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淘豆网网友近日为您收集整理了关于HPV16 E6E7基因的优化重组与去致癌性分析的文档，希望对您的工作和学习有所帮助。以下是文档介绍：HPV16 E6E7基因的优化重组与去致癌性分析 北京工业大学硕士学位论文HPV16 E6E7基因的优化重组与去致癌性研究姓名:谢强申请学位级别:硕士专业:生物物理学指导教师:曾毅摘要摘要宫颈癌是世界范围内女性癌症死因的第二大因素。几乎所有的宫颈癌症都与高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPⅥ感染有关,其中HPVl6和HPVl8与宫颈癌相关的最为密切(大约占总数的50%)。据统计,全世界每年约有5l万新发的富颈癌病例,其中80%的病例发生在发展中国家。我国每年仍有新发病例约13万个,占世界宫颈癌新发病例总数的28.8%。虽然通过HPV检测可提高宫颈癌前病变筛查的敏感性,但并不能消除HPVl6。的感染,在不发达国家尚难普及。目前临床上对早期宫颈癌的治疗技术条件要求相对较高,并且不能防止HPVl6再感染的可能,而对中晚期宫颈癌的治疗则尚无良策。因此研制针对HPVl6的治疗性疫苗对宫颈癌的治疗将具有十分重要的意义。HPVl6的E6和E7蛋白是导致HPVl6相关宫颈癌产生的首要因素。E6蛋白可以结合和降解p53蛋白,破坏正常的细胞周期调控;E7蛋白则(来源：淘豆网[/p-7964132.html])通过与过磷酸化的pRb结合而使pRb丧失抑癌活性。E6蛋白和E7蛋白的作用导致细胞恶性增殖,最终发展为宫颈癌。由于E6和E7在大多数宫颈癌及癌前病变中可以持续表达,而在正常组织中并不存在,因此这两弹蛋白可以作为发展HPV相关宫颈癌及癌前病变治疗性疫苗的理想靶抗原。本研究参照人类基因中的优势密码子,运用分子生物学技术对HPVl6 E6基因和E7基因进行全基因密码子优化合成,提高其在哺乳动物细胞中的表达:同时对E6基因和E7基因迸行定点突变和融合,以消除其致癌性,并加强E6蛋白和E7蛋白的免疫原性。实验表明构建的优化重组HPVl6 E6E7基因在293T细胞和NIH3T3细胞中的表达得到了极为显著的提高.含有优化重组基因的NIH3T3细胞不能在软琼腊中形成集落,并且不能对SCID小鼠致癌,表明构建的优化重组基因是安全的。本课题中构建的重组优化HPVl6 E6E7基因不仅失去了对Nm 3T3细胞的转化活性和对SCID小鼠的致瘤作用,同时保持了很好的稳定性和抗原性。实验中构建的重组pVR载体包含有重组(来源：淘豆网[/p-7964132.html])优化HPVl6 E6E7基因,将作为HPVl6相关肿瘤治疗性疫苗进行下一步的研究。关键词人乳头瘤病毒;E6E7:基因优化;治疗性疫苗;安全性ABSTRACTCervical cancel&is the second leading cause of cancer deaths in womenworldwide.、“tll about virtually all cervical cancB=rs arc attributable to infection with avirus belonging to the hi曲一risk subset of human papillomav_irus(riPV)types,withwhich卸PVl6 being the most frequent cancer-associated type(about 50%).Statisticsindicated that there are about 510,000 now cases of c(来源：淘豆网[/p-7964132.html])ervical cancer worldwide,ofwhich 80%OQ:1.1r in the developing countries.In China’there age still approximately130,000 new∞s器of cervical callCeT every year,Which occupied 28.8%of the totalnumber in the world.Though the HPV aH哪血adon啪increase the sensitivity ofdetection in fi'ont ofcervical cancel',it can't eliminate the inf∞-tion ofHPVl6 and stillis difficult topopularize in the developing countries.At present the R-eatmentengineering fact(来源：淘豆网[/p-7964132.html])or requested on clinical trial of cervical cancer in early stage isrelative high and锄、prevent HPVl6 to infect again possibly.There is still nO goodcountermeasure ell clinical trial of cervical caneaf in mid and late stage.Therefore todevelop thcrap刚c ines targeted for HPVl6 has the extremely vital significanceto e.cmcal cancer treatment.HPVl6 E6。