腺相关及腺病毒内耳基因转染和Rb敲除结合ISL1表达诱导小鼠的毛细胞与支持细胞增..
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腺相关及腺病毒内耳基因转染和Rb敲除结合ISL1表达诱导小鼠的毛细胞与支持细胞增殖
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3秒自动关闭窗口临床耳鼻咽喉科杂志980704
LINCHUANG　ER-BL-YANHOUKE 　ZAZHL
喉癌组织基膜和树突状细胞的检测
胡孙宏1　费青云2　文三立3　李德坚3
　　摘要　为探讨喉癌组织基膜和树突状细胞(DC)的临床意义，采用免疫组织化学方法以抗层粘连蛋白、抗Ⅳ胶原、抗S-100蛋白抗体，标记68例喉癌患者癌组织与21例非喉癌组织基膜和DC。结果表明：68例喉癌者基膜呈非连续线状为39例(57.3%)，21例非喉癌者呈连续线状为18例(85.7%)；喉癌者中DC检出率为63.2%(43/68)，非喉癌者中很少见到DC(2/21)。基膜的连续性、DC的检出率与病理分级、临床分期有明显相关性(P＜0.05)，病理分级越低，临床分期越高，基膜断裂者越多，DC检出率越低。基膜完整的喉癌患者术后5年生存率明显高于基膜断裂者，DC阳性的喉癌患者术后5年生存率也明显高于阴性者；基膜完整且DC阳性的喉癌患者术后5年生存率最高。表明基膜和DC的检测对判断喉癌患者的预后有一定参考价值。
　　关键词　喉肿瘤　组织基膜　树突状细胞　免疫组织化学染色技术
The detection of
basement membrane and dendritic
cells in laryngeal carcinoma
Hu Sunhong*　Fei Qingyun　Wen Sanli　et al
(*Department
of Otolaryngology,Sir Run Run Show Hospital,Zhejiang
Medical University,Hangzhou 310016)
　　Abstract　The state of basement membrane(BM) and dendritic cells(DC) were
observed by immunohistochemical methods with the use of anti-laminin antibody,anti-type Ⅳcollagen antibody,anti-S-100 protein antibody in 68 cases of
laryngeal carcinoma and 21 cases of non-cancer laryngeal tissues.The results showed that
among 68 patients with laryngeal carcinoma 39 cases had discontinuous BM.A
continuous,linear BM was found mostly in normal larynx,atypia hyperplasia and
papilloma,only 3 cases had discontinuous BM.43 positive DC were detected in 68 cases of
laryngeal carcinoma,There were rarely positive DC in non-cancer laryngeal tissues.The
poorer the differentiation of carcinoma,the more the discontinous BM and the lesser the
number of DC.The discontinous BM and DC(-) were seen more in advanced stages of
carcinoma.The five-year survival rate in patients with continuous BM was significantly
higher than that in patients with discontinuous BM,the five-year survival rate in patients
with DC positive was also higher than that in patients with DCthe survival rate
was highest in patients with continuous BM and DC positive.Our results indicated that the
detection of the state of BM and dendritic cells were of value to the prognostic analysis
in patients with laryngeal carcinoma.
　　Key words　Laryngeal neoplasms　Basement
