用于本地的临界值。笔者使用美国BD公司的流式细胞仪与试剂盒检测HLA-B27，以其临界值判断阴、阳性，发现其阳性率偏低，有可能漏诊一部分患者。因此笔者结合临床诊断，探讨分析临界值设置对AS诊断的影响，以寻求更适合的参考临界值。
　　1& 材料与方法
　　1.1 检测对象&
　　2007年5月&2009年7月我院门诊及住院AS患者95例，其中男74例，女21例，年龄14～58岁，均符合AS诊断标准（采用1984年纽约修订AS诊断标准）。非AS患者226例（包括腰腿背痛患者87例，其他SPA患者62例，类风湿性关节炎43例，风湿性关节炎34例），健康对照组50例。
　　1.2 仪器与试剂&
　　FACSCalibur流式细胞仪为美国B-D公司产，荧光标记抗体Anti-HLA-B27-FITC/CD3-PE,10*溶血剂，FL1Calibration beads 均为美国B-D公司产品。
　　1.3& 检测方法
　　1.3.1& 标本处理&
　　取肝素抗凝全血50&l 和Anti-HLA-B27-FITC/CD3-PE30ul于流式检测管中，充分混匀，室温下避光反应20min，加1*溶血剂2ml混匀，室温下避光反应10min，(1500r/min)离心5min，弃上清，加PBS洗涤（1500r/min）离心5min弃上清，加1%多聚甲醛（PFA）200&l固定待测。
　　1.3.2& 检测&
　　打开HLA-B27自动分析软件，用Calibration beads 调试仪器，成功后上样。在FSC-FL2 的点图上确定CD3强阳性细胞群体的位置，并设定一个CD3+淋巴细胞门，后根据FSC设定光散射门，除去FSC过大或过小的细胞,自动计数15000个细胞，随后计算FSC/FL2 门内细胞抗HLA-B27-FITC信号的平均荧光强度（FMI），并与desition marker的值相比较，大于或等于为阳性，小于为阴性。
　　2& 结果
　　2.1& 95例AS患者和226例非AS患者HLA-B27抗原检测结果&
　　见表1。表1& 95例AS患者和226例非AS患者HLA-B27抗原检测结果（略）
&&& 利用FCM检测95例AS患者HLA-B27，以B-D公司设定的界值&147为准，AS组HLA-B27的阳性率仅为61.05%, 远远低于文献报道，39.0%的AS患者HLA-B27检测结果为阴性,这样有可能造成一部分患者漏诊。17.89%的患者，其HLA-B27检测平均荧光强度值在140～146之间，这一部分检测结果接近界值，所占比例也较高。非AS组中HLA-B27抗原阳性率为4.87%，有5.31%的非AS患者其HLA-B27抗原检测结果在140～146道数之间。健康对照组阳性率为6 %（3/50）。
　　2.2& 采用B-D公司流式细胞仪检测结果与临床诊断符合情况&
　　见表2。表2& 采用B-D公司流式细胞仪检测结果与临床诊断符合情况（略）
　　3 讨论
&&& 强直性脊柱炎是一种严重危害人体健康的全身性疾病。流行病学资料显示，本病的发病高峰年龄为20～30岁，40岁以后发病少见，男性比女性多见。过去认为AS是一种较少见的脊柱疾病，随着风湿病学在我国的起步和发展，认识到本病在国内并不少见。由于本病起病缓慢而隐匿，首发症状多为十分常见的临床症状，如腰痛或外周关节痛，临床上容易误诊。目前临床AS诊断通常采用纽约标准或1984年纽约修订分类标准，但二者对影像学检查依赖较大，要求有肯定的骶髂关节炎，临床实践证明二者标准皆过于严格，满足其条件者病情均非早期。自1973年发现HLA-B27和强直性脊柱炎具强相关性以来，其在AS诊断中的作用日益受到重视，但对于HLA-B27在AS临床诊断中所占权重一直有所争议［4］。另外，虽然流式细胞仪在检测HLA-B27中得到越来越广泛的应用，但其阳性临界值多参考国外标准，中国人群有关参考值少见报道。因此，寻求HLA-B27的参考值及其在AS中的诊断价值显得十分重要。笔者的研究结果显示：AS患者最小发病年龄为14岁，高峰发病年龄为18～37岁（占80%），男女比例是3.52：1，男性明显多于女性，与以往报道一致［5］。在非AS组，包括腰腿背痛，风湿、类风湿性关节炎和其他SPA患者，HLA-B27均有一定的阳性率，符合文献报道，说明HLA-B27阳性并非一定是AS，而HLA-B27阴性也不能完全排除AS。分析本次研究数据可以发现，以美国B-D公司试剂盒给出的临界值&147作为判断阳性的标准，AS患者的HLA-B27阳性率为61.05%，有38.95%的AS患者HLA-B27检测结果为阴性，这部分患者很可能被漏诊。同时，有17.89%的患者检测HLA-B27荧光强度道数在140～146之间，非常接近临界值。如果以&140为临界值，则其阳性率提高到79%。表2比较了应用不同临界值时的诊断效能，在应用原临界值&147时，灵敏度为0.61，特异度为0.95，当把临界值调整为&140时，其灵敏度提高到0.79，而特异度降低也不多。若将临界值调整为&130，其灵敏度升幅不大，仅为0.82，但其特异性下降明显，诊断效能明显降低。由于早期诊断AS有助于早期干预治疗并改善其预后，所以，尽管调整临界值为&140后，损失了一部分特异性，但有助于AS患者的早期诊断，有更大的临床意义。同时，调整临界值后，非AS组HLA-B27阳性率未见明显提高，仅为10.18%，与多数报道相符。由于流式细胞术检测HLA-B27抗原的荧光强度与样本T细胞表面HLA-B27抗原表达量有关，同时存在人种差别和个体差别，进口试剂盒是以白种人为样本设定的临界值，是否适合中国人群有待考证，笔者认为它的临界值设定偏高，可能会使一部分AS患者漏诊，将其临界值调整为&140道数更为符合本地区情况，但仍需进一步加大样本量验证并寻求更精确的界值。
【参考文献】
Mcmichel A，Bell J．HLA一27：a diease-associated immune re-sponse gene．Res Immunol，-6)：475-482．
Liu Y，Li J，Chen B，et al．Familial aggregation ankylnsing spondylitis in Southern China．Rheumatol，)：550-554．
Levering W H，wind H，sintnicolaas K，et al. Flow cytometric HLA-B27 screening： cross-reactivity pattems of commercially available anti-HIA-B27 monoclonal antibodies with other HLA-B antigens．Cytometry，-38．
Sweeney S，Gupta R，Taylor G，et a1．Tatal hip Ahmplasty in ankylosing Spotdylitis：outcome in 340 patients．J R heumtd，)：1862.
倪吴花,胡晓霞，章圣辉,等．强直性脊柱炎867例HLA-27的表达及意义．实用医学杂志，)：1511．
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论文写作技巧流式细胞术测hlab27有具体数值吗_百度知道
流式细胞术测hlab27有具体数值吗
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阳性细胞的比例是多少，得到的都是相对值。比如检测1万个细胞流式检测
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