and E7 proteins play a major role in the dcvdopmmt ofthe cervicalc衄oef.The E6 protein啪bind and degradatio(来源：淘豆网[/p-7964132.html])n the p53 and destroy the normal∞nRol ofthe ceil cycle while the E7 protein啪bind the pRb protein and hence thepRb lost it ability a3 m anti-on∞gene.The effects of the E6 and E7 proteins lead thecells to profifcrate maligⅡ缸ny and result in cervical cancel Since E6 and E7 areconsistently expressed in most cervical cancer's and their pr∞msor lesions but absentfrom normal tissues,these viral oncoprotcil坞而pI龇t promising taggets for thedcvdopment of a(来源：淘豆网[/p-7964132.html])ntigen-specific出a珥'ines for HPV-associated cervicalcall簖and precursor lesions.In this research,the superior ic coden of human gene wcfe referred tooptimize and synthesize the full HPVl6 E6 and E7 using the molecular biologytechnology to enh棚l∞the gene's cxpreasion in the Ⅱ.Meanwhilesite-diroeted mutageneses Wel&O introduced to eliminate the carcinogenicity of the E6and E7 genes and the genes w聃fused to enhenc宅the immunogenicity ofthe E6(来源：淘豆网[/p-7964132.html]) andE7 proteins.11话experiment indicated thaf the expression of the optimized binated ttPVl6 E6E7 genes in 293T cells and NIN 3T3 cells obtained theextremely remarkable enhancement.ne NII-I 3&1&3 cells containing optimized binated HPVl6 E6E7 genes can't form colony in the soft-agag and can’t formtumor in SCID mice,which indicate that the optimized and binated genes aresafe.1he optimized and binated HPVl6 E6E7 genes constructed in thisRe(来源：淘豆网[/p-7964132.html])search topic not only 10se their transformation capability into NIH 3T3 cell andtumorigenicity in SCID mice,but also maintain the very googd stability and北京工业大学理学硕士学位论文II IIEEg!E=!=___E目!!|!!目!!!!!s=EE!!!!!自!!!!!!!!!!自___I_!!g目!g目E!自lantigenieity.The binated plasmids pVR containing the optimized binated HPVl6 E6E7 genes which Were constructed in this research can beundergoing the further research勰therapeutic ines for HPVl6.associated tBnlor.Keywords(来源：淘豆网[/p-7964132.html]) HPV 16;E6E7;safety.Ⅳ.