来源：《现代实用医学》1995年第01期 作者：章巧月
丙型肝炎患者血请抗－HCV和HCVRNA的联合检测
丙型肝炎患者血请抗－ＨＣＶ和ＨＣＶＲＮＡ的联合检测章巧月本文应用ＥＬＩＳＡ法及聚合酶链反应（ＰＣＲ）对１９６例肝炎患者血清同时检测抗－ＨＣＶ与ＨＣＶＲＮＡ，现将结果报道如下。材料和方法一、１９６例各型肝炎为１９９４年３月至１１月我院住院和门诊患者，其中男７２例，女１２４例，平均年龄３５．２岁（７～７４岁），按１９９０年上海全国病毒性肝炎会议修订的诊断分型标准，计无症状ＨＢｓＡｇ携带者（ＡＳＣ）１５例，急性肝炎（ＡＨ）３６例，慢性迁延性肝炎（ＣＰＨ）５２例，慢性活动型肝炎（ＣＡＮ）４８例，肝炎后肝硬化（ＬＣ）４５例。二、血清抗－ＨＣＶ检测：由本院实验室采用上海科华公司试剂盒，用ＥＬＩＳＡ法检测。三、血清ＨＣＶＲＮＡ检测：由宁波市医学科学研究所采用无锡益众应用生物化学公司试剂盒，用ＰＣＲ法检测。结果ＥＬＩＳＡ和ＰＣＲ法同时检测肝炎患者血清抗－ＨＣＶ及ＨＣＶＲＮＡ的结果见附表。附表各型肝炎患者血清抗－ＨＣＶ及ＨＣＶＲＮＡ的检测结果讨论本文应用ＥＬＩＳＡ和ＰＣＲ法对１９６例肝炎患者血清同时检测抗－ＨＣＶ及ＨＣＶＲＮＡ。用ＥＬＩＳＡ法检测，抗－ＨＣＶ的阳性率为１１．......(本文共计1页)
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现代实用医学
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出版地：浙江省宁波市24小时报名咨询电话：010- / 400 650 1888
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血液透析患者HCV感染筛查指标的比较
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　　【摘要】 　　目的 探讨不同检测方法在血液透析人群HCV感染筛查中的应用价值。 　　方法 应用HCV Ag（HCVAg）/抗-HCV联合检测、抗-HCV、HCV Ag和HCV RNA检测等4种方法，对230例进行血液透析维持治疗的慢性肾功能衰竭患者进行HCV感染筛查，比较各种方法HCV感染的阳性率。 　　结果 230例血液透析患者HCV Ag（HCVAg）/抗-HCV阳性37例（16.1%），抗-HCV阳性28例（12.2%），HCV Ag阳性10例（4.3%），HCV RNA阳性18例（7.8%）。HCV Ag（HCVAg）/抗-HCV联合检测HCV感染检出率高于抗-HCV（16.1% vs. 12.2%，X2=1.451，P=0.228）；HCV Ag（HCVAg）/抗-HCV检出率（16.1%）高于HCV Ag（4.3%）和HCV RNA（7.8%），检出率差异均有统计学意义（X2=17.276，P=0.000；X2=7.455，P=0.006）。所有抗-HCV阳性标本（S/CO：10.16～167.41）应用HCV Ag（HCVAg）/抗-HCV联合检测均可检出；10例HCV Ag阳性患者用HCV Ag（HCVAg）/抗-HCV联合检测可检出9例医.学教育网搜集整理。 　　结论 与抗-HCV，HCV Ag，HCV RNA检测方法相比，HCV Ag（HCVAg）/抗-HCV联合检测可提高血液透析人群HCV感染的检出率。
