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简介：本文档为《酶工程综述doc》，可适用于高等教育领域，主题内容包含酶工程综述酶工程酶工程综述胰蛋白酶一摘要胰蛋白酶为蛋白酶的一种在脊椎动物中作为消化酶而起作用。在胰脏是作为酶的前体胰蛋白酶原而被合成的。它不仅起消化符等。
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所需积分：0HL－60细胞的培养技术(血清,培养液,培养基,胰蛋白酶) - 细胞实验 - 生物秀
标题: HL－60细胞的培养技术(血清,培养液,培养基,胰蛋白酶)
摘要: [HL－60细胞的培养技术(血清,培养液,培养基,胰蛋白酶)] HL－60细胞的培养技术1．HL-60的培养方法Ⅰ 准备试剂和条件：a ATCC的完全培养基：iscove”s modified Dulbew”s 4mM的L-谷氨酸盐 培养基，调整至含有1 5％的钠重碳酸盐，80％的小牛血清20％，100毫克每升链霉素，100单位每升的盘尼西林（DMEM）注：生长培养液：10％－20％小牛血清；维持培养液：2％－5％小牛血清b 温度：37度c 环境：空气95%, 关键词:[血清 培养基 培养液 胰蛋白酶 链霉素 原代培养 死细胞]……
HL－60细胞的培养技术1．HL-60的培养方法Ⅰ.准备和条件：a.ATCC的完全培养基：iscove”s modified Dulbew”s 4mM的L-谷氨酸盐 培养基，调整至含有1.5％的钠重碳酸盐，80％的小牛血清20％，100毫克每升链霉素，100单位每升的盘尼西林（DMEM）注：生长培养液：10％－20％小牛血清；维持培养液：2％－5％小牛血清b.温度：37度c.环境：空气95%,二氧化碳5％d.操作：不停加入新的培养液和更换培养基来维持培养环境，或者，能通过在1×10（5）的细胞离心后续的悬浮液，不允许细胞的浓度超过1×10（6）个e.注意事项：保持细胞浓度在1×10（5）－1×10之间，f.培养液更换时间：每2－3天g.培养范例： （附）培养细胞的基本技术：1．原代培养：血液，羊水，胸水和腹水等细胞悬液，采用低速离心法，组织块用胰蛋白酶或胶原酶消化法，使组织分散。2．传代培养：贴壁细胞传代多采用胰蛋白酶和EDTA的消化液，
悬浮细胞则传代直接添加新鲜的培养液3．冻存和复苏：冻存前向培养基加入保护剂甘油或DMSO“慢冻快溶”在液氮中4．放置材料：组织可存放在冰浴或4度冰箱中
a. 普通培养基：100单位每毫升，青霉素；100毫克每毫升，链霉素
b.癌细胞培养基： 2维克每毫升，二性霉素；200－1000单位每毫升，青霉素；200－500维克每毫升，链霉素5．生存条件：DEME:六碳糖，12中基本aa（谷氨酰氨特殊作用是促进各种aa通过细胞膜）,8种维生素：1um氢化可的松，1um异丙肾上腺素，1um胰岛素(insulin)，100u/ml盘尼西林，100u/ml链霉素，5％温无活性的小牛血清
PBS:Nacl:8克每升；Kcl:0.2克每升；Na2HPO4.12H2O:2.89克每升；NaH2PO40.2克每升，加蒸馏水至1升，可用18磅35分钟高压压菌
EDTA：(0.02％)EDTA溶于1升的无Ca，Mg的磷酸缓冲液PBS中高压灭菌，分装小瓶4度保存
指示剂：1％台酚蓝和0.2%伊红染色液：死细胞成蓝色或红色室温保存Ⅱ.操作步骤：将购得的HL－60细胞即刻放入到培养瓶中（不能马上使用放到4度的冰箱中冻存，具体见细胞的冻存和复苏）
用新洁尔灭洗手数遍，擦干
进入到操净台（小孔内为无菌区），用酒精棉球反复擦手，将无用器皿推至后排（注意：保留一个高架子放置无菌枪及盖子）
将酒精灯点燃，取出培养用小牛血清，打开瓶盖（注意：开前用酒精擦拭，在火上撩瓶口，用火烧镊子取盖，不要用手触到内面）
打开瓶盖，将瓶子放在酒精灯上烧灼，再烧镊子，将瓶子放在左手边的空处（注：不要手臂来回晃荡）
将培养瓶轻放在操净台上，打开盖子前在火上轻漂，用EPPENDOFF管吸小牛血清（注意：用量小时，用普通吸管吸后置于干净的小容器中，在用管吸取准确克数
将盖子盖好，再在火上轻漂一遍，将小牛血清瓶口烧灼后盖好（无菌观念培养）
将培养瓶放入在恒温孵箱中
原代培养一次大约使细胞倍增2－6次，要将其转移到其他的容器中，一般原代培养潜伏期24－96h，指数增长期3－5d，平台期
用显微镜观察其生长情况（细胞数量，死细胞数量）注意：PH指示剂的培养基存在：颜色可显示细胞生长情况：橙黄色;生长好；淡黄色:培养时间长，营养不足；紫红色：已死亡
使用显微镜前用酒精擦拭界面，观察细胞的悬浮生长浓度以及和死细胞的个数，发现细胞密度过高
用细胞分散剂消化并传代：分散剂有0.1%-0.5%的胰蛋白酶和0.02%EDTA，用0.25%胰蛋白酶浸泡细胞层，37度放置3－10分钟，用吸管吹打次数使细胞成悬液，移至中，以800－1000rmp离心10分钟，弃去上清液，加入新培养液
Ⅲ.细胞冻存：ⅰ.冻存保护剂：DMSO和甘油，液氮存储器ⅱ.方法：细胞用胰蛋白酶或使EDTA分散后，用冻存保护液稀释至2－5×10（6）每毫升，冻存保护液为原培养液加10％血清，5％－10％DMSO和10％甘油，预先配置冷却
细胞悬液分裂于2毫升的安培瓶中，装量1毫升，火焰封好，做好标记，置于纱布袋中