英文缩写词英文缩写词英文Adeno-associated virusAdenoviruBase pairOuster plementaxy DNACytotoxic T lymphocyteChimeric virus like particlesDialniilo o's Modified Eagle MediumEoxynucleoside biphosphateFluorescdn isothiocyanateHuman Papillomav/resHuman I'al蛐omavires type 16Immunofluorescmce assayInveOed terminal repeatKilobasesKilODaltonsLuria-BeftamiMajor plexMessenger RNAOtical densityPolyAcrylamide G(来源：淘豆网[/p-7964132.html])el ElectrophoresisPosphate buffered salinoPlymerase chain.reaCtionRetinoblastoma proteinRverse.'amcript PCRSdium dodecyl sulfateVh-us-like o氏改良Eagle氏培养基三磷酸脱氧核苷异硫***酸荧光素人乳头瘤病毒16型人乳头瘤病毒免疫荧光试验反向末端重复序列千碱基千道尔顿溶菌肉汤主要组织相容性复合体信使RNA光密度聚丙烯酰氨凝胶电泳磷酸缓冲液多聚酶链式反应视网膜母细胞瘤蛋白逆转录PCR十二烷基磺酸钠病毒样颗一删槲碲∞一m一啪一一一肿一一姒:瓜.一一一Ⅱ一一∞~l曼腿鼬一哪m独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得北京工业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。签名:玛}iL 日期:伽·7辱olr,I关于论文使用授权的说明本人完全了解北京工业大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权保留送交论文的复印件,允许论文被查阅和借阅;学校可以公布论文的全部或部分内容,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文.(保密的论文在解密后应遵守此规定)签名:i簪孤导师签名: 日期:和·7当,JI}日第1章绪论1.1研究背景第1章绪论人乳头瘤病毒(Human Papillomavires.HPV)是一类具有严格宿主范围和组织特异性的DNA病毒,主要感染人的皮肤或粘膜上皮细胞,引起感染部位发生良性和恶性病变。根据DNA序列的同源性、不同的宿主范围和组织特异性等可分为许多型别。目前发现的人乳头瘤病毒已经超过100型ul,其中感染人生殖道的人乳头瘤病毒有35个型别。根据其致瘤性不同HPV分为低危型和高危型两大类,其中高危型HPV的感染与宫颈癌的发生有十分密切的关系。Hal.Ison等于1974年首次提出人乳头瘤病毒田PⅥ感染与宫颈癌有密切关系12】,Durst在1983年首次发现在HPVl6[3】。随着对HPV研究的深入,发现大约80%的宫颈癌与四个型别的HPV感染有关。分别是HPVl6、18、31和45型,其中50%的宫颈癌与HPVl6感染有关【l】.据统计,全世界每年约有5l万新发的宫颈癌病例,其中80%的病例发生在发展中国家.我国每年仍有新发病例约13.15万个,占世界宫颈癌新发病饲总数的28.8%.全世界每年有20多万妇女死于宫颈癌。宫颈癌占全世界妇女癌症死亡率的第二位,在某些发展中国家甚至位居首位【.】.虽然通HPV检测可提高宫颈癌前病变筛查的敏感性,检出率可达到85%~95蚶矾,但并不能消除-HPVl6的感染,在不发达国家尚难普及.目前临床上普通应用的手术治疗、放疗和化疗等方法对早期宫颈癌的治愈率已达90%以上,但治疗中创伤性大,不能防止I口v16再感染的可能,并且技术条件要求相对较高,不宜在落后地区和发展中国家推广应用,而对中晚期宫颈癌的治疗则尚无良策。因此研制针对HPVl6的治疗性疫苗对预防HPV感染和富颈癌的治疗将具有十分重要的意义。1.2 HPVl6的生物学研究1.2.1 HPVl6的病毒学研究HPVl6属于乳多空病毒&私kPapovaviridae)的乳头瘤病毒属,是一种嗜上皮细胞的DNA病毒,病毒外壳呈二十面体,由72个子粒组成,直径约为55枷nm,无包膜。电镜下病毒颗粒的大小、形态与口多瘤病毒极为相似.其基因组是双链环状DNA分子,长度为7904bp。根据功能不同,基因组可分为三个区,即早期蛋白编码区(E矾y Region,ER)、晚期蛋白编码区(Late Region,LR)和长末端控制区(Long Control Region,LCR),其中长末端控制区又称上游调节区(Upsueam Regulatory Region,UI汛)或非编码区(Non Coding Region,NCR)。北京工业大学理学硕士学位论文长末端控制区位于E6基因的上游,约1,000bp,控制所有ORF的转录¨】。早期区编码调控蛋白,晚期区编码病毒结构蛋白。早期区编码六个蛋白,即El、E2、E4、E5、E6和E7蛋白。El编码至少两种蛋白,对病毒基因组的稳定和复制有重要作用。E2编码与LCR相互作用的活化和抑制因子,调控病毒mRNA的合成,尤其是调控E6与E7启动子的合成。E4编码蛋白结合并破坏细胞骨架,与病毒的成熟有关。E5编码一些膜蛋白,包括生长因子受体,通过MAPK途径传导信号,可刺激E6和E7蛋白的表达fl 06]。然而当病毒与细胞基因重组后,E5常不表达,因此E5的致癌作用存在争议。