以改进的布氏菌全血平板凝集抗原检测自然感染布病阳性绵羊的凝集素滴度--《甘肃农业大学学报》1992年01期
以改进的布氏菌全血平板凝集抗原检测自然感染布病阳性绵羊的凝集素滴度
【摘要】：报道了以改进的布氏菌全血平板凝集抗原与标准布氏菌试管凝集试验和玻板凝集试验对照,对10只自然感染布病阳性绵羊在集中舍饲的条件下,经17个月凝集素滴度的检测,证明全血抗原的特异性、敏感性及阳性检出率均优于对照方法。
【作者单位】：
【关键词】：
【分类号】：S852. 614【正文快照】：
诊断布氏菌病的方法甚多,在血清学方法中,国内仍以凝集试验为主。根据资料tl,2〕,这种方法对处于急性期布氏菌病最为敏感,对转入慢性阶段的布氏菌病,山于血清中小分子I:G出现和半抗体的产生,血清凝集试验常表现低滴度凝集或阴性反应,不能正确反映病畜的实际。我组研制的布氏
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京公网安备74号养羊4个月 患上“布病”
近日，家住徐庄镇祁沟村的一名男子突然出现发烧不退的症状，被诊断为“布病”。这种病由羊传染人，他怎么会得这样的病？ 原来，患病男子叫郭栓紧，今年63岁，2013年8月经某养殖场李某介绍，来到大金店三里庄的一处养殖场养羊。工作四个月后，郭栓紧出现发烧、关节疼痛、浑身无力的现象。去防疫站检查，医生最终确诊他患上了“布鲁氏菌病”。据悉，此病是由布鲁氏菌引起的人畜共患性全身传染病，多见于农村养羊户。 登封市卫生防疫站李医生说，怀疑自己得了布病，可以到登封市卫生防疫站进行确诊，对确诊的布病患者，主要应用抗生素疗法，21天为一个疗程，可重复1~2个疗程，一般疗程间隔5~7天。 本报提醒，布病是乙类急性传染病，养殖和屠宰人员、兽医和皮毛加工者等重点人群在生产加工过程中需注意防护，可戴口罩、手套等防护用品。要注意个人卫生，饭前勤洗手，不食生拌或未经煮熟的肉类。淘汰疫畜、隔离疫畜、培养健康畜以及进行畜群免疫接种等是预防布病的重要措施。 登封播报 胡建邦 刘弋楚獸醫科技資訊網：參考手冊\家畜禽疾病診斷參考手冊\乙類疾病\羊布氏桿菌病
羊布氏桿菌病Caprine and ovine brucellosis(excludingB. ovis)
詳細內容：
綿羊布氏桿菌
綿羊布氏桿菌(Brucella ovis)引起綿羊臨床或次臨床症狀的疾病，其特徵是公羊生殖道的病變及母羊的胎盤炎(placentitis)。這疾病的後果主要是減低公羊的生育力、母羊的非習慣性流產和增加仔羊出生前後的死亡率。本病發生於澳洲、紐西蘭、斯洛法克共和國、法國、德國、匈牙利、羅馬尼亞、俄國、西班牙、加拿大、美國、墨西哥、阿根延、巴西、智利、祕魯、烏拉圭和南非等，但事實上所有飼養羊的國家都可能有此疾病。
病原菌的鑑別：由公羊的臨床病灶(單側性或有時是雙側性的副睪炎)可間接地證明本感染的存在，但是確診必須藉由實驗室。實驗室的檢驗可以用直接或是間接的方法。直接的檢驗是由公羊的精液或組織及母羊的陰道分泌物和乳液以適當的選擇培養基分離病原菌（B. ovis）。但一般的例行診斷還是比較喜歡用間接的血清學試驗方法。間接之診斷則以血清學試驗作定期之檢驗
血清學的試驗：以綿羊布氏桿菌之水溶性表面抗原(soluble surface antigens)可做膠內免疫擴散反應(AGID)、補體結合試驗(CF)和酵素結合免疫吸附試驗(ELISA)。膠內免疫擴散反應和酵素結合免疫吸附試驗之敏感性很相近，有時甚至比補體結合試驗具敏感性還要高。併用膠內免疫擴散反應和酵素結合免疫吸附試驗可以得到最好的結果。但是考慮到操作上的簡便和成本，在開發中國家還是以膠內免疫擴散反應最受歡迎。但在國際貿易上還是以補體結合試驗為要求。
