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microRNA-301在胰腺癌中的表达及其临床意义
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【题　名】microRNA-301在胰腺癌中的表达及其临床意义
【作　者】陈卫群 陈和明 孔德勇 曹阳 詹熵 卢忠心
【机　构】武汉市中心医院检验科 中南大学湘雅二医院胸外科
【刊　名】《中华检验医学杂志》2010年 第1期 62-67页　共6页
【关键词】胰腺肿瘤 微小RNAs 肿瘤转移 肿瘤标记 生物学
【文　摘】目的分析miR-301在胰腺癌组织中的表达，探讨其在胰腺癌侵袭转移中的意义。方法用FQ—PCR方法从细胞水平检测5种胰腺癌细胞系（PANC-1、PaCa-2、AsPC-1、Hs．766T、BxPC-3）中miR-301的表达；进一步用免疫组织化学方法从组织水平检测胰腺癌组织芯片（含60份胰腺癌组织、10份癌旁组织和10份正常胰腺组织）中miR-301的表达；在证实miR-301高表达后，进一步研究其在胰腺癌侵袭转移中的临床意义，用100nmol／L miR-301抑制剂（anti．miR-301）或阴性对照（Anti-miR^TM Negative Control #1）处理对数生长的胰腺癌细胞系PANC-1、PaCa-2，用WB检测胰腺癌细胞系中侵袭转移相关分子COX-2、MMP-2的表达，并用Transwell技术检测胰腺癌细胞的侵袭转移能力。结果FQ—PCR检测结果显示，在5种胰腺癌细胞系PANC-1、PaCa-2、AsPC-1、Hs-766T、BxPC-3中miR-301的相对表达量分别为33．09±4．21、30．76±3．18、47．57±3．56、20．20±1．21、76．75±13．51；而正常胰腺细胞中为1．00±0．08；5种胰腺癌细胞系分别与正常胰腺细胞相比，差异有统计学意义（t值分别为8．86、9．53、6．39、6．77、11．18，P均〈0．01）。免疫组织化学结果亦显示，胰腺癌组织、癌旁组织及正常胰腺组织中miR-301的相对表达量分别为0．88±0．09、0．22±0．04、0．14±0．05；胰腺癌组织分别与癌旁组织及正常胰腺组织相比，差异有统计学意义（￡值分别为15．1、10．6，P均〈0，01）；正常胰腺组织与癌旁组织相比，差异无统计学意义（t=1．32，P：0．22）。用miR-301抑制剂抑制胰腺癌细胞系PANC—1、PaCa-2中miR-301的表达后，WB检测结果显示，侵袭转移相关分子COX-2、MMP-2的表达下调；细胞侵袭转移能力试验结果显示，miR-301抑制剂处理后跨膜转移的细胞数分别为PANC-1（587±27）个、PaCa-2（363±13）个，而阴性对照处理后跨膜转移的细胞数为：PANC-1（1091±15）个、PaCa-2（737±44）个；miR-301抑制剂处理与阴性对照处理相比，细胞侵袭转移能力亦显著下降（t值分别为7．89、7．56，P均〈0．01）。结论胰腺癌细胞系和组织中miR-301高表达；且与胰腺癌的侵袭转移密切相关，抑制miR-301的表达能够有效抑制胰腺癌细胞的侵袭转移，miR-301有望成为抗胰腺癌侵袭转移治疗的新分子靶标和胰腺癌早期诊断的新分子标志。
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本企业的产品目录KeywordsTGF-β1, NGF, Pancreatic Neoplasms, Perineural InvasionDistal pancreatectomy, Central pancreatectomy, Exocrine, Endocrine, Morbidity, Meta-analysis
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&&&&&&&&第一部分：TGF-β1对胰腺癌细胞神经转移相关因子NGF表达的影响研究目的：胰腺癌细胞具有嗜神经转移特性。神经转移是胰腺癌的独立预后指标,也是胰腺癌根治术后早期复发的原因。神经生长因子(nerve growth factor,NGF)通过自分泌和旁分泌的方式对胰腺癌细胞嗜神经转移起着重要作用,相关的机制研究较为广泛。转化生长因子β1(transforming growth factor beta1, TGF-β1)及其受体在有神经转移的胰腺癌组织中表达升高,但其对神经转移的作用机理不明。TGF-β1能够诱导神经细胞、牙髓细胞和胰腺星形细胞NGF的表达,但是对胰腺癌细胞尚未有相关的研究证据。本研究的目的是观察TGF-β1对胰腺癌细胞NGF表达的影响,探讨TGF-β1在胰腺癌细胞嗜神经转移中的作用机理。研究方法：以Panc-1、MIA PaCa-2和BxPC-3三种不同分化程度的胰腺癌细胞系作为研究对象,用重组人TGF-β1蛋白进行孵育。运用Real-time RT-PCR、Western Blot检测上述三种细胞中NGF基因的mRNA和蛋白表达量,运用双抗体夹心ELISA法检测细胞培养液中NGF的含量,比较不同TGF-β1浓度(0、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0ng/ml)和不同的孵育时间(24、48、72h)对胰腺癌细胞NGF表达的影响；再用TGF-β1中和抗体与重组人TGF-β1蛋白共同孵育胰腺癌细胞,观察和比较使用TGF-β1中和抗体前后胰腺癌细胞NGF表达量的变化,验证重组人TGF-β1蛋白对胰腺癌细胞NGF表达的影响。研究结果：TGF-β1能够上调Panc-1和MIA PaCa-2细胞系的NGF表达,但是对BxPC-3细胞系则没有影响。TGF-β1对胰腺癌细胞NGF表达量的影响存在浓度和时间依赖关系。随着TGF-β1浓度的递增,Panc-1和MIA PaCa-2细胞系的NGF表达量先升高后下降,但均高于不使用TGF-β1的对照组。随着孵育时间的延长,NGF的表达量随之上升。Panc-1和MIA PaCa-2细胞系的NGF表达量的最高值分别出现在TGF-β1终浓度为5.0ng/ml (72h)和1.0ng/ml(72h)时。TGF-β1中和抗体能够减弱TGF-β1对Panc-1和MIA PaCa-2细胞系NGF表达的上调作用。研究结论：TGF-β1可以引起胰腺癌细胞NGF过表达,但是可能有一种负性调控机制同时参与了这个过程；TGF-β1可能通过诱导NGF的过表达参与胰腺癌细胞嗜神经转移过程。第二部分：ALK5在TGF-β1诱导胰腺癌Panc-1细胞NGF表达中的作用研究目的：探讨ALK5在TGF-β1诱导胰腺癌Panc-1细胞NGF表达过程中的作用,阐明TGF-β1诱导NGF表达的机制。研究方法：应用Western Blot方法检测不同浓度的TGF-β1(0.5、1.0、5.0、10.0、50.0ng/ml)对Panc-1细胞ALK5表达的影响。设计和合成2条针对ALK5基因的siRNA,并用Real-time RT-PCR和Western Blot检测其基因抑制作用。选择基因抑制效果最佳的一条siRNA,将其转染胰腺癌Panc-1细胞。