membrane　Dendritic cell　Immunologic technics　
　　基膜是分布广泛的细胞外基质成分，含有层粘连蛋白、纤维蛋白等多种成分，构成了机体细胞与组织间的屏障。细胞发生恶变时，由于基膜在结构、分布和数量上都发生变化〔1〕，有利于肿瘤的浸润和转移。树突状细胞(Dendritic
Cell,DC)能合成和分泌S-100蛋白，也称S-100蛋白阳性细胞〔2〕。在机体抗肿瘤免疫中，DC的浸润被认为是机体抗肿瘤免疫反应的标志之一。新近，我们随机抽取年间术前未行放疗或化疗的68例原发性喉癌石蜡标本，进行免疫组织化学检测，借以探讨喉癌组织基膜的改变,DC的标记阳性与喉癌生物学行为的关系。
1　材料和方法
1.1　材料选择
　　68例患者中，年龄38～68岁，平均57岁。病理分级为：Ⅰ级25例，Ⅱ级29例，Ⅲ-Ⅳ级14例，均经病理学检查核实，且均有完整的随访资料。其中术后1个月内死亡及死于其他疾病者不用估计预后。另外，取2例尸体声带标本、10例喉不典型增生组织和9例喉乳头状瘤标本作为对照。
1.2　检测方法
　　将喉癌蜡块和对照用的组织标本作连续切片，片厚约5 μm。均切4张，1张作HE染色，3张行免疫组织化学染色。
　　免疫组织化学染色(ABC法)步骤是：石蜡切片以二甲苯常规脱蜡，与阴性对照组织一起，乙醇脱水，置冰箱过夜；0.2%胃蛋白酶和0.1
mol HCl消化30 min；磷酸缓冲液(PBS，pH7.4)漂洗5 min×3；0.3%H2O2甲醛阻断内源性过氧化物酶，室温30
min；PBS漂洗5 min×3；正常血清封闭非特异性位点，37℃，30 min；分别加抗LN抗体，抗COIV抗体，抗S-100蛋白抗体，于湿盒中，4℃冰箱过夜(阴性对照用PBS代替Ⅰ抗)；置室温2
h后PBS漂洗5 min×3；加生物素化羊抗兔或鼠IgG(37℃)1 h；PBS漂洗5 min×3；加ABC试剂，37℃，1
h；PBS漂洗5 min×3；DAB显色，室温5～10 min；流水冲洗10 min，乙醇脱水，二甲苯透明；中性树胶封片。
　　各组数据之间采用χ2检验，生存率用寿命表法计算，生存率曲线采用Kaplan-Meier法描绘，生存率的比较采用对数秩检验(long-rank
　　实验结果显示，层粘连蛋白和Ⅳ型胶原染色基本一致，视为基膜染色。用于对照的组织上皮和基质间有一层连续、均匀、完整的线状基膜(图1)，21例中仅见2例为非连续线状基膜。喉癌组织中癌巢旁基膜常呈断续、线条状或碎片状，甚至完全缺如，在分化差的喉癌中表现尤为明显(图2)，分化好的癌巢旁，基膜常呈不均匀连续状。正常及良性病变喉组织中仅见少量DC散在分布于间质中，很少出现DC阳性。68例喉癌组织中有43例为DC阳性，DC均被染成深棕色，胞浆成树突状，有分支，有的伸入癌细胞间，在整个喉癌组织中DC分布不均匀，有的呈DC阴性，尤在低分化癌中明显，DC主要散在分布于癌巢及巢旁的结缔组织中，多位于癌巢周边，而中央区域少(图3)。喉癌基膜状态与喉癌的病理分级和临床分期关系见表1。DC检出情况与喉癌的病理分级和临床分期的关系见表2。
表1　基膜状态与喉癌病理分级和临床分期的关系　例数
非连续线状
　　Ⅲ～Ⅳ
　　Ⅲ～Ⅳ
　　组内比较，P＜0.05　　从表1，2可见：喉癌病理分化程度越差，其基膜越易缺失，DC检出率越低；临床分期越高，其基膜也越易缺失，DC检出率也越低。
　　表2　DC检出情况与喉癌病理分级和临床分期的关系　例数
　　Ⅲ～Ⅳ
　　Ⅲ～Ⅳ
　　组内比较，P＜0.05　　本组68例的随访资料按寿命表法推算，术后5年生存率为51.9%。基膜呈连续线状者术后5年生存率为76.2%，明显高于基膜呈非连续线状者(46.5%)；DC呈阳性的喉癌术后5年生存率为68.7%，也明显高于DC阴性者(39.3%)。
　　本研究还发现，基膜状态与DC分布间有相关性(表3)。从表3可见，基膜呈连续线状的喉组织中，DC阳性率显著高于非连续线状基膜者。将68例喉癌的检测情况分为3种，分别以Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ示之：Ⅰ：基膜呈连续线状，DC(+)。Ⅱ：基膜呈连续线状，DC(-)；或基膜呈非连续线状，DC(+)。Ⅲ：基膜呈非连续线状，DC(-)。分别观察它们与喉癌术后生存率的关系，生存率曲线显示：Ⅰ组的生存率最高，预后最佳；Ⅲ组的生存率最低，预后最差；Ⅱ介于Ⅰ、Ⅲ两者之间。经统计三者间差异均有显著性意义。
表3　基膜状态与DC检出情况之间的关系　例数
非连续线状
　　P＜0.053　讨论
　　本文资料显示，非癌变组织基膜具有完整性，喉癌基膜有不同程度的破坏，与Cam等〔3〕观察结果相一致。Barsky等〔1〕在乳腺的良恶性病变中也发现，良性病变有一层完整的基膜轮廓，而浸润性癌则无，这种现象也见于膀胱癌、宫颈癌、胃癌和直肠腺癌等〔4〕。这些结果提示，基膜是限制肿瘤浸润转移的一道屏障，其完整性的破坏和成分的丧失，很可能是恶性肿瘤的特征之一，是肿瘤容易发生浸润的一个因素。