疫苗和診斷用生物製劑之必備條件：做為抗原或製造疫苗的種病毒必須來自國際認可的實驗機構。用地中海熱布氏桿菌(B. melitensis)Rev. 1活毒疫苗一劑量(109菌落形成單位)，經皮下或結膜接種，可以有效地預防公羊感染綿羊布氏桿菌。這疫苗必須符合最低的品質要求標準：適當的濃度、沒有分解和適當的殘留毒性及免疫力等(參考第3.3.2章羊和綿羊布氏桿菌[不包括綿羊布氏桿菌感染])。
補體結合試驗、膠內免疫擴散試驗或酵素結合免疫吸附試驗，最適合使用的抗原是，綿羊布氏桿菌熱生理鹽水萃取的抗原。
A. 診 斷 技 術
綿羊布氏桿菌會導致綿羊之生殖道感染，造成副睪炎(epididymitis)、非習慣性流產和仔羊的死亡率上升。經由母羊交配而造成的被動傳染是常見的感染方式，但是公羊和公羊之間的傳染也是經常發生(2)。感染的母羊會經由生殖道的分泌物和乳液排出綿羊布氏桿菌，另外也會由母羊或哺乳的母羊經機械的方式感染仔羊。
在特定羊群中，用觸診公羊的睪丸之方式，可以發現生殖器官的病變(單側或偶而會有的雙側性睪丸炎)。但由於祗有50%感染綿羊布氏桿菌的公羊出現睪丸炎(2)，所以用臨床的診斷方法並不可靠。而且很多其它的細菌也會引起臨床上的睪丸炎症狀，更增加它診斷上的不確定性。最常造成公羊睪丸炎的病原菌包括羊放射桿菌(Actinobacillus seminis)、顆粒放射病桿菌(A. actinomycetem-comitans)、綿羊嗜組織菌（Histophilus ovis）、嗜血桿菌（Haemophilus SPP）、綿羊假性結核棒狀桿菌(Corynebacterium pseudotuberculosis ovis)、地中海熱布氏桿菌(B. melitensis)和鸚鵡披衣菌(Chlamydia psittaci)(4，5，8，10，11，18，22，24)。 雖然乳牛、山羊和鹿等可以人工感染綿羊布氏桿菌，但是它們至今還沒有自然感染的病例。另外，也沒有人類的感染病例，所以它們被認為不是人畜共同傳染病(nonzoonotic)。但是在有些地區，地中海熱布氏桿菌會和綿羊布氏桿菌共同存在，所以在輸送樣本到實驗室時仍必須用不滲漏的容器。
1. 病原菌的鑑別
樣本的採集
最適合分離綿羊布氏桿菌的樣本是，從活體中採集的精液、陰道拭物和乳液。採集精液的方法是，用電剌激射精之後，以綿花棒拭下包皮內的精液。假如沒有電擊剌激射精的設備時，在母羊沒有感染布氏桿菌的情況下，可以在自然配種之後，立即從陰道中採集公羊的精液。但為避免污染，最好的方式是，直接由陰莖射入滅菌瓶子裡的精液。
死後最適合分離細菌用的器官，依順序是副睪、精囊以及公羊的壺腹和鼠蹊淋巴結或是母羊的子宮、腸骨和乳房淋巴結。但是為了做更明確的診斷，最好包括其它的器官和淋巴結(脾、頭顱、肩胛、前股骨和睪丸的淋巴結)。死亡的仔羊和胚胎也應該一併檢查。流產或死產的仔羊最適合採樣的部位是皺胃的內容物和肺臟。
採集到的樣本應用冰保存並且立刻送往實驗室。細菌在室溫下72小時內可以保持活力，如果置於4℃下可以保存更久，最好是將組織樣本冷凍。
被感染動物的精子或陰道抹片可以用Stamp's方法染色來觀察這球桿菌(coccobacilli)的特性(23)。檢查動物的Stamp染色抹片(公羊的生殖道、鼠蹊淋巴結、胎盤和胚胎的皺胃內容物或肺)可以先對這疾病做假設性的診斷。