E6和E7蛋白对刺激细胞生长是最重要的,可使宿主细胞永生化并进一步发生恶性转化【Ⅲ.晚期基因Ll和L2分别缘码病毒的主要和次要衣壳蛋白(如图1.1所示)。t坏Ju囊.●—一生长周囊囊膏组肇与鼍t图1.1 HFVl6基因组结构及功能Fig.1一l The Uructure and function ofHPVl6 g∞.ome翻HPVl6的感染具有严格的嗜表皮性,它们的复制依赖于表皮细胞的分化状况。HPVl6仅在分化至一定程度的上皮细胞内方能进行增殖,在基底层细胞内呈隐性感染状态。一般认为,HPVl6最先感染基底层细胞,随着基底层细胞向表皮细胞的分化,依次进行早期蛋白的表达、DNA复制和晚期蛋白的表达以及病毒颗粒的装配。对HPV进入细胞的方式迄今为止所知甚少。初步研究表明,HPVl6的外壳蛋白L1和L2可与靶细胞表面的受体分子相互作用,加速病毒第l章绪论DNA进入靶细胞【”。目前科B6整合素已被确认为HPV的候选受体【81。病毒进入基底层细胞后开始转录和表达立即早期蛋白El、E2和E5。E1和E2皆为DNA结合蛋白,并以附加体形式存在。El蛋白通过与病毒早期转录启动子相互作用对病毒蛋白的表达进行正调控和负调控。随着细胞分化至内棘层,E6和E7被表达,这两个蛋白通过激活宿主细胞的DNA合成,促进宿主细胞的增殖,为病毒DNA的复制创造适宜的细胞内环境。病毒DNA的复制可持续到细胞分化至外棘层,随后晚期蛋白Ll,L2得以表达,病毒开始组装。虽然E4基因位于早期区,但FA蛋白的表达仅限于外棘层细胞,是晚期蛋白,它可与细胞骨架结合,并促进细胞的裂解,最后成熟的病毒颗粒从脱落的上皮细胞中释放出来。1.2.2 RPVl6的致瘤作用在良性HPV感染病灶中,病毒DNA游离于细胞染色体之外。而在大多数I-IPV相关肿瘤中,HPV DNA则整合于宿主细胞染色体中【I】.病毒DNA整合进入染色体上的位点是随机的,而对于病毒DNA却常常位于E1,E2区。由于E2的断裂,失去了对E6和E7表达的调控作用,使得E6和E7过量表达。当病毒DNA整合后,就不再有病毒颗粒的产生.I-IPVl6的E6和E7蛋白可以破坏细胞周期的调控,使细胞提前从Gl期进入S期。细胞周期的调控由周期蛋白(Cydins)及其周期蛋白依赖的蛋白激酶tcD】陋)控制p1¨.CydinD在G1期的中期被活化,调节Gl期的进型121。在正常情况下,Cyclin D/CDK4复合体使Rb蛋白磷酸化。磷酸化的pRb可结合并灭活E2F转录因子,使细胞周期阻制在G1/S期。磷酸化的pRb放出的E2F,可转录DNA复制必需的几个基因。E2F直接促进二氢叶酸还原酶、DNA聚合酶a和胸昔激酶的作用,间接促进C-myc、N-myc和Cyclin D的表达,并导致细胞进入S期112,131。E7蛋白通过与过磷酸化的pRb结合,并释放出E2F,从而使pRb丧失抑癌活性【14,15】。E7促进细胞增殖的另外一条途径在近期也被发现【161。E7的锌指结构可与Mi2p,而Mi2p是一个新发现的核小体再修饰与乙酰酶复合体的组分之一。由于E7与这一复合体的结合,抑制了组蛋白的去乙酰化,从而可促进细胞的增殖。。·HPVl6的E6蛋白可通过多种途径引起细胞转化【l_日,其中灭活抑癌蛋白p53是最重要的途径之一f14】。当细胞DNA受到损伤时,p53可使细胞滞留在G1期,以利于DNA的修复。p53通过诱导CDK抑制因子p21婶1的产生而介导细胞的Gl期阻滞。p2l通过其N端与CyclinD/CDK4复合体结合,从而抑制了CDK4与pRb底物结合。E6蛋白通过E6.AP(一个泛素蛋白连接酶)与p53结合,引起p53的快速降解。E7通过结合并灭活p21和CDK抑制因子p27“P‘对E6的活性具有放大作用(如图1.2所示)。北京工业大学理学硕士学位论文/’、细量泛囊连接_图1.2 HPVl6 E6E7的致癌机理Fi鲁l-2 The carcinogenicⅡlechani妯ofHPVl6 E6E7白HPVl6 E6和E7蛋白单独或共同作用均可使多种人源细胞永生化【18侧.I-IPVl6研究表明E6和E7在致癌过程中发挥的作用有所不同:E7蛋白促进良性肿瘤的形成,酯蛋白则从根本上加速这些良性肿瘤向恶性肿瘤转变,并且在此过程中二者表现出一种协同作用瞄】。HPVl6E5蛋白也是一个具有转化能力的蛋白。E5蛋白定位于高尔基体、内质网和核膜上闭,可作用于多种信号传号途径,影响细胞间信号的正常传导及细胞周期的正常进行f2”,并且可以通过加强MAP激酶的激活作用来增强细胞对生长分化因子的反应,加速细胞恶性化[28J。E5蛋白通过结合MHC-1分子的重链而使MHC-1分子滞留于高尔基体而不能到达细胞膜,从而干扰病毒抗原的递里,使HPVl6感染的细胞能够躲避CTL和NK细胞的免疫清除129,30】,是HPVl6建立持续性感染的重要因素之一.虽然I-II'V的DNA整合入某些有分裂能力的细胞会引起细胞永生化,但是仅有}mv的感染并不足以引起细胞的完全恶性转化【H】。尽管不少实验观察到HPV永生化的细胞在经过长期培养后可以转变为恶性生长,但仍有一些其他因素在细胞转化中有重要作用。这些因素包括:1)遗传变异的进一步积累,2)病毒基因表达的改变,3)对宿主免疫监视系统的逃避(如图1.3所示)。播放器加载中，请稍候...
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