　　具有完整基膜的肿瘤显示更小的浸润性，其原因可能是基膜的存在，具有限制肿瘤细胞脱离原发组织进入邻近组织的能力。Terranova等〔5〕在体外用Ⅳ型胶原和层粘连蛋白制成人工间质，发现它可以阻止正常组织和良性肿瘤细胞的穿透，但不能阻止恶性细胞的穿透。说明恶性肿瘤细胞具有破坏基膜，使肿瘤发生浸润和转移的作用。目前，有关肿瘤破坏基膜的机制尚不明确，但多数学者认为是多种因素所致。其中意见较为一致的是由于基膜降解酶分解基膜成分而破坏其完整性。本研究也表明，该酶在基膜破坏中是一个关键性的因素。
　　在免疫组织化学上，S-100蛋白是DC的一种有价值的标志〔2〕。早在1980年Schenk等在电镜下就发现喉鳞状细胞癌组织中DC的浸润现象。本文资料表明，喉癌组织中DC(+)的患者，术后5年生存率明显高于DC(-)的患者，与许多学者在胃癌、结肠腺癌〔6〕、肺癌、口腔癌等中所观察到的，DC数量多者术后生存期明显长于DC数量少者相一致。这些都表明DC具有抑制肿瘤生长和复发，参与机体抗肿瘤免疫的能力，可反映机体的免疫力，作为估计肿瘤预后的指标。DC的作用机理可能是，它先移行于肿瘤细胞之间，通过DC的树突与肿瘤细胞密切接触，获得肿瘤抗原后，移行到局部淋巴结，将肿瘤抗原呈递给T细胞，使T细胞增殖，激活抗原特异性T细胞，发挥T细胞的细胞毒作用而杀伤破坏肿瘤细胞，形成有效的免疫监视。
图1　正常喉组织上皮与基质间基膜　呈完整均匀连续线壮
图2　低分化喉癌　癌巢周围基膜缺失
图3　高分化喉癌　癌巢旁可见大量DC浸润
1　Barsky SH,Siegal GP,Jannotta F,et al.Loss
of basement membrane by invasion tumors but not by their benign counterparts.Lab
2　Takahashi K.Immunohischemical and immunoelectron
microscope localization of S-100 protein in the interdigitating reticulum cell of the
human lymph node.Virchows Arch (Cell Pathol),
3　Cam Y,Caulet T,Bellon G,et al.Immunohischemical
localization of macromolecules of the basement membrane and the peritumoral stroma in
human laryngeal carcinoma.J Pathol,
4　Forster SJ,Talbot IC,Clayton PG,et al.Tumor
basement membrane laminin in adenocarcinoma of rectum:An immunohischemical study of
biological and clinical significant.Int J Cancer,
5　Terranova VP,Hujanen ES,Loeb QM,et al.Use of a
reconstituted basement membrane to measure cell invasiveness and select for highly
invasive tumor cells.Proc Natl Acad Sci Vas,
6　Ambe K,Mori M,Enjoji M.S-100 protein-positive
dendritic cells in colorectum adenocarcinomas.Cancer,
1　杭州　浙江医科大学附属邵逸夫医院耳鼻咽喉科(310016)
2　浙江湖州第二人民医院耳鼻咽喉科
3　江西医学院第一附属医院耳鼻咽喉科
(收稿 　修回)
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低剂量顺铂对小鼠耳蜗内毛细胞形态及otoferlin蛋白的影响
作者：杨艳辉 整理
来源：医学论坛网
此文章来源于
　　近日，第三军医大学附属西南医院耳鼻咽喉-头颈外科研究人员发表论文，旨在建立稳定有效的低剂量损伤听觉模型，探讨顺铂造成听功能损伤的机制。研究指出，低剂量顺铂可造成听功能损伤，其损伤机制很可能与的损伤及otoferlin蛋白有关。该文发表在2014年第11期《临床耳鼻咽喉头颈外科杂志》上。
　　将C57小鼠随机分为7组，分别为正常组，不同剂量、不同时间损伤实验组，每组8只。通过小鼠（ABR）阈值测量、AgNO3毛细胞形态染色、免疫荧光法、RT-PCR测定基膜底回内毛细胞otoferlin蛋白的表达等方式检测顺铂对耳蜗内毛细胞形态及otoferlin蛋白的影响。
　　在同一时间点，用药4d后，1.5mg/kg和3.0mg/kg实验组较正常组小鼠ABR阈值明显升高，用药7d的各实验组ABR阈值较正常组均明显升高。同一剂量下，0.75mg/kg&7d组较0.75mg/kg&4d组阈值明显增高，其余剂量无明显时间差异。实验组中3.0mg/kg实验组蛋白表达均降低，1.5mg/kg实验组与正常组无差异。3.0mg/kg&7d组内毛细胞形态改变最明显，但在各组均未缺失。
　　相关链接：
,顺铂,,内毛细胞,,听性脑干反应,
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