安培瓶中放入液氮前逐渐降温，以1度每分，降至－30度
复苏将其置于37－40度，充分摇动使其急速融化，30秒－1分钟内完成
细胞悬液低速离心，去除上清夜中保护添加剂
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细胞工程实验教程讲义2012
实验一 [实验目的]清洗与灭菌能独立进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与灭菌，掌握干热灭菌法、湿热 灭菌法和滤过除菌法等操作技术，了解化学灭菌法的使用方法。了解各种物理及 化学消毒和灭菌的原理和适用范围。 为了维持细胞在体外长时间的生长繁殖， 器具应严格洗净并用高压或干烤灭 菌，对不能高压和干烤的培养液等，可用除菌漏斗过滤除菌。维持细胞在体外生 长的操作环境一般在无菌室(密闭、 紫外线杀菌)进行； 近年来多应用洁净工作台， 借助空气过滤和高速吹风使细菌不能下落，也有两者结合使用的。操作人员的手 必须洗净和消毒。 为保证培养基的无菌条件，一般在培养基中加入青霉素 100uMmL、链霉素 100μ gMmL。 也有人认为抗菌素具有毒性和抗药性而不加，这就需要更严格的无 菌操作技术。 清洗与灭菌是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大的、最基本 的步骤， 也是其他组织培养实验成功的前提。体外培养细胞对所使用的各种玻璃 或塑料器皿的清洁和无菌要求程度很高。 细胞培养不好很多时候与清洗不彻底有 关。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明、无油迹，而且不能残留任伺物质。 一些有毒的化学物质，哪怕残留 0.1μ g，也可能影响细胞生长。 无菌操作是保障细胞培养成功的关键因素， 为此所用的全部器具必须保证无 菌，操作过程不能带人任何细菌和其他微生物，这是维持细胞生存的基本条件。 灭菌与消毒在概念上是不同的， 消毒只要求杀灭或清除环境中的致病微生物，使 其数量减少到不再能引起人发病，或者说使其无害化。灭菌不仅要求杀灭或清除 致病微生物，还要求将包括非致病微生物在内的所有微生物全部杀灭或清除掉， 这包括细菌、病毒、真菌、支原体和衣原体，也包括抵抗力极强的细菌芽孢等， 以达到无菌的目的。所以灭菌比消毒要求更高。总之，消毒只要求场所与物品达 到微生物很低密度的水平，而灭菌则要求达到没有一个活菌存在。 “灭菌”可以 达到消毒的目的，但消毒不一定能达到灭菌的效果。 在细胞和组织培养工作中， 灭菌与消毒分别应用于不同的场所和对象。无菌 室的地面、墙壁、台面、超净工作台的台面等应定期进行消毒处理；而直接与活 细胞接触的培养器皿、培养用液、各种药物等应实施严格的灭菌操作。 灭菌的方法很多， 大致分为物理灭菌和化学灭菌两类。 前者包括紫外线灭菌、 高温灭菌、过滤除菌等；后者包括各种有机化学物灭菌。灭菌原理主要是使微生 物胞体蛋白变性或破坏核酸结构而失去生命活性。例如，紫外线主要是损伤细菌1和病毒的 DNA，而多数化学灭菌剂的作用是使蛋白变性。消毒手段的选择十分重 要，对不同的物品需采用不同的消毒方法。假如选用的方法不对，即使达到了无 菌却使被消毒生物晶丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。在以 下的每种消毒步骤中都将介绍其使用。 【实验用品】 器具：超净工作台、干燥箱、高压锅、过滤泵、无臭氧型紫外灯、过滤器 (F25mm)、玻璃棒、烧杯、包装纸。 试剂：70％或 75％乙醇、0.1%新洁尔灭、煤酚皂溶液(来苏儿水)、0.5％过 氧乙酸、乳酸、37％甲醛、高锰酸钾、酸性洗液。 材料：微孔滤膜(F25mm)：孔径为 0．22mμ m；微孔滤膜(F90mm)；孔径为 0．22μ m。 【实验方法与步骤】 (一)使用过的玻璃器皿的处理与清洗 (1)使用过的培养用品应立即浸入清水，避免干涸难洗。 (2)用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍。倒置自然干燥。 (3)浸入酸性洗液过夜。新配制的洗液颜色为黑红色，将玻璃器皿浸泡 2～ 4h 便可冲洗；而使用时间较长的洗液，其颜色逐渐由黑红色变成黑绿色，甚至 墨绿色，其去污能力逐渐下降，应适当延长浸泡时间。使用更长时间的酸性洗液 转为绿色，应重新配制洗液。浸泡时，应使瓶内的所有玻璃表面都接触到洗液， 勿留气泡或死角。 没有浸泡干净的玻璃器皿，可能影响细胞的生长状态或影响显 微摄像的效果。 (4)培养用品从酸性洗液捞出后用自来水冲洗 lO~15 次，去除残余酸液，蒸 馏水溺洗 3 次或浸泡过夜，倒置烘干。 (5)包装：用牛皮纸或一般纸，将培养器皿包好。培养瓶和培养用瓶只需包 裹封住瓶口即可。 (6)高压(15MPa，20min)或干热消毒(160℃，2h)。 (二)胶塞的处理 (1)新胶塞应先用清水清洗之后再用 0.2％NaOH 煮沸 10～20min。 (2)自来水清洗 10 次。 (3)再用 1％HCl 浸泡 30min。 (4)自来水清洗 10 次，蒸馏水涮洗 3 次。晾干后包装，高压灭菌。 旧胶塞不必用酸碱处理， 可直接用洗涤剂煮沸和清洗数次， 过蒸馏水， 晾干、 包装，高压消毒，烘干后便可使用。 （三）常用洗液配制2（1）按照表 1 提供的数据称取重铬酸钾于适当体积大小的玻璃烧杯中，加 入表中所示的蒸馏水，搅拌。表1 常用洗液配方成分强酸溶液 63g 1000 mL 200 mL次强酸洗液 120g 200 mL 1000 mL重铬酸钾 浓硫酸 蒸馏水 分溶解。(2)加热表 1 中的液体，并用玻璃棒不停地搅拌，待沸腾时重铬酸钾即可充 (3)戴防酸手套和眼镜，井穿好耐酸衣裤和鞋。小心将已溶解的上述液体倒 人 1 个干净的无水的陶瓷材料制作的洗液酸缸或其他耐酸材料制作的酸缸中。 (4)首先用烧杯(最好用一带把容器)将少量工业浓硫酸(约为终体积的 1／ 10)沿酸缸内壁缓慢加入，此时可发生剧烈的产热反应并有热硫酸溅出，要特别 小心。 (5)继续第(4)步骤两到三次，产热反应将逐渐减弱，待没有气泡产生后，方 可将浓硫酸桶中的其余浓硫酸直接加入到酸缸中，直至最终需要量为止。 正常使用情况下，酸性洗液半年左右配制一次。 (四)消毒和灭菌 1．物理消毒法 1)射线消毒 主要使用 60Co、X 射线进行灭菌消毒，可用于牛血清和塑料制品的灭菌。 2)紫外线消毒 用于空气消毒，操作台面和一些不能用于热，湿热消毒的培养器皿，如塑料 培养皿、培养板等，是常使用的消毒方法之―。 消毒方法，现在一般用无臭氧型紫外灯。消毒的效能与消毒的距离成反比， 因此应根据消毒的目的适当设置消毒距离： 进行空气消毒时灯管应距地面 2． 50m 以内；台面的消毒应在 0．80m 以内；培养器皿的消毒在 0．30m 以内。 3)干热灭菌 主要用于玻璃器皿的灭菌。 将用于细胞培养的器皿包装后放入干燥箱内，加热到 160℃，保温 90～ 120min。 用于 RNA 提取实验的用品则需 180℃，保持 5～8h。 4）湿热灭菌 此方法也成为湿热高压蒸汽灭菌，适用范围广，是最有效的灭菌方法之一。3主要应用范围是布类、橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品 以及加热后不发生沉淀的无机溶液， Hanks 液、 如 PBS、 20×SSC 等。 15MPa(121℃) 用 作用 20min。 5)滤过除菌 用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液的灭菌。 采用金属滤器和小型的塑 料滤器，配上可以更换的微孔滤膜，极大地方便了操作。滤器型号按直径大小划 分。如过滤量大的培养用液常用较大型号的金属滤器(F142mm、F100mm 和 Fgomm 等)，配于过滤泵使用。过滤量较少的培养用液常用注射器正压推动液体通过塑 料小滤器(Ф 25mm、 20mm 和Ф 10mm 等)。 Ф 滤膜孔径有 0． 60μ m、 45μ m、 35 0． O． μ m、以及 0．22μ m、0.1μ m 等，以 0．22μ m 除菌最为合适，但对于较黏稠难 滤过的液体，可选用吸附性滤膜过滤。 在过滤器上装上孔径适当的微孔滤膜，用布包好，湿热灭菌后使用。 6)煮沸灭菌 急性灭菌可用煮沸法，器械等煮沸 15rain 后可使用。效果不如高压蒸汽灭 菌。 2．化学消毒法 常用的消毒液有如下几种。 (1) 70％(或 75％)乙醇：超净台里常备 70％酒精棉球(卫生级酒精)，用于 手和一些金属器械，或工作台面的消毒。 (2) 1％o 新洁尔灭：主要用于手和前臂的清洗以及工作后的超净台面的清 洁。超净台旁应常备盛有 1％新洁尔灭溶液的容器及纱布。 (3)来苏儿水(煤酚皂)：主要用于无菌室的桌椅、墙壁、地面的消毒和清洗， 以及空气喷洒消毒， 特别是带有污染培养物的培养器皿的消毒处理。使用浓度请 按瓶上的说明。 (4)0.5％过氧乙酸：是强效消毒剂，10min 即可将芽孢菌杀死。用于各种物 品的表面消毒。用喷洒和擦拭方式进行消毒。 (5)乳酸蒸气：用于房间空气消毒。将乳酸放人坩埚内用酒精灯或电炉加热 至沸腾为止， 再将加热源关掉。 门窗紧闭 1～3d。 可将空气中漂浮的微生物杀死。 (6)37％甲醛加入高锰酸钾：也用于房间空气消毒。使用前先紧闭门窗。将 37%甲醛用酒精灯或电炉加热至沸腾后断电或灭火。用一张纸盛好适量的高锰酸 钾，迅速放人已加热好的甲醛中形成蒸气。1～3d 后方可达到消毒空气的目的。 【注意事项】 (1)干热灭菌时，应在白天使用干烤箱，并不断观察，避免发生意外。当温 度超过 100℃时，不能再打开烤箱门。器皿烤完后，待温度降至 100℃之下才能4开烤箱门取出灭菌物品。金属器械、橡胶、塑料制品和一些高温后变性的物品， 均不能使用干热消毒方法。 (2)高压灭菌后器皿务必烘烤或晾干，以防包布或纸潮湿而发霉。此外，落 在潮湿包装纸表面的细菌仍有机会通过渗入的水进入已灭菌的瓶内。 (3)牛血清、大部分培养基、胰酶和一些生物制剂是有机溶液，均不能使用 湿热灭菌法，否则其中的蛋白质将发生变性。而一些加热分解的物质，如 TdR、 秋水仙素、谷氨酰胺、异硫氰酸胍、MOPS 等，也不能进行湿热灭菌。 (4) 滤过灭菌时，滤器在使用前先装好滤膜(有时可在上面加一层定性滤 纸)，包好，经高压后才能使用。滤过酶类制剂时，应待过滤器降至室沮时，才 能进行。使用滤过除菌时，过滤泵调节的压力不宜过大。压力太大时，微孔滤膜 有可能破裂， 或者使某些微生物在较大压力下产生变形而通过滤膜。