但是許多其它有相同形態或染色特性的細菌(地中海熱布氏桿菌、伯氏柯克斯氏體[Coxiella burnetii]和披衣菌[Chlamydia spp.])可能也會出現在樣本裡，而造成判別上很大的困擾，所以顯微鏡觀察後之結果必須再用培養的方法來做確認。
直接診斷最好的辦法就是用適當的培養基分離出病原菌。可以將所採得的精液、陰道拭物或乳液之樣本直接接種於適合的培養基在37℃10%的二氧化碳下培養。組織在培養之前必須先泡軟，再以少量滅菌生理鹽水或磷緩衝液（PBS），於乳化器中磨碎乳化。
一般在三天後開始生長，但在培養時必須觀察至8 ~ 10天後，如果仍沒有生長才能將之丟棄。培養後3 ~ 5天，可以看到綿羊布氏桿菌的菌落(0.5 ~ 2.5毫米)，它呈粗糙、圓、閃爍和凸圓狀。
綿羊布氏桿菌可以培養在非選擇性培養基，如加以10%滅菌的綿羊或牛血清或5 ~ 10%滅菌綿羊血液的血液瓊脂培養基。但是培養基裡常會有來自樣本的其它細菌，並且它的生長常會超過綿羊布氏桿菌。因此，一般的培養基在本菌的分離上並不符合實際，所以較適合用選擇性培養基。有許多選擇性的培養基可供使用，這裡推薦的是Brown等人(3)所改良的方法(12)介紹如下：
培養基每公升所含的基本成份有：GC培養基底(38公克)、血紅素(10公克)、抗生素包括：梵谷黴素(vancomycin)(3毫克)、粘菌素(colistin)(7.5公克)、耐絲菌素(nystatin)(100000國際單位 = 17.7毫克)、環己亞醯胺(cycloheximide)(100毫克)和硝基夫喃(nitrofurantoin)(10毫克)。所需配備溶液如下：
溶液A：GC培養基底加入500毫升的蒸餾水，緩緩加熱並攪拌使之溶解後再用120℃高壓鍋滅菌20分鐘。
溶液B：用500毫升蒸餾水將血紅素配成懸浮液，蒸餾水應慢慢加入以防結塊。溶解後放入攪拌磁棒並用120℃高壓鍋滅菌20分鐘。
抗生素溶液(每天備好)：梵谷黴素、環己亞醯胺和粘菌素各別配成含1毫升滅菌蒸餾水的懸浮液。耐絲菌素用1毫升的甲醇配成懸浮液，硝基夫喃則用1毫升的 0.1 M 氫氧化鈉滅菌溶液(通過0.22μm過濾器過濾)配成懸浮液。在經過高壓鍋滅菌之後，將以上A和B溶液溫度穩定控制在45 ~ 50℃之間，並在繼續攪拌下將A溶液緩緩加入B溶液之內，避免產生氣泡。最後在攪拌下加入抗生素溶液，並分裝到滅菌的玻璃皿內。
為了避免污染瓊脂的最後濃度(1.2%)可以加入Bacto瓊脂使其增加到2 ~ 3%。製備後，分裝於玻璃皿之培養基應儘快使用，不可放置太久。此種培養基也可以用來培養地中海熱布氏桿菌。
另外一種可以使用但效果較差的抗生素組合是：梵谷黴素(3毫克/公升)、粘菌素(7.5毫克/公升)、耐絲菌素(12,500國際單位/公升)和硝基夫喃(10毫克/公升)。這抗生素溶液可以加入含 7% 羊紅血球或 1% （W/V）血紅素的瓊脂培養基，如 GC 培養基。
鑑別和分類
綿羊布氏桿菌的菌落不會溶血。菌落呈圓、凸圓狀並有完整的邊緣，從斜的角度看時它們屬於不光滑型，並且用ㄚ啶黃試驗(acriflavine test)時呈陽性反應(1，7)。綿羊布氏桿菌缺乏尿素酵素的活性(urease activity)，無法使硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，過氧化氫酵素(catalase)呈陽性反應和氧化酵素(oxidase)呈陰性反應，不會產生H2S，雖然它們無法生長在甲基紫(methyl violet)但可以生長在標準濃度的鹼性複紅(basic fuchsin)和勞氏紫(thionin)。