然后用TGF-β1孵育转染后的Panc-1细胞,利用Real-time RT-PCR、Western Blot检测细胞中NGF的mRNA和蛋白表达,利用双抗体夹心ELISA法检测细胞培养液中NGF的含量,比较siRNA转染前后NGF表达量的差异。利用ALK5选择性抑制剂SB431542和TGF-β1共同孵育Panc-1细胞,用ELISA检测NGF表达的变化。研究结果：Panc-1细胞的ALK5蛋白表达随着TGF-β1浓度的增高而显著增高(P&0.05)。成功合成两条针对ALK5基因的siRNA, Real-time RT-PCR和Western Blot检测表明两者均有抑制ALK5基因表达的作用,其基因抑制率分别为70.92%和42.70%。在TGF-β1蛋白孵育下,经ALK5siRNA转染的Panc-1细胞,其NGF表达量显著高于未转染的细胞(P&0.05)。SB431542和TGF-β1共同孵育的Panc-1细胞NGF表达量高于单独使用TGF-β1的细胞(P&0.05)。研究结论：ALK5在TGF-β1诱导Panc-1细胞表达NGF的过程中起着负性调控作用。
&&&&Part1:The influence of TGF-β1on NGF expression in the pancreatic cancer cellsAims:The overexpression of NGF was related to the development of pancreatic cancer, especially perineural invasion. TGF-β1was reported to induce NGF expression in the nerve cells, dental pulp cells and pancreatic stellate cells. However, there was no literature about the relation between TGF-β1and NGF in pancreatic cancer cells. This study aims to reveal the effect of TGF-β1on the expression of NGF in the pancreatic cancer cells.Methods:Pancreatic cancer cell lines Panc-1, MIA PaCa-2and BxPC-3were respectively incubated with the recombined human TGF-β1protein at different concentrations (0,0.5,1.0,5.0,10.0and50.0ng/ml) and over various periods of time (24,48and72h) in serum-free Medium. Real-time RT-PCR, ELISA and Western Blot were used to evaluate the expression level of NGF in the three cell lines. The pancreatic cancer cells were then co-incubated with TGF-β1and its neutralizing antibody. The assessment of the change of the NGF level was used to prove the influence of TGF-β1on the NGF expression.Results:The NGF expression was upregulated in Panc-1and MIA PaCa-2cell lines by TGF-β1. However, it could not influence the NGF expression in BxPC-3cell line. The results showed that with the TGF-β1concentration increasing, the expression of NGF increased firstly and then decreased in these two cell lines. When the TGF-β1concentration was5.0ng/ml (Panc-1) and1.0ng/ml (MIA PaCa-2), the NGF reached the top expression level respectively after72h. Time was a positive regulator to the expression of NGF. The level of NGF in the two cell lines increased as the time passing. The neutralizing antibody decreased the expression level of NGF when co-incubating with TGF-β1.Conclusions:TGF-β1was one cause for the NGF overexpression in the pancreatic cancer cells, but a negative factor might also take a part in this mechanism at the same time. NGF might mediate the influence of TGF-β1on perineural invasion of pancreatic cancer cells. Part2:The role of ALK5in the expression of NGF induced by TGF-β1in pancreatic Panc-1cellsAims:to reveal the role of ALK5in the TGF-β1inducing expression of NGF in the Panc-1cell line.Methods:The ALK5expression level was detected by Western Blot in Panc-1cell line which was incubated with TGF-β1. The specific siRNA oligos for ALK5gene were designed and synthesized. Then we chose the most effective one on knockdown of the target gene via real-time RT-PCR and Western Blot. The recombined human TGF-β1was used to culture the siRNA transfected Panc-1cells, and