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自1989年以来，HCV感染已成为全世界关注的问题。据WHO报道，全球有1.7亿感染者，流行率约为3%t2-4j。HCV感染后病情隐匿，50%～80%会转变成慢性肝炎，如不进行合理治疗，10～20年后有10%～30%会发展成为肝硬化，l%～5%甚至会发展为肝癌,严重危害患者的健康和生命。
HCV是一类球形的单股正链RNA病毒，基因组序列具有高度变异性。根据不同区域的基因序列变异情况，HCV分为6个基因型和8O多种基因亚型。近年来的研究表明，HCV的基因型与丙型肝炎的治疗方案及治疗周期关系密切。本文根据近年来对HCV基因分型的检测研究，从以下几个方面探讨HCV基因分型的研究进展及意义。
1 HCV基因分型区域
最准确的HCV基因分型方法是对基因组的某个区片段进行PCR扩增测序及构建进化树分析。目前，国际上常用于基因分型的有下列3个区域。
1.1 5&一非编码区(untranslated region，UTR)
该区包含HCV基因组5&端的341个核苷酸，是HCV基因组中最保守的区域，临床上对HCV的核酸诊断及病毒载量的检测试剂根据这段基因序列保守而易于扩增的特性研制而成。目前，为了评价抗病毒治疗效果及药物剂量方案的选择，以5l_UTR为基础建立的基因分型方法在很大程度上已被接，但是把该区域作为整个HCV基因分型或者区分不同亚型的手段还存在下列问题：①
针对不同基因分型的准确率有较大差异，Half0n等[91研究提示针对该区分型的总准确率仅有76%，虽然对2和3型的分型准确率高，但几乎不能对一些6型的样本进行区分，而将其错分为1a或1b，主要由于它们之间基因序列差别太小[1Ol;②
同一型别的不同亚型的分型准确率有较大差异;③ 不能检测到基因重组或混合感染的现象。
1.2 包膜E1区(core&envelope 1 region。C&E1) 核心区c&E1核苷酸的位点为342～1490
nt。该区是HCV基因组的高度变异区，存在许多有意义的位点，为了对HCV结构区基因变异进行总体研究，很多学者都会把Core和E1这2个区作为研究的首选区域。??????????
1.3 非结构蛋白5B区(non&structural Drotein 5Bregion，NS5B) NS5B位于病毒基因组的
nt，可编码NS5B非结构蛋白，具有RNA依赖性RNA多聚酶活性。该区有2个重要的位点：活性位点，是抗HCV药物研究的重要靶位;识别位点，能够识别具有人类白细胞抗原限制的杀伤性淋巴细胞，使HCV逃避宿主淋巴细胞的攻击。HCVNS5B的基因序列变异情况也具有代表性，序列的差异度为16.5%～20.1%时，可以较好地反映HCV全基因组的变异情况。
从生物信息学的角度比较HCV
5个区域(5&一UTR、C0re、E1、E2和NS5B)的基因分型结果及演化距离，确定最能反映HCV演化关系的是NS5B.