在例行測試濃度(RTD)下，或是104RTD下，它們不會被Tb, Wb和Iz群的布氏桿菌噬菌體(Brucella-phages)所溶解，但它們會被R/C噬菌體所溶解(1，7)。大部份的實驗室都無法有全套鑑別的設備，所以一部份診斷必須建立在假設性的鑑別上。大部份綿羊布氏桿菌可以根據它們的生長特性、斜折射光射直接觀察、格蘭氏或Stamp's氏的染色、過氧化氫酵素、氧化酵素、尿素酵素和ㄚ啶黃試驗(acriflavine test)等加以確認。但是不管如何，它的確診還是要由有經驗的實驗室人員對布氏桿菌做正確的鑑別和分類。
2. 血清學試驗
最有效率和最被廣泛應用的試驗是雙膠內免疫擴散反應(AGID)、補體結合試驗(CF)和間接酵素結合免疫吸附試驗(ELISA)。許多國家對綿羊布氏桿菌都各有其自已的標準診斷方法，但在國際貿易交易上補體結合試驗(CF)是唯一被OIE和歐洲聯盟(EU)所要求的試驗。但實際上膠內免疫擴散反應和補體結合試驗一樣，具有相同的敏感度，而且是非常簡便的試驗。酵素結合免疫吸附試驗雖然缺乏標準化，但許多實驗都證明，它比補體結合試驗和膠內免疫擴散反應具有更高的敏感度和特異性。到目前為止，還沒有一套國際標準化的試驗方法來鑑別綿羊布氏桿菌。
粗糙型的布氏桿菌細胞(rough Brucella cells)用生理鹽水熱萃時(稱為生理鹽水熱萃取法，HS)，它們會產生一種水溶性的抗原性萃取物，它們的主要成份會和粗糙布氏桿菌抗血清形成沈降物(9，15)。因此，這種生理鹽水熱萃取物稱為 "特異性粗抗原(rough-specific antigen)"，或是當來自綿羊布氏桿菌時，稱為 "綿羊布氏桿菌特異性抗原"。這種由綿羊布氏桿菌以生理鹽水熱萃取之物其化學特性富含粗脂多醣(rough lipopolysaccharide, R-LPS)、第三類的外細胞膜蛋白質和其它細胞外膜成份(16)。因此，由此生理鹽水熱萃取物裡含有綿羊布氏桿菌的特異性脂多醣抗原(LPS determinants)，但也含有其它抗原性的成份，其部分抗原會和粗糙型及平滑型地中海熱布氏桿菌，以及其它布氏桿菌產生共用抗原性(19)。所以生理鹽水熱萃取物和感染地中海熱布氏桿菌之羊血清或 Rev. 1 之羊血清，有時會產生交叉反應(16)。由於這生理鹽水熱萃取物是水溶性而且含有很多細胞表面抗原決定物(surface epitopes)，所以是很好之診斷用抗原，已被廣泛應用於綿羊布氏桿菌感染的診斷。
綿羊布氏桿菌REO 198是一種不需CO2的菌株，它被用來做為製造生理鹽水熱萃取抗原的來源。這菌株可以由法國的INRA取得。第A.1.b節所述的固體培養基可以做為它的生長培養基。生理鹽水熱萃取抗原的製備方法如下：
用下列方法用以快速培養一種合適、嗜氧的綿羊布氏桿菌菌株例如REO 198：在以下的培養基培養48小時；
在胰蛋白豆液體培養基玻璃瓶以37℃和150rpm旋轉保溫箱裡；或胰蛋白大豆瓊脂在Roux瓶裡，；或其它合適的培養基，均需加入5%的血清；用和布氏流產桿菌一樣的分批型發酵器(batch-type fermenter)並在培養基內加入5%的血清。
細胞洗過兩次之後，用0.85%生理鹽水重新製成懸浮液(12公克的乾細胞或30公克溼高密度細胞溶於150毫升)。
細胞懸浮液置於120℃的高壓滅菌鍋裡15 ~ 30分鐘。
冷卻之後懸浮液離心(15,000g，4℃，15分鐘)，上清液濾過後，在4℃下用蒸餾水(3 x 100體積)透析至少二天。