过滤器中的 滤膜放置的位置一定要准确，防止边缘留有缝隙，使过滤液直接通过。另外滤器 包装时，螺钉不要拧得太紧，以免高压蒸汽不能进入，待高压灭苗之后再拧紧使 用。 (5) 使用化学消毒法时，应用卫生级配制 75％乙醇。而不能用化学纯、分 析纯和优级乙醇。来苏儿水不能用于皮肤消毒，因为它对皮肤有刺激性。空气消 毒时，所有的物品要事先准备齐全，井使消毒者有较方便的迅速退出的路径。因 为一旦甲醛或乳酸被加热后， 放出的蒸汽对人的角膜和呼吸道上皮有严重的刺激 和伤害作用。 (6) 与 RNA 操作有关的器皿消毒时间应更长，这不仅仅是为了灭菌，更为了 灭活 RNA 酶， 防止在随后的操作中 RNA 被残留的 RNA 酶降解。如普通玻璃器皿干 热灭菌条件是 160℃2h，而提取 RNA 的玻璃用品需 180℃，至少 4h。 (7) 使用乙醇消毒时注意应使用 75％乙醇，无水乙醇或 95％乙醇不能达到 消毒效果。 【教学内容】 (1) 教师组织参观和示教各种消毒方式。 (2) 本次实验具体洗／包试管和瓶子、装滤器、装加样头、准备吸管和盖子 等均用于下次实验。 (3) 学生练习使用湿热消毒和干热消毒。 (4) 本次实验学习的是进行细胞培养的实验准备， 实验过程看准备内容多少 而定需要 2～3h。 【思考题】 (1) 哪些物品适合于湿热消毒? 哪些物品不适合于湿热消毒? (2) 哪些物品适合于紫外线消毒?哪些物品不适合于紫外线消毒?5(3) 消毒剂的使用范围及注意事项?6实验二 【实验目的】培养基的配制熟练掌握培养基 （RPMI1640 和 DMEM） 的配制， 了解其他培养基的配制方法。 【实验原理和技术背景】 早期细胞培养多使用天然培养基， 主要是生物体的各种体液， 如血浆、 血清、 淋巴液、组织或胚胎提取液。其优点是容易得到，营养价值高；缺点是成分不可 控制。 目前常用的是化学成分明确的合成培养基。合成培养基是模拟细胞和组织 生长所需要的营养成分而设计的化学成分明确的培养基，目前广泛应用。但目前 多数情况下合成培养基还不能彻底替代天然培养基，两者常配合使用。组织培养 使用的培养基一般是有合成培养基和小牛血清配制而成。 合成培养基有商品出售，它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状 物质。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。 用它配制成的培养液的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。 动物细胞的培养 大多数是需要轻微的碱性条件，pH 为 7．2～7．4；而植物细胞大多数需要酸性 条件。NaHCO3 用来调节 pH。 培养基含有细胞生长所必需的各种营养成分，包括氨基酸、维生素、碳水 化合物、无机离子和其他辅助物质。①氨基酸：合成培养基通常不含有全部合成 蚕白质所需的氨基酸， 只含有必需氨基酸和较雄合成的氨基酸，谷氨酰胺除用于 蛋白质合成外还具有特殊的作用。它能促进各种氨基酸进入细胞膜，是核酸合成 的氮源，还参与 ATP 的合成。②维生素：多数合成培养基添加生物素、叶酸、烟 酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素及 B12 等水溶性维生素，脂溶性维生素可 从血清中得到补充。③无机盐：细胞生长需要 Na+、K+、Ca2+、Mg2+、N 和 P 等基本 元素及碳酸氢盐、磷酸氢盐，还需要铁、铜和锌等微量元素。这对维持细胞渗透 压，维持酶的活性，调节溶液的酸碱度等方面起着重要的作用。④碳水化合物： 是细胞生命活动的主要能量来源，主要添加 D―葡萄糖，也有添加 D―半乳糖、D 甘露糖和 D 果糖等。 ⑤血清： 普通的细胞培养需要在合成培养基中添加一定量的 血清才能使细胞增殖，原因是血清中含有细胞生长因子；血清还提供一些酶、维 生素、微量元素和激素等；血清能中和如重金属等有毒物质的毒性，对细胞起到 保护作用；血清可抑制胰蛋白酶的活性；血清可提供接触和伸展因子，增加细胞 对瓶皿的贴附性。用于细胞培养的血清常用牛血清。一般动物越年轻；其血清越 有利于细胞生长，故成年牛血清不如小牛血清好，小牛血清不如胎牛血清好。⑥ 其他成分：包括肌醇、胆碱、胆固醇、酸碱指示剂(如酚红)、丙酮酸钠等。 【实验用品】7器具：过滤泵(进口)l 套、无菌过滤器(进 IZl)1 套、蒸馏器、高压消毒锅、 磁力搅拌器、超净工作台 2000mL 锥形瓶、]00mL 或 50mL 无菌培液瓶；无菌翻帽 塞、无菌胶帽盖、无菌玻璃瓶(250mL 或 500mL)、pH 试纸、Ф 90mm 0．22μ m 的 微孔滤膜、量筒。 试剂：合成培养基(RPMIl640 或 DMEM)、NaHC03。 【实验方法与步骤】 (1) 去离子水用蒸馏器进行重新蒸馏(去除无机和有机杂质)，制成 1000mL 三蒸水。三蒸水应及时使用，如果放置一段时间，则使用前须高压处理三蒸水 (15MPa，20min)。 (2) 待水温降至 15～30℃，加入合成培养基于粉，用磁力搅拌一定时间 (2～4h)使之充分溶解。 (3) 配制 RPMll640 培养基时应通人适量 OQ 或加入 6mol／LHCI 调 pH 至 6． 0 左右，这样才能充分溶解。