请教关于RFFIT狂犬病中和荧光检测法方面的知识，谁能帮帮小弟？

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2015-03-31 17:42 标签： 被猫抓伤会得狂犬病吗
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FAVN与RFFIT在动物和人狂犬病中和抗体检测中的比较
优质期刊推荐君，已阅读到文档的结尾了呢~~
RFFIT检测体系的改进和效果评估,评估体系,幼儿发展评估体系,人才评估体系,评估指标体系,价值评估体系,改进的财务分析体系,车辆技术评估与检测,质量检测体系,基础沉降检测?a1c??估,产业评估体系
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RFFIT检测体系的改进和效果评估
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狂犬病快速免疫荧光抑制灶试验（RFFIT）试剂哪儿有卖？
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狂犬病快速免疫荧光抑制灶试验（RFFIT）试剂哪儿有卖？
[ 本帖最后由 首席大弟子 于
09:45 编辑 ]
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应该是荧光灶抑制试验吧
还比较新的,没做过啊
独沐秋风，看枫红落英
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真是新仪器啊,第一次听过
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没听过，应该医学方面的吧
已是悬崖百丈冰，犹有花枝俏
(一群老顽童)
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是一个新增方法:
快速荧光灶抑制试验 （新增）
本法系根据抗狂犬病抗体能中和狂犬病病毒的作用，将供试品与标准品做系列稀释，分别与狂犬病病毒悬液结合，感染敏感细胞， 在规定的时间内用荧光抗体染色并观察荧光灶减少的情况，以测定供试品效价。
试剂：（1）含5%和10%小牛血清的DMEM细胞培养基&&并加入终浓度为100u/ml抗生素和0.03％谷氨酰胺，临用前配制。& &&&
& &&&（2）80% 冷丙酮&&取80ml丙酮，加到20ml PBS(pH7.6，0.1mol/L)中，混匀，加盖密封后4℃冰箱保存。
& &&&（3）磷酸盐缓冲液&&称取磷酸二氢钾0.24g、磷酸氢二钠（Na2HPO4&#O）1.44g、氯化钠8g，加蒸馏水溶解并稀释至1000ml，用氢氧化钠调pH至7.2，临用前配制。
& &&&（4）80%甘油&&量取80ml甘油，加入20ml蒸馏水中，混匀，加盖后4℃冰箱保存。
& &&&（5）0.25% 胰蛋白酶- EDTA。
& &&&（6）FITC标记抗狂犬病毒核蛋白抗体：按说明书要求稀释到工作浓度。
中和用病毒的制备& &
（1）病毒悬液的制备：取CVS－11毒种（一般为冻干毒种）作适当稀释，以0.1 MOI的感染量接种生长良好的BSR细胞，37℃ 5% CO2培养1天后转入34℃继续培养，2天后收集培养上清，4℃条件下4000RPM离心10分钟去除细胞碎片，取上清液加入10％小牛血清，混匀后分装小管， -70℃以下冻存备用。
（2）病毒液的预滴定： 取冻存的毒种一支，冷水速融后在24孔培养板上从1：5开始做5倍系列稀释（100μl病毒样品加入400μl含5%灭能小牛血清的DMEM培养液中每孔，充分混匀后，然后每个稀释度取100μl转移至96孔培养板，每个稀释度平行做2份，每孔再加入5×106/ml的BSR细胞悬液50μl， 37℃ 5% CO2孵箱中培养24小时。培养结束后弃上清，PBS洗一遍，再用80％冷丙酮（每孔50μl）-30℃固定10分钟，甩干，室温干燥后每孔加入50μl工作浓度的FITC标记抗狂犬病毒核蛋白抗体染色，37℃孵育30分钟后，PBS洗3遍，每孔加50μl80％甘油于荧光显微镜下观察；计数每孔中的荧光灶数，取每孔荧光灶数在30以下的孔，记录相邻2孔荧光灶数，取其平均值，计算如下：
病毒滴度FFU/ml = （最高稀释倍数孔荧光灶平均值×5 + 相邻孔稀释倍数较低的荧光灶平均值）/2×稀释倍数较低孔病毒稀释倍数×20
（3）中和用病毒液的滴定& &方法同（3）病毒液的预滴定。在荧光显微镜下计数每孔中的荧光灶比例，选用可致80%的细胞被病毒感染而的病毒稀释度为中和试验用病毒稀释度。& && &
（4）中和用病毒的准备& & 取一支冻存的病毒，流水融化后，用5%灭能小牛血清的DMEM培养液将病毒稀释至能致按“（3）中和用病毒液的滴定”项要求可致80%细胞被感染的病毒稀释度，置冰浴备用。