透析後的液體再超速離心(100,000g，4℃，6 ~ 8小時)，沉澱物用小量的蒸餾水重新配成懸浮液後冷凍乾燥。
這種生理鹽水熱萃取物再用蒸餾水(用於膠內免疫擴散試驗時)，或佛羅那緩衝液(用於補體結合試驗時)，或碳酸-重碳酸鹽緩衝液(用於酵素結合免疫吸附試驗時)，配成懸浮液，再和一組的陽性和陰性血清做滴定。
生理鹽水熱萃取懸浮液保存在4℃，用0.5%石炭酸做為保存劑(祗用於膠內免疫擴散試驗時)或將之冷凍乾燥。必須避免重覆的冷凍-溶解動作(9)。補體結合試驗之抗原必須用國際抗綿羊布氏桿菌標準血清加以標準化。
補體結合試驗(國際貿易所要求的試驗)
補體結合試驗沒有標準化的方法，但這方法如果用微滴定法(microtitration method)操作上可以非常方便。許多試驗顯示用冷結合會比用熱結合效果更好(6，17，20)，但缺點是特異性比較低。一般羊血清常有抗補體反應，故常使用冷結合。
有很多補體結合試驗方法是用不同濃度的新鮮羊紅血球(SRBC)(一般推薦使用2 ~ 3%的懸浮液)用在天竺鼠補體定量溶液下，能使羊紅血球產生100%溶血的數倍濃度(一般是2 到5倍)的等量先抗綿羊紅血球血清致敏化。補體是用獨立的滴定方法(視所用的方法，用抗原或不用抗原)來決定在單位量的標準致敏綿羊紅血球下，可以使羊紅血球產生50%或100%溶血所需要的補體量，而將它們分別定義為50%或100%補體溶血單位(C'H50或C'H100)。一般建議在每組試驗之前先對補體做滴定，最好用巨量滴定法(macromethod)來找出最合適的50%補體溶血單位(C'H50)。在這試驗時的一般使用範圍是1.25 ~ 2 C'H100或5 ~ 6C'H50。
補體結合試驗的標準稀釋液使用佛羅那綏衝生理鹽液(VBS)。它有商品化葯片型的包裝可供應用，否則它需要按照配方來製備(參考第3.2.1章牛布氏桿菌症)。被測試血清必須在60 ~ 63℃的水浴中使之不活化，然後再用VBS來稀釋(倍數稀釋法)。生理鹽水熱萃取抗原的用液(用VBS配備成2.5 ~ 20毫克/毫升)用VBS稀釋後，以前述方法來滴定(棋盤式滴定法)。通常祗有測試一血清稀釋倍數(一般為1/10)。
使用圓底的96-孔標準微滴定盤時，按以下方法來操作：
將25μl稀釋過的不活化被測血清置於第一和第二排的小孔內。除了第一排之外全部小孔加入25μl的補體測試緩衝液。然後從第二排開始以每次移動25μl血清的方式做二倍稀釋。
每一小孔分別加入25μl稀釋至操作濃度系列的抗原，稀釋至所需的單位 25μ1 的補體。
對照組裡的小孔祗含稀釋液。血清+補體+稀釋液，抗原+補體+稀釋液，補體+稀釋液，各組的總體積均是75μl。每次試驗，必須測試最低陽性反應的對照血清確定試驗的敏感度。
將這反應盤置於37℃的保溫箱30分鐘或在4℃時放置隔夜，然後再加入致敏化的羊紅血球(根據操作上的需要加入25μl或50μl)。再將這反應盤置於37℃的保溫箱30分鐘。
在4℃，1,000g 離心10分鐘後，或是在4℃下靜置2 ~ 3小時讓未溶血的紅血球沉澱下來後再判讀其結果。和標準比較其溶血的程度可分為0，25，50，75和100%溶血。本試驗的血清力價是小於50%溶血最高稀釋倍數。
補體結合試驗的標準化
歐洲聯盟(EU)使用之單位系統仍依據國際標準抗-綿羊布氏桿菌血清(ISABS，1985年國際標準)，它每毫升裡含有1,000補體結合國際單位(ICFTU) 。假如此種標準血清在某種試驗方法下，得到的力價例如是200時，可以用它為一個常數用以下公式來計算待測試血清的力價：1,000/200 x 測試血清的力價 = 每毫升待測試血清抗體的ICFTU數。它可以在一個國家內的不同實驗室做為補體結合試驗的統一方法，如此可以得到相同敏感性的力價。結果必須以國際單位來表示，用以計算滴定結果使必須以ISABS做校正標準血清。