而配制 DMEM 不需要此步骤。 (4) 加入一定量 NaHC03 调节 pH 至 6.9 左右。 (5) 加水至最终体积。 (6) 打开超净工作台内的紫外消毒灯 20min 以上。在超净工作台中对溶液 进行过滤除菌，分装入 100mL 或 50mL 无菌玻璃瓶中。 (7) 瓶口封好，4℃冰箱储存(RPMll640 培养液可以一 2CC 储存)。 【注意事项】 (1) 培养细胞使用的瓶子和饭盒应与提取 RNA 和培养细菌用的瓶子和饭盒 严格分开。因为用于处理提取 RNA 的 DEPC(0．2％焦炭酸二乙酯)是一种致癌剂， 并可能影响细胞生长。 而培养过细苗的用品也不应与培养细胞的混用，以免造成 细菌污染。 (2) 过滤时过滤泵的压力不要太大，否则使滤膜破裂，起不到除菌的效果。 分装时需根据使用量的多少分装于大小合适的瓶子中，分装量为使用 3～5 次用 完为宜， 并且每瓶只能装 2／3 体积的液体，过多时会影响使用或产生污染机会。 (3) 培养液过滤后 pH 可提高 0． 2～0． 故在过滤前调节培养液 pH 至 6． 3， 9 左右即可。过滤后达到 pH7．1～7．2。 【教学建议】 (1) 本次实验配制的培养基，每 4 人为 l 组，分装成 45mL~3 瓶和 90mLXl 瓶，分别用于细胞传代培养、细胞冻存与复苏、新牛血清筛选、原代培养和药物 综合实验等实验。 (2) 本次实验是学习进行细胞培养的实验准备工作，实验前需进行培养用 水的纯化和湿热灭菌。加入合成培养基干粉，用磁力搅拌 2～4h 使之充分溶解。8(3) 上实验课时，可先溶解合成培养基干粉，再进行 PPI'讲解实验过程和 原理。 (4) 课堂上培养基的搅拌时间只有 1h，整个操作时间看配制培养基多少而 定，可能需要 2～3h。 【思考题】 (1) 合成培养基的主要成分是什么? (2) 为什么配制培养基之前要反复处理配制用水井要事先高压处理? (3) 配制培养基时调节 pH 目的是什么? 附：D-Hanks 液和消化液(胰酶液)的配制 【实验目的】 熟练掌握 D-Hanks 液等平衡盐溶液的配制，了解消化液(胰酶液)的配制 方法。 【实验原理及技术背景】 D-Hanks 液是常见的平衡盐溶液(BSS)之一，提供了维持细胞生存的必要 条件。 与细胞生长状态下的 pH、 BSS 渗透压及无菌状态相一致， 由于其配制简单， 又是组织培养基本用液， 因此它常用于配制培养基及其他常用液体，以及漂洗细 胞等。BSS 提供了细胞生长所需的基本成分，细胞可在 BSS 中生存数个小时。 常用细胞消化的胰蛋白酶溶液是一种细胞分散液， 进行原代和传代培养时， 均用于处理组织块， 使细胞分离开来和使培养细胞离开所贴附的培养瓶表面，并 分散成单个细胞。胰蛋白酶主要采自牛或猪的胰脏，呈白色粉末状，易潮解，一 般在低温干燥处保存。 胰酶的活力常用一份胰酶解离酪蛋白的份数表示，常用胰 酶活力为 1：125 或 1：250。一般用 1：250，GRC 公司生产。胰蛋白酶对细胞的 分离效果与细胞的类型、特性与瓶壁表面特性有关。一般来说胰蛋白酶浓度大， 温度高(勿高于 37℃)，作用时间长，则对细胞分离能力大。但超过一定程度会 损伤细胞，导致细胞传代后不能贴壁或死亡。胰酶在 pH88.0，37℃时消化能力 最强。溶液中的 Ca 、Mg 和血清会降低胰酶活力，所以配制胰酶时须用无 Ca 、 Mg2+的 D-Hanks 液。当消化结束时，可加入少量血清或含血清的培养液以终止胰 酶作用。 细胞传代使用的胰蛋白酶浓度是 0.25％或 0.2％。用于原代细胞培养消 化组织块则为 0.1％或 0．125％。 【实验用品】 器具：抽滤泵 1 套、无菌过滤器 1 套、高压消毒锅、量筒、磁力搅拌器、 研磨器、超净工作台、2000mL 锥形瓶、25mL 或 50mL 试剂瓶、500mL 输液瓶、螺2+ 2+ 2+9口盖、翻帽塞、pH 试纸、5～10mL 注射器、25mm 小滤器、0．22μ m 的Ф 25 mm 徽孔滤膜。 【实验方法与步骤】 1. 配制 Hanks 液 （1）Hanks 液与 D-Hanks 液的成分比较。 (2)依次加入表中药品至 800mL 蒸馏水中，溶解后定容至 1000mL。分装成 100mL／瓶，其中 l 瓶加入终浓度 0．02％的 EDTA，准备配制胰蛋白酶。 (3)高压灭菌，10MPa，10min。 2．配制胰蛋白酶消化液 (1)在 D-Hanks 液高压灭菌之后，晾至室温，4℃保存备用。 (2)称取一定量胰蛋白酶粉末于研磨器中(夏天时研磨器应放在冰浴中)， 加入少量 D-Hanks 液碾磨 100～1000 次，调制成糊状。再放人 4℃预冷的适量 D-Hanks 液中，4℃下磁力搅拌使完全溶解(一般 4～12h)。 (3)用 NaHCO》干粉将胰酶溶液的 pH 调至 8．0 左右(胰酶作用的最适 pH 为 8．2)。 (4)过滤除菌(方法见培养基的配制)，-20℃保存。 【注意事项】 (1)BSS 的 pH 应确定为 7．2 左右。可在加入酚红前检测，或根据加酚红 后 D-Hanks 液的颜色调整。 (2)若配制的 Hanks 液经过湿热灭菌液体变混，则可在配制溶液时，将 100mL 的 CaCl2 与其他成分分开溶解和灭菌，再在无菌条件下合在一起定容，这 样可避免湿热灭菌之后液体变浑。 (3)胰酶受热易失活，所以，在配制过程中尽量保证 D-Hanks 液的温度始 终保持在 4℃左右。 (4)胰酶研磨耍充分否则在过滤时会将较大的颗粒过滤掉，不能达到真正 的浓度。 (5)胰酶分装时，尽量分装成许多小瓶，并遵守 3 次左右用完和只装 2／3 瓶体积的原则。 因为冷冻保存时体积会膨胀，而多次使用同一瓶胰酶或反复冻融 会降低酶的活力，从而使消化效果较差，同时也可能增加污染的机会。 【教学建议】 (1)本次实验配制的 D-Hanks 液，每 5 人为 l 组。100mL×2 瓶，lOOmLl 瓶分别用于原代培养和胰酶配制。 (2)每 5 个学生配制 0.25％的胰酶含 0．02％的 EDTA 50mL，经过研磨充 分溶解，并调节 pH，用 10mL 注射器和 o．22μ m 的Ф 25mm 微孔滤膜的小滤器过10滤。 (3)课堂上胰酶的搅拌时间只是 1h，整个操作时间看配制胰酶多少而定， 可能需要 2―3h。 【思考题】 ‘ (1)D-Hanks 的主要用途是什么? (2)配制胰酶消化液时应注意哪些问题? (3)细胞实验中使用平衡盐溶液的机制。11实验三 【实验目的】动物细胞传代培养熟练并掌握细胞的传代培养法。 【实验原理及技术背景】 传代培养是细胞学实验中常规保种方法之一， 也几乎是所有细胞学实验的 基础。原代培养细胞贴壁生长至铺满培养瓶生长面或悬浮生长细胞密度足够大 时，经过对培养细胞的分割，重新接种到两个或两个以上的器皿内进行培养，称 为传代。 经过传代后的培养叫做传代培养。 原代培养物在首次传代后即为细胞系。 传代培养可以持续进行多代。能够连续多次传代的细胞系叫作连续细胞系 (continuouscellline) ； 不 能 连 续 培 养 的 细 胞 系 为 有 限 细 胞 系 (finitecellline)。 而细胞株(cellstrain)是指通过选择法或克隆形成法从原代 培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志(marker)的培养物。 单个细胞经过 克隆培养形成的细胞群体即为细胞株。 如果细胞群体中绝大多数细胞的染色体数 目为二倍体(2n，占细胞总数郧％以上)，且核型也与原来的组织相同，那么，该 细胞叫做二倍体细胞。 如果细胞在取材时或在组织培养过程中发生了遗传性状的 改变，细胞转化后的性状可以代代相传，并能长期存在，则称为转化细胞 (transformed cell)。实验室保留的细胞多为转化细胞。传代培养可获得大量细 胞供各种实验所需。 传代要在严格的无菌条件下进行。维持细胞在体外生长的操 作环境一般在无菌室(密闭、紫外线杀菌)进行；近年来多应用洁净工作台，借助 空气过滤和高速吹风使细菌不能下落。也有二者结合使用的。操作人员的手必须 洗净和消毒。每一步操作都需要认真仔细地无菌操作，以保证实验的正常进行。 组织培养的基本方法。 （1）静置培养：将细胞悬液接入培养瓶或培养皿中，置恒温培养箱内静置 培养。 细胞沉降到培养瓶底或培养皿底后黏附在瓶底表面上，细胞生长分裂后沿 瓶底侧向铺开成单层细胞。 正常细胞在细胞相互接触后停止繁殖。而转化的细胞 失去接触抑制而造成多层生长。有些细胞落至瓶底后并不贴壁，而是浮在瓶底， 轻轻振荡即可悬浮起来。这种细胞均呈球状。 (2)悬浮培养： 通过振荡或转动装置使细胞始终分散悬浮于培养液内的培养 方法，有利于细胞吸收营养物质和氧气。 (3)转瓶培养： 将细胞悬液接人转瓶中，待贴壁后置于细胞转瓶机上进行培 养，使贴壁细胞并不是始终浸于培养液中，从而有利于细胞呼吸和物质交换，使 细胞的生长加速。 (4)微载体培养： 以细小的微载体颗粒作为细胞载体，通过搅拌悬浮于培养 液内，接种细胞，使细胞在微载体表面长成单层的一种细胞培养技术。微载体可12以提高供细胞贴附的表面积。 (5)中空纤维细胞培养(hollow-fiber)： 也是一种提高细胞生长表面积的方 法。 利用一种人工的毛细管即中空纤维给培养的细胞提供表面。中空纤维培养技 术的优点是不产生剪切和营养成分的选择性渗人，使培养细胞和产物密度提高。 缺点是观察困难。 目前中空纤维反应器已进入工业化细胞生产，用于培养杂交瘤 细胞来生产单克隆抗体。 (6)微囊化细胞培养： 微囊化培养是借助固定化技术将细胞包裹在半透膜微 囊中，在培养液中悬浮培养。同样可以克服旋转培养时的剪切作用，并方便细胞 产物的分离纯化处理。 此外，还有盖片微室悬滴培养法、半固体培养法、克隆培养法、回转器培 养法等方法。 【实验用品】 器具：CO2 培养箱、倒置显微镜、超净工作台、水浴锅、无菌培养瓶、无苗 试管、无菌刻度移液管、无菌巴斯德吸管、废液缸、75％酒精棉球、酒精灯。 试剂：培养液(RPMI1640 或 DMEM)、小牛血清或胎牛血清、0．25％胰蛋白 酶、Hanks 液、新洁尔灭溶液。 材料：需传代培养的细胞，这里以 HeLa 细胞为例。 【实验方法与步骤】 1.贴壁细胞的传代 (1)人无菌室之前首先要用肥皂或洗手液洗手， 用新洁尔灭溶液拭擦双手消 毒(如果进行较严格的无菌实验，则须分别浸泡 l～3min 的 1％新洁尔灭溶液和 75％的乙醇)。 (2)打开超净工作台的紫外消毒灯(紫外消毒 20～30min)。从 C O2 培养箱取 出培养细胞， 倒置显微镜下观察细胞形态和生长密度，确定细胞是否需要传代及 细胞需要稀释的倍数。