2 HCV基因分型检测方法
目前常用的HCV基因分型方法有如下7种Il7。①
测序法：通过PCR扩增有代表性的基因片段(如5&UTR、C&E1和NS5B)，再进行核苷酸序列测定，此为HCV基因分型的&金标准&。②型特异性引物扩增：根据不同HCV基因型在某一区段(主要是保守区)序列的差异，设计一系列型特异性引物，不同HCV基因型可扩增出长度大小不同的片段，并以此分型。③
型特异性探针杂交法：通过将生物素或荧光素标记型特异性探针固相化在膜或芯片上，与实时定量(real&time。RT)一PCR扩增的病毒产物进行杂交后，经扫描判读出HCV基因型。用于该分型方法的区段是5&一UTR及Core区。④基因芯片法：将许多特定的寡核苷酸片断作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一个探针上的荧光信号进行分析比较，从而迅速得出需要的信息。⑤
限制性片段长度多态性法：利用限制性酶识别RT&PCR扩增的特定区域(5'-UTR、C&E1和NS5B)的型特异的切割位点，将其分解为长短不同的若干片段以确定分型，该方法常用酶为Hoe
m、RsaI、MvaI、H n厂I及Sc
I，利用这些酶可分开6个基因型。⑥遗传发育关系进化树：遗传发育关系分析法是在核苷酸序列分析的基础上建立的，对一定区域内的样本测序结束后，可将序列相互比较，分析样本间序列的进化距离，画出该区域内HCV流行的关系进化树，观察HCV在区域内的分子流行情况及特点;也可将样本序列与全球已发表的该区段序列比较，分析与其他序列的差异。⑦其他：特异性引物错配延伸法、荧光共振能量转移探针的解离曲线分析法和异源分子迁移率法。
2.1 IL28B宿主基因型 研究发现IL28B的单核苷酸多态 (single&nucleotide
polymorphism.SNP)与抗HCV疗效密切相关，IL28B的基因型有助于临床疗效预测，确定慢性丙型肝炎(chronic hepatitis
C，CHC)患者的个性化治疗方案。
多个研究小组通过全基因组关联性研究方法对影响CHC患者抗HCV疗效的SNP位点进行筛查，在IL28B基因上发现多个与持续病毒学应答(sustained
virological response.SVR)相关的SNP位点，其中关联性最强的2个SNP位点分别是位于IL28B基因上游3
kh处的rs8099917。对于rs多态性位点而言，CC型为保护基因型，CT和TT为非保护基因型;对于rs8099917多态性位点而言，
rr为保护基因型，GT和GG为非保护基因型，且rs和rs个位点的多态性存在连锁不平衡。近年来，越来越多的研究进一步证实IL28B的SNP与抗HCV疗效密切相关。
针对不同种族来源的2371例非HCV感染者的研究对rs位点多态性进行了检测，发现IL28B的SNP在不同种族人群中的分布差异显着，保护基因型CC的分布频率由高到低分别为：东亚人、欧洲人、美洲人和非洲人
。研究提示亚洲人群中rs基因CC型比例较高，可达90%，可能是亚洲人群相对其他种族抗HCV疗效更好的原因。
对于感染HCV基因l型或4型的患者而言，如果其rs多态性位点为非保护基因型(CT或TT型)，获得SVR者仅为20%～30%;如为保护基因型(CC型)，约80%的患者可获得SVR。但当患者感染的HCV基因型为2型和3型时，不同rs的基因型对CHC患者获得SVR的预测作用并不显着。在我国，虽然感染的HCV基因型主要为应答较差的lb型，然而由于我国汉族人群IL28B基因主要为应答较好的CC型，因此积极进行干扰素联合利巴韦林(RBV)治疗可获得较好的疗效。
与单独感染HCV者相比，HCV合并HIV感染者病情的进展更为迅速，尤其是CD4+T淋巴细胞计数低及免疫功能受损的患者。HCV合并HIV感染者IL28B的SNP是否也与抗病毒疗效相关，值得进一步关注。相关研究证实，rs和rs8099917位点的多态性与合并HIV感染的抗HCV治疗效果密切相关，具有保护基因型的患者可获得更好的抗HCV疗效，而IL28B基因型对抗HIV疗效无影响。
IL28B的SNP是基线预测CHC抗病毒疗效的主要因素之一。分析CHC患者IL28B的SNP并对患者进行疗效预测，对于指导临床治疗十分重要。美国已有商品化的可检测IL28B基因型的试剂盒，我国也有类似的商品化试剂盒，已申请专利，但价格昂贵。