then Real-time RT-PCR, ELISA and Western Blot were used to evaluate the NGF expression level. SB431542and TGF-β1were co-incubated with the Panc-1cells, and then the NGF expression level was detected by ELISA.Results:The ALK5expression level increased when the TGF-β1was used to treat the Panc-1cells (P&0.05). Two anti-ALK5siRNAs were successfully synthesized and the effects of knockdown on the ALK5gene were70.92%and42.70%respectively. The inducing expression of NGF by TGF-β1in Panc-1cells was enhanced by anti-siRNA and SB431542(P&0.05).Conlusions:ALK5negatively regulated the expression of NGF in Panc-1cell line induced by TGF-β1.Methods:A systematic literature research was performed to identify comparative studies on CP and DP. Perioperative and long-term outcomes constituted the end points. Pooled risk ratios (RR) and weighted mean differences (WMD) with95%confidence intervals (95%CI) were calculated using either fixed-effects or random-effects model.Results:Nine studies with735patients were included in this meta-analysis. Although CP cost more operative time than DP, the two groups had no significant differences in the volume of intraoperative blood loss, rate of intraoperative blood transfusion and length of postoperative hospital stay. According to the postoperative outcomes, although the CP group had higher overall complication rate (F RR:1.30;95%CI:1.05-1.62; P&0.05) as well as overall pancreatic fistula rate (F RR:1.58;95%CI:1.20-2.08; P&0.05), the two groups did not differ significantly in the fateful surgical complications such as clinically significant pancreatic fistula (Grade B and C), postoperative bleeding, reoperation and intra-abdominal effusion/abscess. Furthermore, the perioperative mortality rate was comparable between the two groups. During the follow-up period, the patients after DP were more likely to suffer pancreatic exocrine insufficiency (F RR:0.53;95%CI:0.32-0.86; P&0.05) and endocrine impairment (F RR:0.19;95%CI:0.11-0.33; P&0.05).Conclusion:CP is an acceptable and feasible procedure, and it has the advantage of preserving the pancreatic exocrine and endocrine function.
&&&&&&&&胰腺癌嗜神经转移的机制研究：TGF-β1/ALK5信号通路对NGF表达的影响致谢5-6中文摘要6-9Abstract9-12缩略词表13-15目录15-17第一部分 TGF-B1对胰腺癌细胞神经转移相关因子NGF表达的影响17-46&&&&1 前言17-18&&&&2 实验材料和主要仪器18-19&&&&3 实验方法19-30&&&&4 结果30-38&&&&5 讨论38-41&&&&6 结论41-42&&&&参考文献42-46第二部分 ALK5在TGF-B1诱导胰腺癌PANC-1细胞NGF表达中的作用46-69&&&&1 前言46-47&&&&2 实验材料和主要仪器47-48&&&&3 实验方法48-54&&&&4 结果54-61&&&&5 讨论61-64&&&&6 结论64-65&&&&参考文献65-69综述一69-84&&&&参考文献78-84综述二84-106&&&&参考文献101-106附录一106-108附录二108-118个人简历118
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黄芩素对人胰腺癌PANC-1细胞增殖和运动能力的影响
【摘要】：目的:探讨黄芩素对人胰腺癌PANC-1细胞增殖、运动能力的影响及其机制。方法:体外培养人胰腺癌PANC-1细胞,运用MTT法、划痕愈合实验(Wound healing assay)、扫描电镜和Transwell实验等方法,观察黄芩素对人胰腺癌PANC-1细胞增殖、伪足形成、侵袭和迁移能力的影响,并运用Western印迹分析、RT-PCR检测黄芩素干预后肿瘤细胞Ezrin蛋白、磷酸化Ezrin蛋白及Ezrin mRNA表达的变化。结果:黄芩素呈时间和剂量依赖性抑制PANC-1细胞增殖,使肿瘤细胞伪足形成显著减少,细胞的运动侵袭能力下降。Western印迹分析和RT-PCR结果显示,黄芩素明显下调Ezrin-mRNA和Ezrin蛋白表达及其磷酸化活化。结论:黄芩素抑制肿瘤细胞恶性增殖及运动侵袭能力,可能与其抑制肿瘤细胞Ezrin表达及活化有关。
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