将培养用液置于 37℃下预热。 (3)将超净台台面收拾整洁，用 75％乙醇擦双手消毒，并擦净台面。 (4)关闭已照射超净工作台 20 min 左右的紫外灯，打开抽风机清洁空气， 除去臭氧。 (5)点燃酒精灯； 取出无菌试管过酒精灯火焰后插入试管架内。取出巴斯德 吸管和刻度吸管，安上橡皮头，过乙醇灯火焰后，插在无菌试管内。 （6）将培养用液瓶口用 75%乙醇消毒，去除瓶口胶塞，过酒精灯火焰后斜 置于酒精灯旁的架子上。 （7） 培养液的配制： 将已经配好的合成培养液(RPMI1640 或 DMEM)与小牛血 清或胎牛血清以 9：1 的比例混合，配成工作液(完全培养基)。13(8)倒掉细胞旧培养液。 酌情先用 0.5～lmL 的胰蛋白酶涮洗一下培养瓶，去 残留的旧培养液，解除残留血清对胰蛋白酶的抑制作用。 (9)每个大培养瓶加入 lmL 胰酶，小瓶用量酬减。盖好瓶盖后在倒置显微镜 下观察，当细胞突起收回即将变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰蛋白酶，然 后将胰蛋白酶去掉。注意勿使细胞提早脱壁落人消化液中。 (10)加入 5mL 的含血清的新鲜培养基， 反复吹打贴附细胞的培养瓶底使消化 好的细胞脱壁并分散，制成细胞悬液并计数。根据计数结果，按每个小方瓶 3× 105 接种细胞做传代培养，添加培养液至 3mL，制成 1×105 个细胞／mL 的细胞悬 液，然后分装到 1 个新培养瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，给出空气通 道，以利于 CO2 气体的进出，将培养瓶放回 CO2 培养箱。 (11)也可将上述消化下来的细胞悬液接种到内含盖玻片的小平皿中进行爬 片培养。每个小平皿加入 1×105 个细胞／mL 的细胞悬液 4mL，内含 4 张盖玻片。 2．悬浮培养细胞传代 悬浮培养的细胞传代培养操作比较简单，首先在倒置显微镜下观察细胞密 度， 或用细胞计数板计数细胞， 确定细胞稀释的倍数。 然后离心(800r／min， 5～ 10min)去除旧的培养液， 加入适量新鲜培养液，制成 1X10$个细胞／mL 的细胞悬 液。然后分装到数个新培养瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，给出空气通 道，以利于 C02 气体的进出，将培养瓶放回 002 培养箱培养。 【实验结果】 细胞传代培养后定期在倒置显微镜下观察细胞形态和生长状况，一般每 24h 观察一次即可。 【注意事项】 (1)传代培养时要注意无菌操作和防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽 量靠近酒精灯火焰， 所有玻璃用品使用前用酒精灯火焰烧一下，以玻璃内表面凝 结的水汽蒸干为度。 每次最好只进行一种细胞的操作。 每一种细胞使用一套器材， 不能交叉使用。培养用液应严格分开。 (2)掌握胰蛋白酶消化时间非常重要。消化时间不足，细胞吹打不下来，过 度用力吹打细胞还可能对细胞造成损害。但如果胰蛋白酶消化时间过长，细胞就 可能在吹打前自动脱落到胰蛋白酶消化液中造成细胞损失， 胰蛋白酶过度作用也 可能损害细胞活力。 (3)每天观察细胞形态， 掌握好细胞是否健康的标准： 健康的细胞形态饱满， 折光性好，培养液中漂浮物少。细胞铺满瓶底长达到致密时即可再次传代。 (4)如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃掉污染的细胞，如 果必须挽救， 可用加有抗生素的 BSS 或培养液反复清洗，随后往培养液中加入较14大量的抗菌素，并经常更换培养液等。 (5)为保证培养基的无菌条件，一般在培养基中加入青霉素 100μ g／mL、 链霉素 100μ g／mL．也有人认为抗菌素具有毒性和抗药性而不加，这就需要更 严格的无菌操作技术。 【教学内容】 (1)本次实验细胞培养，每 5 人为 1 组。每 5 人分别接种 1 瓶 HeLa 细胞、 或 CHO 细胞。 (2)如果细胞传代役有污染，且接种浓度适宜可作为下次细胞冻存实验的 实验材料。 (3)本次实验课所需时间约 2h。 【思考题】 (1)细胞传代培养的目的是什么? (2)采取何种手段在传代过程中不被微生物污染? (3)传代贴壁细胞和悬浮细胞方法上有什么不同?15实验四【实验目的】细胞冻存与复苏掌握细胞保存的原理和方法，能独立地进行细胞冻存与复苏操作。 【实验原理及技术背景】 细胞冻存是保存细胞的主要方法之一。低温条件可降低细胞的生命活动、 代谢速度和对营养的需求。在 0℃以下的冰冻条件下，细胞内生命分子的热运动 和化学反应受到了极大的限制， 细胞处于代谢最低甚至停滞状态。因此利用冻存 技术， 将细胞置于-196℃的液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将 其细胞特性保存起来， 这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存 一定量的细胞， 可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种 的危险，起到了细胞保种的作用。