結果的判讀：一般來說血清的力價大於50 ICFTU/毫升時則被歐盟(EU)視為陽性。
膠內免疫擴散試驗
膠內免疫擴散試驗使用下列的反應劑：高級Noble瓊脂或瓊脂醣、氯化鈉(NaCl)、硼酸鹽緩衝液：硼酸(12.4公克)、氯化鉀(14.5公克)和蒸餾水(1,600毫升)。用0.2 M的氫氧化鈉溶液調整pH成8.3，並用蒸餾水配成2,000毫升的溶液。
凝膠的製備是將1公克的瓊脂醣(或Noble瓊脂)、10公克的氯化鈉和100毫升的硼酸鹽緩衝液用煮沸的方法攪拌使其溶解。將乾淨的玻片放置於平坦的檯面，用適量溶化的凝膠(標準的微玻片約需3.5毫升)使其形成2.5毫米厚覆蓋在玻片上。在凝膠凝固之後(約15 ~ 20分鐘)用凝膠打洞器打出所需要的小孔。小孔直徑為3毫米，孔之間的距離為3毫米，以六角形圍繞在一直徑為3毫米的中央小孔。本試驗亦可以用玻璃皿或其它的形狀。
被測試血清對於間隔對照陽性血清(以細菌學來證明感染)小孔內，以經過適當稀釋的抗原置於中央的小孔。在室溫下置於潮溼的密盒內使其作用24 ~ 48小時之後判讀結果。如果被測試血清的沉澱線和陽性對照者全部或部分相同時，可以視為陽性。有時沉澱線會和對照不完全一致，此乃生理鹽水熱萃取物裡有少量相關的抗原性物質存在(對於抗原反應之抗體常出現於同時也感染地中海熱布氏桿菌之患者)，在此情形下也應視為陽性反應。
膠內免疫擴散試驗所使用的抗原(在4℃下可以保存一個月以上)是用含0.5%石炭酸保存劑，蒸餾水稀釋的生理鹽水熱萃取物(2.5 ~ 20毫克/毫升)。稀釋的抗原可以用20 ~ 30隻自然感染與沒有感染綿羊布氏桿菌的公羊血清，置於平板上做測試。最佳的抗原稀釋濃度是能使所有的感染綿羊布氏桿菌的血清都能產生清晰的沉澱線，並且對沒有感染動物的血清都不會產生任何的沉澱線。
酵素結合免疫吸附試驗
這試驗有許多不同的方法。這裡所述的方法是用ABTS(2,2'-連氮基-雙-[3-二塞唑-6-磺酸])做為色基質的間接酵素結合免疫吸附試驗。這試驗是在96-孔的平底酵素結合免疫吸附試驗盤裡進行的。用pH7.2含0.05% Tween 20(PBST)的PBS來稀釋反應劑和血清。用pH9.6的碳酸-重碳酸鹽緩衝液來稀釋抗原。試驗盤在包覆抗原之後，以及在兩次不同的培養之間，用PBST洗。抗原(生理鹽水熱萃取物)和標示抗體用棋盤式滴定法，並選擇在陰性和陽性標準血清之間最佳比例的稀釋。第二抗體(抗綿羊免疫球蛋白G[H+L鏈])一般使用辣根過氧化酉每(horseradish peroxidase)或用其它的酵素來標示。如果是用過氧化物酉每(peroxidase)來標示的話，它的色基質(通常是用ABTS)用pH4.0的基質緩衝液(含三鈉檸檬酸和檸檬酸)來稀釋。在加入基質及過氧化氫(H2O2)後，將試驗平盤放在室溫60分鐘。以1mM氮化鈉(sodium azide)使反應停止，於405 ~ 414 nm 之下判讀它顏色的變化。
酵素結合免疫吸附試驗所用的抗原是，於包覆用緩衝液的1毫克/毫升生理鹽水熱萃取物為原液，用棋盤式滴定的方法，並且以不同稀釋濃度之抗原、標示抗體和基質來對標準血清，或對一系例稀釋之感染與無感染綿羊布氏桿菌之不同稀釋濃度的血清來做滴定，以測出它最敏感的稀釋濃度(一般為5 ~ 10μg/毫升)。
˙ 試驗步驟