2.2 国内外常用的商品化的分型试剂
2.2.1 INNO&LiPA HCV Ⅱ
由Innogenetics公司(比利时)开发的利用反向线性杂交方法进行HCV分型检测的试剂盒，扩增5。UTR，能检测HCV
1-6共6种不同的基因型及la.1b、2a/c、2b、3a&c、4a&h、5a和6a等亚型，已通过欧洲统一(Conformit6
Euro&p6ene.CE)认证。
2.2.2 Versant HCV Genotype Assay(LiPA)2.0
由德国Bayer公司联合Innogenetics公司推出的新版HCV基因分型试剂，已通过CE认证。原理同样是线性探针杂交，但对l型与6型以及la与lb的区分更准确，因为除5'-UTR外，还增加了c区序列信息。
2.2.3 Abbott HCV ASR
为美国Abbott公司产品，靶区域为5'-UTR和NS5B，采用多色三管RT&PCR技术，可检测HCV主要基因型1-6，还可以区分1a和1b型。
2.2.4 Trugene 5&NC Genotyping Kit
Bayer公司产品，是已商品化的HCV测序试剂，有专门的测序系统及分析软件，检测区域为5'-UTR，区分主要基因型，与使用反向杂交线型探针检测技术有较好的一致性，但不能准确检测亚型。
3 HCV基因型与临床的关系
当前推荐的CHC治疗标准方案是聚乙二醇干扰素(pegylated interferon.Peg&IFN)仅联合RBV，治疗终点是获得SVR
(治疗结束24周后血清中检测不到HCV
RNA)，最终目标为改善肝组织学。该方案一方面能减缓纤维化的进展及肝硬化的产生;另一方面有望防止肝衰竭和肝癌的发生。近年来，越来越多的研究结果提示应重视个体化治疗，包括根据患者基线特征及治疗过程中的病毒学应答情况制定相应治疗方案。HCV基因型是最重要的基线指标，不同基因型患者的病毒学应答率差距明显，如2、3及6型患者较易获得SVR，而1和4型应答较差，属于&难治性丙型肝炎&。
近年来，针对HCV蛋白酶或聚合酶的小分子抑制剂的HCV特异性靶向抗病毒治疗(specificallytargeted antiviral therapy
HCV.STAT&C)可有效提高基因1型感染者的SVR，Peg-IFN仅、RBV联合NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂telaprevir或boceprevir经过Ⅲ期临床试验阶段，现已推向市场。1型分为1a和1b等亚型，各亚型核酸序列有差别，编码蛋白在结构和功能上也存在差异，对STAT&C的病毒学应答和耐药谱也有很大不同。因此，应在抗病毒治疗前确定病毒基因型，甚至亚型及宿主基因型，以制定个体化治疗方案，使患者在最大可能获得SVR的同时，避免因过度治疗而承受不必要的药物不良反应和经济负担。2011年针对我国汉族CHC病毒基因型和宿主基因型的横断面研究纳入了997例初治患者，结果显示最主要的HCV基因型为1型，占58.4%(其中lb亚型占所有基因型的56.8%)，表明在我国&难治性丙型肝炎&占主导;2型次之(24.1%)，之后为3型(9.1%)、6型(6.3%)和混合感染(2.1%)，未发现4型和5型
。1型和2型在全国范围广泛分布，3型和6型主要见于南方和西南(如云南、广西壮族自治区、广东、福建等)，2种型加起来可占到这些地区基因型的40%左右。我们实验室正在进行的针对云南省各州的HCV分型检测也得到了类似的结果：1b型居多，3型和6型次之。
综上所述，HCV基因分型虽然已经有了一定的基础研究，但还有一些局限。随着HCV基因型分布发生着变化，病毒与宿主之间的关系也在改变，加之经静脉注射患者的增多、医源性感染几率的增大、基因突变的多样性、宿主基因型的检测、干扰素治疗前的预测以及治疗中和治疗后的评估等，都对基因分型的研究提出了新的要求。这须要我们在基因分型变异及宿主基因型检测方面进一步研究，为HCV的分子流行病学研究、病情预测及个体化治疗提供指导，并结合我国的HCV高感染率，研发快速、简便、高自动化、低成本的HCV基因分型检测试剂和宿主基因型检测试剂，提高我国丙型肝炎的防治力度。
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