除外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄 赠、交换和运送某些细胞。 细胞冻存较难处理的技术环节是细胞通过 0℃这一温度点时由于细胞内外 的水分结冰所造成的冰凌形成， 这些冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏并引起细 胞死亡。为了防止这―现象的发生，在细胞冻存时向培养液中加入保护剂：终浓 度 5％～15％的甘油或二甲基亚矾(DMSO)，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结 条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形疵，可避免细胞损伤． 采用“慢冻快融”的方法能较好地保证细胞活力的保存。标准冷冻速度开 始为-2～-1℃／min，当温度低于-25℃时可加速降温，到-80℃之后可直接投入 液氮内(-196℃)。 复苏细胞时则采取突然苏醒的方式，直接将-196℃下装有细胞 的冻存管投入 37～40℃热水中迅速化冻。快速地恢复到正常温度，使细胞内外 不会重新形成较大的冰晶， 也不会暴露在高浓度溶质的溶液中过长时间。快速复 苏使细胞迅速回到正常温度下，恢复其生长和代谢机能。 【实验用品】 器具：4℃冰箱、-70℃冰箱、液氮容器、水浴锅、离心机、显微镜、冻存 管、离心管、细胞培养用材料、500mL 烧杯、微量加样器、细胞计数板。 试剂：培养液(RPMIl640 或 DMEM)、小牛血清、0．25％胰蛋白酶溶液、二 甲基亚矾(DMSO)或甘油(高压灭菌)、0．4％台盼蓝染液、液氮。 材料：培养细胞，如 HeLa、或 CHO 等细胞。 【实验方法与步骤】 1．细胞冻存 (1)培养室实验准备工作大致同实验三(细胞传代培养)的前 6 个步骤。简言 之： 用紫外消毒灯消毒超净工作台面； 清洗消毒手部； 观察细胞； 预热培养用液； 点燃酒精灯；取出巴斯德吸管、刻度吸管等插在无菌试管内。16(2)冻存液的配制：按如下比例配制：10％甘油+90％培养基，或者 10％ DMSO+90％培养基。用于配制冻存液的培养基中小牛血清浓度适量提高至 20％。 所用的甘油需事先高压灭菌，如使用 DMSO，则不需要任何灭菌措施。 (3)取待冻存的细胞用胰蛋白酶消化(方法见细胞的传代培养部分)。 用含血 清的培养基将细胞冲洗下来。将细胞悬液吸到无菌离心管中，800r／min 离心 5min， 弃上清， 收集细胞沉淀。 如果是悬浮生长的细胞， 则可直接离心收集细胞。 (4)在沉淀中加入适量冻存液制成细胞悬液。细胞浓度宜大，300 万／mL 左右，一般一个中方瓶中的细胞浓缩至 lmL 冻存液中为宜。 (5)细胞悬液装入冻存管中。用胶布封裹，做好标记(写上细胞种类、时间 及冻存条件等)。 (6)冻存管在 4℃下存放 30min，转放-20℃中 1．5～2L，再转入-70℃，4～ 12h 后即可转移到液氮内(-196℃)，注意进行登记。 2．细胞复苏 (1)取一塑料杯盛上适量自来水用水浴锅加热至 40℃左右，或直接使用 37～38℃的水浴。从液氮中取出冻存管立即投入温水中迅速化冻。 (2)取出冻存管，擦去表面的水，用 75％乙醇清洁管口，打开。 (3)如果是添加 DMSO 的冻存液，则需要将 DMSO 去除。离心去上清收集细胞 沉淀，加入无血清培养液洗一次，再次离心去上清。加入 3mL 含 10％牛血清的 新鲜培养基，于小培养瓶中培养。如果是添加甘油的冻存液，则不必去除，直接 加入 2mL 含 10％牛血清的新鲜培养基，吸人小培养瓶中培养。 (4)吸取冻存管中剩余的生冻存原液 27μ L 至一次性 PE 手套上再加入 3μ L 台盼蓝染液，混匀。滴加在细胞计数板上。显微镜下计数细胞，以检查复苏细胞 的存活宰。 活细胞不被台盼蓝染液着色， 仍是透明的白色； 死细胞的细胞膜破损， 台盼蓝进入细胞，细胞呈蓝色。计算其百分比，得到细胞存活率。 (5)每日观察细胞生长情况，如果死细胞较多，复苏次日应换液。待细胞长 满后可进行传代培养。 【注意事项】 (1)在使用含有 DMSO 的冻存液时，因为 DMSO 室沮状态易损伤细胞，所以 在细胞加入冻存液后应尽快放人 4℃冰箱中。 (2)准确记录细胞的种类、冻存时间、冻存液的品种和冻存者的姓名。 (3)细胞冻存和复苏的操作容易造成污染，需特别注意无菌操作。 【教学内容】 (1)本次实验细胞培养，每 5 人为 1 组：2 人使用 HeLa 细胞或 CHO 细胞，另 1 人操作悬浮细胞；或者使用同种细胞，2 人分别使用甘油或二甲基亚矾作为冻17存剂。 (2)每位同学一个月后，复苏 1 瓶细胞，每 5 位同学为 l 组，对于使用消化 法和不使用消化法的冻存和复苏细胞的成活率的差异比较； 或者使用甘油或二甲 基亚矾作为冻存剂的成活率的差异比较。 (3)在使用显微数码互动教室观察使用台盼蓝染色结果，并提交含数码照片 的作业。 【思考题】 （1） 如何运用“缓慢冻存，快速复苏”的原理保存细胞？ （2） 冻存液的作用是什么？ （3） 什么状态的细胞适合冻存？18
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