用100μl以pH9.6碳酸鹽緩衝液稀釋的抗原包覆在微盤的小孔上。在37℃下靜置二小時或在4℃下放置隔夜。然後洗四次，去除未附著的抗原後，再倒蓋在吸紙上除去多餘水份。這製備好的玻璃盤可以立刻使用或是貯存於4℃(可以貯存約一個月之久)。
血清：待測試血清以及陽性和陰性對照血清樣本最少各10μl加入2毫升的PBST裡使其稀釋成1/200。在微盤裡加入雙列的100μl樣本。將平盤蓋起來，置於37℃下一小時之後，用緩衝液洗三次。
標示物：滴定後的標示物用PBST稀釋，將它加入(100μl)小孔裡，然後在37℃之下放置一小時。最後再以PBST洗三次。
基質：加入含有ABTS溶液的基質緩衝溶液(100μl/小孔)，讓其在室溫並且搖動之下作用15 ~ 60分鐘。
結果的讀取和判定：用分光比色計(spectrophotometer)在405 ~ 414 nm 下自動讀取其吸光度。其吸光值可以以陽性對照的吸光度比例或轉換成酵素結合免疫吸附試驗單位(ELISA units) 來表示。酵素結合免疫吸附試驗單位(ELISA units)的計算可以用人工計算或是由一系列陽性對照的稀釋溶液所繪出的標準曲線圖用電腦的曲線填入程式(curve-fitting program)算出來。它的界量值必須用大量的無感染綿羊布氏桿菌羊群裡所得到的數據計算出來，而它的敏感度則需藉由感染綿羊布氏桿菌的動物來控制。
比較研究之下知道酵素結合免疫吸附試驗(ELISA)比膠內免疫擴散試驗(AGID)或補體結合試驗(CF)有較高的敏感度(14，17，21，25，26)。這些研究中發現，由於有ELISA-陰性和AGID-陽性血清之存在，所以用AGID和ELISA兩者互相配合的方法可以得到最好的效果(14)。事實上用CF和ELISA或是CF和AGID互相配合時，並無法較單用ELISA的敏感度高(14)。而且，補體結合試驗(CF)有很大的缺點，例如操作複雜、血清的強制性不活化、有些血清會有抗補體反應、和已溶血的血清很難使用及有前區的現象(prozone phenomena)等，所以在選擇使用補體結合試驗做為控制的標準試驗之前應該將這些因素考慮在內。由於膠內免疫擴散試驗(AGID)有很高的敏感度、操作簡單而且易於判讀，所以很適合用在那些沒有特殊設備的實驗室裡做為例行診斷之用途。
B. 疫苗和診斷用生物製劑之需要條件
　　在綿羊布氏桿菌有很高發生率的地域，疫苗是控制這疾病最經濟和最符合實際的方法。活的地中海熱布氏桿菌Rev. 1菌株(參考第3.3.2章山羊和綿羊布氏桿菌[不包括綿羊布氏桿菌感染])是最適合用來做為預防綿羊布氏桿菌感染的疫苗(2)。用單一標準劑量的Rev. 1菌株(109菌落形成單位)以皮下(1毫升劑量)或結膜(25 ~ 30μl)投與3 ~ 5個月大的公羊，已證實可以產生適當的免疫力預防綿羊布氏桿菌的感染。結膜接種疫苗可以減少動物的緊迫，而皮下接種產生免疫的時間較長，因此可以增加血清學試驗的特異性(2)。當使用在年輕動物時，Rev. 1 菌株疫苗的安全性很高並且副作用也很低，但至於使用於成年公羊，其安全性目前的所知有限。曾有一個實驗，用皮下或結膜的方式接種13個月大的公羊，發現它不會產生不良的副作用而且可以產生免疫的保護作用，但這結果祗得自於少數的動物(13)。我們需要以更大量的成公羊來研究它的可行性，因為在有些高發生率和管理不易的國家，同時對年輕和成年公羊做預防接種是一個很好的解決辦法。
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