& & 抗狂犬病血清标准品的制备& & 由国家药品检定机构提供，或用经国家药品检定机构认可的各生产单位工作用标准品。配制方法按使用说明书进行。
& & 供试品的制备& & 供试品预先经56℃ 30分钟灭能，用含5%灭能小牛血清的DMEM培养液将供试品作3倍系列稀释，即在96孔培养板中每孔预先加入100μl培养液，取50μl供试品加入其中，成为1：3稀释度，充分混合和后，吸取50μl加入下一孔100μl培养液中，成为1：9稀释度，如此系列稀释至第12孔。
RFFIT方法& & 取供试品及标准品各稀释度50μl 于96孔培养板中，加入中和用病毒，50μl/孔，同时设空白孔对照（只加100μl DMEM于孔中），以及中和用病毒对照孔（含5%灭能小牛血清的DMEM 50μl，加入中和用病毒50μl），混匀后置37℃中和1小时，每孔加入1×106细胞/ml 的BSR细胞悬液50μl，置37℃ 5% CO2孵箱中培养24小时。
待培养结束吸干培养液，每孔中加入100μl/ PBS清洗并吸干后，每孔加入预冷至4℃的80％丙酮50μl ，-30℃固定10分钟，弃丙酮，待挥发干燥后加入工作浓度的荧光标记抗狂犬病病毒核蛋白抗体，50μl /孔，37℃孵育30分钟，甩掉液体，用PBS洗板2～3次，甩干液体，每孔加入80％甘油50μl，荧光显微镜观察。计算公式如下：
标准品ED50 = lg (1/ 标准品低于50%荧光灶比例的稀释度) — （0.5 — 标准品低于50%荧光灶比例孔的荧光灶百分比）/ (高于50%荧光灶比例孔的荧光灶百分比 — 低于50%荧光灶比例孔的荧光灶百分比) × lg稀释倍数
& &供试品ED50 = lg (1/ 标准品低于50%荧光灶比例的稀释度) — （0.5 — 供试品低于50%荧光灶比例孔的荧光灶百分比）/ (供试品高于50%荧光灶比例孔的荧光灶百分比 — 供试品低于50%荧光灶比例孔的荧光灶百分比) × lg稀释倍数
& &供试品效价 = （标准品ED50 — 供试品ED50）的倒数×标准品的效价
& &供试品效价单位为 IU/ml。
『附注』 （1）中和用病毒滴度不得小于106 FFU/ml。
（2）病毒稀释时，应尽可能在冰浴中进行。
（3）病毒对照孔应有80%细胞被荧光着色，细胞对照孔应无荧光，试验方可成立。
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你的试剂买到了吗？我也要做这个试验，正在找标准血清，不知去哪找
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去鉴定所买，只有他们有参考血清
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这个方法在潜伏期也能检测吗？
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快速荧光灶抑制试验和小鼠中和试验检测抗狂犬病毒中和抗体的比较研究
作者单位：
武汉生物生物制品研究所,武汉,430060
母体文献：
第九次全国生物制品学术会议论文集
会议名称：
第九次全国生物制品学术会议
会议时间：
会议地点：
主办单位：
中华预防医学会,中国微生物学会
在线出版日期：
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万方数据电子出版社关于RFFIT快速荧光灶抑制试验啊(荧光,狂犬病毒) - 细胞实验 - 生物秀
标题: 关于RFFIT快速荧光灶抑制试验啊(荧光,狂犬病毒)
摘要: [关于RFFIT快速荧光灶抑制试验啊(荧光,狂犬病毒)] 相关疾病：狂犬病请问哪位做过RFFIT快速荧光灶抑制试验啊,我想知道关于这方面的一些信息,希望大家能帮帮我,我现在要做这方面的试验,但是相关资料很少,我做的是狂犬病毒
关键词:[荧光 狂犬病毒]……
请问哪位做过RFFIT快速荧光灶抑制试验啊,我想知道关于这方面的一些信息,希望大家能帮帮我,我现在要做这方面的试验,但是相关资料很少,我做的是狂犬病毒.
回复RFFIT试验时倍比稀释已经灭活的血清样品，同时设阴、阳性血清对照。病毒用标准固定毒CVS株，细胞用BHK21细胞系。首先将稀释的被检及对照血清0.1ml加入96孔板中，再在各血清孔中加入0.1 m1标准病毒稀释液（100TCID50），37℃中和1.5小时；然后每孔加入细胞，37℃、5% C02培养过夜后弃掉培养液，PBS洗一次，丙酮固定。干燥后，加荧光素标记的抗狂犬病毒抗体，37℃ 30分钟，PBS洗3次，观察结果：比较实验组和阴性组的荧光灶，实验组中能使荧光灶抑制≥50％的最高稀释倍数，即为被检血清的中和滴度。不知道对你有没有帮助？
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